第二十章 全身用藥的毒性研究

藥物毒理學(xué)第二十章

全身用藥的毒性研究第一節(jié)急性毒性試驗(yàn)

第二十章

全身用藥的毒性研究一、概念和目的急性毒性試驗(yàn)：是指機(jī)體(實(shí)驗(yàn)動物)一日內(nèi)一次或多次接觸藥物產(chǎn)生毒性反應(yīng)，甚至引起死亡。常用急性毒性評價參數(shù)絕對致死劑量或濃度（LDl00，LCl00）：指試驗(yàn)中引起一群實(shí)驗(yàn)動物全部死亡的最低劑量和濃度。半數(shù)致死劑量或濃度(LD50，LC50)指藥物能引起一群實(shí)驗(yàn)動物50％死亡所需的劑量或濃度。近似致死劑量或濃度(ALD，ALC)：指試驗(yàn)中引起一群實(shí)驗(yàn)動物死亡的大致劑量或濃度范圍。最小致死劑量或濃度(MLD，MLC)：指試驗(yàn)中引起一群實(shí)驗(yàn)動物中僅個別動物死亡的劑量或濃度。最大耐受劑量(MTD，LC0)：指實(shí)驗(yàn)中動物不引起死亡的最大劑量或濃度。闕劑量或濃度：指試驗(yàn)中動物對某項(xiàng)敏感指標(biāo)出現(xiàn)毒效應(yīng)的最低劑量或濃度，而且在該劑量下任何劑量不應(yīng)再出現(xiàn)毒效應(yīng)，也稱最小毒性劑量或濃度。最大無作用劑量(ED0，EC0)：指實(shí)驗(yàn)中用現(xiàn)代的檢測方法和靈敏觀察指標(biāo)，不能檢測出任何損害作用的最高劑量或濃度?；緹o害劑量(LD5)基本有效劑量(ED95)主要目的為：1．了解新藥急性毒性的強(qiáng)弱以半數(shù)致死量LD50為例，化合物的LD50越小毒性越強(qiáng)。治療指數(shù)：是指LD50與半數(shù)有效量ED50間的比值。新藥研究早期主要用治療指數(shù)來衡量候選化合物的安全性，治療指數(shù)至少大于10，才具有進(jìn)一步作其他新藥臨床前研究的價值。安全系數(shù)：是指基本無害劑量LD5與基本有效劑量ED95之間的比值，比值越大越安全。

2．為長期毒性和特殊毒性試驗(yàn)的劑量設(shè)置提供依據(jù)

3．獲取新藥毒性反應(yīng)信息

4．新藥研制過程中，工藝路線尚未定型時，對產(chǎn)品除了理化性質(zhì)分析外，還可通過LD50值的比較，觀察生物效應(yīng)的顯著差異，以明確試驗(yàn)產(chǎn)品的質(zhì)量。此外，研究復(fù)方制劑新藥時，還應(yīng)判斷配伍后與單藥應(yīng)用的毒性大小的差別。二、基本內(nèi)容急性毒性試驗(yàn)的設(shè)計(jì)，應(yīng)根據(jù)化合物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、理化性質(zhì)、適應(yīng)證特點(diǎn)和試驗(yàn)?zāi)康牡冗x擇合理的試驗(yàn)方法，設(shè)計(jì)適宜的試驗(yàn)方案，并結(jié)合其他藥理毒理研究信息對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行全面的評價。急性毒性試驗(yàn)應(yīng)符合一般動物試驗(yàn)的基本原則，即隨機(jī)、對照和重復(fù)。(一)實(shí)驗(yàn)動物的選擇目前藥物的急性毒性試驗(yàn)應(yīng)采用至少兩種哺乳動物。一般應(yīng)選用一種嚙齒類動物加一種非嚙齒類動物進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)。若未采用非嚙齒類動物進(jìn)行，則應(yīng)闡明其合理性。小鼠體重18-22g，大鼠體重160-180g犬的年齡一般為4—6月齡，猴的年齡一般為2—3歲動物體重每組的差別要求不超過±10％。通常采用兩種性別的動物進(jìn)行試驗(yàn)，雌雄各半。若采用單性別動物進(jìn)行試驗(yàn)，則應(yīng)闡明其合理性。通常采用健康成年動物進(jìn)行試驗(yàn)。如果受試物擬用于兒童或可能用于兒童，建議必要時采用幼年動物進(jìn)行試驗(yàn)。(二)劑量與分組

