曲尼斯特對(duì)糖尿病腎病大鼠腎間質(zhì)纖維化的影響

曲尼斯特對(duì)糖尿病腎病大鼠腎間質(zhì)纖維化的影響

糖尿病性腎衰竭的主要原因之一是腎衰竭。DKD早期可出現(xiàn)腎小管間質(zhì)纖維化,且不依賴腎小球病變直接加速腎功能的惡化。研究腎間質(zhì)纖維化的發(fā)病機(jī)制、阻斷參與纖維化的信號(hào)通路,延緩DKD腎小管間質(zhì)纖維化,已成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。肥大細(xì)胞作為一種重要的炎癥細(xì)胞逐漸被關(guān)注,研究報(bào)道肥大細(xì)胞參與DKD腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生。曲尼斯特是一種肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑,臨床上常利用其穩(wěn)定肥大細(xì)胞膜,抑制組胺等釋放的作用治療過敏性疾病和哮喘等。最近有研究顯示曲尼斯特可緩解梗阻性腎病大鼠、阿霉素腎病大鼠及DKD患者腎間質(zhì)纖維化。曲尼斯特延緩腎間質(zhì)纖維化的作用機(jī)制可能與其抗氧化、抑制炎癥因子產(chǎn)生和釋放、抑制膠原的合成,從而減少局部炎癥有關(guān)。另有研究表明曲尼斯特可通過抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforminggrowthfactor-β1,TGF-β1),逆轉(zhuǎn)腎小管上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(epithelial-to-mesenchymaltransition,EMT),從而減少腎間質(zhì)ECM的聚集。然而曲尼斯特是否可通過抑制肥大細(xì)胞的募集及活化,逆轉(zhuǎn)DKD腎小管上皮細(xì)胞EMT,從而緩解DKD腎間質(zhì)纖維化尚不完全清楚。1材料和方法1.1材料表面1.1.1東南角配置動(dòng)物6周齡健康雄性SD大鼠(二級(jí))30只,購(gòu)于中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院動(dòng)物學(xué)部,體質(zhì)量為(181.65±5.15)g,由中南大學(xué)動(dòng)物學(xué)部動(dòng)物房飼養(yǎng)。所有大鼠自由攝食進(jìn)水,室溫18~25℃。1.1.2試劑和試劑盒曲尼斯特由中國(guó)藥科大學(xué)贈(zèng)送;鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品,4℃貯存;反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RevertAidTMFirststrandcDNASynthesisKit)為美國(guó)Ferments公司產(chǎn)品;SYBRGreenERqPCRSuperMix為美國(guó)Invitrogen公司產(chǎn)品;DEPC為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品;微量白蛋白試劑盒購(gòu)自上海太陽生物公司;DAB顯色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物有限公司;組織蛋白裂解液和苯甲基磺酰氟(PMSF)購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)責(zé)任有限公司;BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)研究所;PVDF膜為美國(guó)Millipore公司產(chǎn)品。兔抗人(大小鼠)C3aR多克隆抗體,鼠抗人(大小鼠)α-SMA單克隆抗體,兔抗鼠(大小鼠)E-Cadherin多克隆抗體為美國(guó)SantaCruz公司;纖維連接蛋白(fibronectin,FN)多克隆抗體,小鼠抗大鼠β-actin多克隆抗體,小鼠二抗,兔二抗試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋公司;兔抗人(大小鼠)I型膠原蛋白(collagenI,ColI)多克隆抗體為MeridianLifeScience公司產(chǎn)品。1.2方法1.2.1大鼠的造模及分組大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3d,隨機(jī)分為2組:正常組(A組)6只;糖尿病模型組24只。正常組喂食普通飼料,糖尿病模型組喂食高糖高脂飼料8周后腹腔注射小劑量STZ(30mg/kg)1次。正常對(duì)照組按同等劑量腹腔注射枸椽酸緩沖液。72h后測(cè)血糖和尿糖,空腹血糖大于13.8mmol/L,隨機(jī)血糖均高于16.7mol/L,尿糖++++,認(rèn)為糖尿病模型成功。糖尿病造模成功4周后尿微量白蛋白>30mg/24h認(rèn)為DKD大鼠模型制備成功。DKD大鼠隨機(jī)分3組:模型組(B組)以1.5%羥甲基纖維素鈉灌胃;低劑量曲尼斯特組(C組)以曲尼斯特200mg/(kg·d)分2次灌胃(曲尼斯特溶于1.5%羧甲基纖維素鈉溶液配制成的混懸液);高劑量曲尼斯特組(D組)曲尼斯特400mg/(kg·d)分2次灌胃。