LD50測定方法：通過預(yù)試找出0及100％接近致死劑量正式試驗(yàn)，小鼠一般分4—6個劑量組，各劑量組距一般為0．65-0．85等比級數(shù)為宜，每組10只。對于非嚙齒類動物給予出現(xiàn)明顯毒性的劑量即可，給藥劑量沒有必要達(dá)到致死水平。給藥劑量應(yīng)從未見毒性劑量到出現(xiàn)嚴(yán)重毒性(危及生命的)劑量，同時設(shè)空白和(或)溶媒(輔料)對照組。(三)給藥途徑和給藥容積兩種以上給藥途徑，其中一種必須推薦臨床用藥的途徑。對溶于水的藥物必須測定靜脈注射的LD50除非實(shí)驗(yàn)動物上無法進(jìn)行時，則作特殊說明?？捎脛e的給藥途徑。給藥容積，各組動物一般用不同濃度同體積給藥。常規(guī)給藥體積小鼠為0．2-0．4ml／10g，大鼠1-2ml／100g，特殊情況另作說明。(四)觀察紀(jì)錄及結(jié)果處理給藥當(dāng)天，尤其是給藥4小時內(nèi)應(yīng)認(rèn)真觀察，并記錄，然后連續(xù)觀察7-14天，詳細(xì)記錄動物毒性反映情況和死亡情況，中毒癥狀，中毒發(fā)生時間，持續(xù)時間及恢復(fù)時間，動物發(fā)生死亡過程、死亡時間和各組死亡分布情況。對中毒表現(xiàn)觀察記錄的內(nèi)容包括皮膚、黏膜、毛色、眼睛、呼吸、循環(huán)、自主活動及中樞神經(jīng)系統(tǒng)行為表現(xiàn)等。

對所有的試驗(yàn)動物均應(yīng)進(jìn)行大體解剖，包括試驗(yàn)過程中因?yàn)l死而處死的動物、死亡的動物以及試驗(yàn)結(jié)束時仍存活的動物。任何組織器官出現(xiàn)體積、顏色、質(zhì)地等改變時，均應(yīng)記錄并進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。三、最大給藥量測定法當(dāng)藥物用最大允許濃度和最大允許容量給予動物時，仍未測出LD50，可只求MTD值。即用最大濃度和最大允許容量一次或一日2—3次給20只動物(雌雄各半)后，連續(xù)觀察7-14天，未見任何動物死亡，即為最大給藥量。四、近似致死劑量法該方法主要用于非嚙齒類的動物試驗(yàn)。試驗(yàn)方法如下：一般采用6只健康的Beagle犬或猴。犬的年齡一般為4—6月齡，猴的年齡一般為2—3歲，選用其他動物時應(yīng)說明理由。根據(jù)小動物的毒性試驗(yàn)結(jié)果、受試物的化學(xué)結(jié)構(gòu)和其他有關(guān)資料，估計(jì)可能引起毒性和死亡的劑量范圍。按50％遞增法，設(shè)計(jì)出含數(shù)個劑量的劑量序列表。根據(jù)估計(jì)，由劑量序列表中找出可能的致死劑量范圍，在此范圍內(nèi)，每間隔一個劑量給一只動物，測出最低致死劑量和最高非致死劑量，然后用二者之間的劑量給一只動物。如果該劑量下動物未發(fā)生死亡，則該劑量與最低致死劑量之間的范圍為近似致死劑量范圍；如果該劑量下動物死亡，則該劑量與最高非致死劑量間的范圍為近似致死劑量范圍。五、固定劑量法固定劑量法：是不以死亡作為觀察終點(diǎn)，而是以明顯的毒性體征作為終點(diǎn)進(jìn)行評價的方法。試驗(yàn)選擇5、50、500和2000mg／kg四個固定劑量進(jìn)行試驗(yàn)，特殊情況下可增加5000ms／kg劑量實(shí)驗(yàn)動物首選大鼠，給藥前禁食6—12小時，給受試物后再禁食3-4小時。采用一次給藥的方式進(jìn)行如無資料證明雄性動物對受試藥物更敏感，首先用雌性動物進(jìn)行預(yù)試。根據(jù)受試物的有關(guān)資料，從上述四個劑量中選擇一個作為初始劑量；若無有關(guān)資料可作參考時，可用500ms／kg作為初始劑量進(jìn)行預(yù)試，如無毒性反應(yīng)，則用2000ms／kg進(jìn)行預(yù)試，此劑量如無死亡發(fā)生即可結(jié)束預(yù)試。如初始劑量出現(xiàn)嚴(yán)重的毒性反應(yīng)，即降低一個檔次的劑量進(jìn)行預(yù)試，如此時動物存活，就在此兩個固定劑量之間選擇一個中間劑量試驗(yàn)。每個劑量給一只動物，預(yù)試一般不超過5只動物。每個劑量試驗(yàn)之間至少應(yīng)間隔24小時。給受試物后的觀察期至少7天，如動物的毒性反應(yīng)到第7天仍然存在，尚應(yīng)繼續(xù)觀察7天。

。在上述預(yù)試的基礎(chǔ)上進(jìn)行正式試驗(yàn)。每個劑量至少用10只動物，雌雄各半。根據(jù)預(yù)試的結(jié)果，在上述四種劑量中選擇一個可能產(chǎn)生明顯毒性但又不引起死亡的劑量進(jìn)行試驗(yàn)。六、急性毒性試驗(yàn)中常用LDso的計(jì)算方法軟件第二節(jié)長期毒性試驗(yàn)

一、概念和目的長期毒性試驗(yàn)(反復(fù)給藥毒性研究)：是指動物反復(fù)多次接觸藥物所引起的毒性反應(yīng)。目的是通過重復(fù)給藥的動物試驗(yàn)表征受試物的毒性作用，預(yù)測其可能對人體產(chǎn)生的不良反應(yīng)，降低臨床受試者和藥品上市后使用人群的用藥風(fēng)險(xiǎn)。二、試驗(yàn)內(nèi)容(一)實(shí)驗(yàn)動物長期毒性試驗(yàn)應(yīng)至少在兩種動物以上，包括嚙齒類和非嚙齒類，嚙齒類主要是大鼠，非嚙齒類為犬如計(jì)劃生育用藥，應(yīng)選擇猴或其他大動物。大鼠體重要求在6—8周齡，試驗(yàn)周期3個月以上則選5—6周齡。每組試驗(yàn)體重差異不應(yīng)超過平均體重的20％。犬，如beagle犬一般用4-9月齡，性別要求為雌雄各半。(二)受試藥物和給藥途徑

對受試藥物應(yīng)注明藥名，批號，來源，規(guī)格，純度，理化性質(zhì)，保存條件及配制方法。理想的受試藥物應(yīng)與藥效試驗(yàn)，一般藥理，急毒，致突變，生殖，藥代有相同質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，對所用溶劑應(yīng)注明規(guī)格，來源，批號。給藥途徑原則上與臨床用藥途徑一致(三)分組，給藥劑量及給藥周期分組，一般設(shè)三個劑量組和一個對照組高劑量組原則上要求使動物產(chǎn)生明顯或嚴(yán)重毒性反應(yīng)，甚至個別動物死亡，但死亡動物數(shù)不應(yīng)超過20％，目的是為尋找毒性靶器官，毒性反應(yīng)癥狀及臨床搶救措施提供參考依據(jù)。中劑量組要求動物產(chǎn)生輕微的或中等的毒性反應(yīng)，一般應(yīng)高于藥效學(xué)試驗(yàn)的高劑量組低劑量組應(yīng)當(dāng)略高于動物有效劑量而不出現(xiàn)毒性反應(yīng)，目的是尋找動物安全劑量，為臨床劑量的設(shè)計(jì)提供依據(jù)。根據(jù)不同的臨床用藥周期，決定動物長毒試驗(yàn)的周期，以一個臨床治療療程為一個臨床用藥周期，臨床用藥1—3天的藥物，動物試驗(yàn)給藥周期為1個月；臨床用藥1周的藥物，動物試驗(yàn)給藥周期為1個月；臨床用藥4周的藥物，動物試驗(yàn)給藥周期為3個月，臨床用藥3月的藥物，動物試驗(yàn)給藥周期為至少半年以上。對于臨床3個月內(nèi)長期毒性試驗(yàn)必須每天給藥一次，但對于3個月以上的毒性試驗(yàn)，每周可給藥6次。每天給藥最好是固定時間。給藥期限為1個月的長期毒性研究通?？芍С峙R床療程不超過2周的藥物進(jìn)行臨床研究和生產(chǎn)。

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臨床療程超過2周的藥物，可以在臨床前一次性進(jìn)行支持藥物進(jìn)行Ⅲ期臨床研究(生產(chǎn))的長期毒性研究；也可以根據(jù)具體情況，以不同給藥期限的長期毒性研究來分別支持藥物進(jìn)入I期、Ⅱ期或Ⅲ期臨床研究(生產(chǎn))。通過給藥期限較短的毒性研究獲得的信息，可以為給藥期限較長的毒性研究設(shè)計(jì)提供給藥劑量、給藥頻率等方面的參考；同時，臨床研究中獲得的信息有助于給藥期限較長的動物毒性研究方案的設(shè)計(jì)，降低新藥開發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。

對于臨床療程超過2周的藥物，一般1個月的長期毒性研究可支持用藥時間不超過2周的I期臨床研究；通過給藥期限不同的長期毒性研究來分別支持Ⅱ、Ⅲ期臨床研究。以不同給藥期限的長期毒性研究來分別支