實(shí)驗(yàn)期間每3d測(cè)尾靜脈血糖1次,血糖>26.0mmol/L的大鼠皮下注射適量(0.4~3.2U)長(zhǎng)效胰島素,隨機(jī)血糖維持在16.7mmol/L以上。每周測(cè)體質(zhì)量1次。第8周末一次性處死大鼠。處死前2d放入代謝籠收集24h尿標(biāo)本,離心后取上清液保存于–70℃冰箱待測(cè)尿白蛋白。3%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠,斷頭處死動(dòng)物,自腹主動(dòng)脈插管注入4℃預(yù)冷的生理鹽水至整個(gè)腎顏色變蒼白后,小心游離切斷腎蒂,腎置于冰上,快速去除包膜,將一側(cè)腎橫行切成3mm厚的組織塊,置于4%中性甲醛溶液中固定用于制作石蠟切片,行病理學(xué)以及免疫組織化學(xué)處理,另一側(cè)腎凍于液氮中用于提取組織蛋白及RNA。1.2.2甲苯胺藍(lán)染色由于甲苯胺藍(lán)染液可將腎組織肥大細(xì)胞染成藍(lán)紫色,可用甲苯胺藍(lán)染色檢測(cè)肥大細(xì)胞的存在。具體方法:改良甲苯胺藍(lán)染色按文獻(xiàn)進(jìn)行。組織切片脫蠟至水后入染液30s,蒸餾水洗2次,每次3~5min,放入改良的甲苯胺藍(lán)染液中(1%,pH1.0)室溫下染色30s~5min,經(jīng)0.5%冰醋酸分化數(shù)秒,在鏡下控制分色時(shí)間,以肥大細(xì)胞異染顆粒呈藍(lán)紫色為宜,二甲苯透明,中性樹膠封固。1.2.3腎組織的肥大細(xì)胞石蠟切片脫蠟,經(jīng)各級(jí)乙醇至水,經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度酒精至水后浸入0.01mol/L枸櫞酸鹽緩沖液(pH6.0)中行微波熱修復(fù)抗原,室溫冷卻20min后,PBS沖洗5min,然后置于3%H2O2室溫孵育10min,以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性,滴加正常山羊血清封閉,免洗,滴加適當(dāng)稀釋一抗(C3aR1:200,E-cadherin1:200,α-SMA1:100,FN1:200,ColI1:100,SCF1:50,c-kit1:200)4℃過夜。第2天取出,分別滴加相對(duì)應(yīng)的HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗工作液及山羊抗小鼠IgG二抗(1:100),DAB顯色,顯微鏡下控制顯色時(shí)間。根據(jù)腎組織肥大細(xì)胞特異性高表達(dá)C3aR的特點(diǎn),采用免疫組織化學(xué)的方法標(biāo)記腎組織的肥大細(xì)胞。文獻(xiàn)證明作為腎組織肥大細(xì)胞的標(biāo)志分子,C3aR對(duì)肥大細(xì)胞的檢出率與抗Tryptase抗體對(duì)肥大細(xì)胞的檢出率敏感性無明顯差異,而特異性更強(qiáng)。取50~100mg腎組織在液氮中碾磨成粉末狀,加入500μL預(yù)冷的蛋白裂解液,4℃,12000r/m離心30min,留取上清液為總蛋白,并用Bradford法測(cè)定蛋白濃度。蛋白質(zhì)與loadingbuffer混合后95℃變性5min,行SDS,然后濕轉(zhuǎn)至PVDF膜。2%BSA室溫封閉2h,加入稀釋一定倍數(shù)的E-cadherin,α-SMA,FN,ColI,SCF,c-kit一抗,4℃過夜。加HRP偶聯(lián)標(biāo)記的山羊抗兔IgG及山羊抗小鼠IgG二抗,室溫反應(yīng)1h,化學(xué)發(fā)光劑ECL反應(yīng),置柯達(dá)化學(xué)發(fā)光成像儀中曝光。采用圖像分析軟件分析,以測(cè)得的各指標(biāo)的吸光度與內(nèi)參照β-actin吸光度的比值代表相對(duì)定量值。1.2.5腎組織中fn,coli-4和c-藥物元素表達(dá)用TRIzol試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司)提供的方法抽提細(xì)胞總RNA,按反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RevertAidTMFirststrandcDNASynthesisKit)說明書的步驟進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。運(yùn)用熒光染料法檢測(cè)各組大鼠腎組織中FN,ColI,SCF和c-kit的表達(dá)情況。通過測(cè)定PCR擴(kuò)增過程中與雙鏈DNA非特異性結(jié)合的SYBRGREEN燃料強(qiáng)化反應(yīng)PCR產(chǎn)物表達(dá)量。每次實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)復(fù)孔,獨(dú)立實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成,引物序列見表1。PCR反應(yīng)程序:50℃2min,95℃10min后;95℃變性10s,60℃退火60s,72℃延伸60s,共執(zhí)行40個(gè)循環(huán);最后72℃總延伸10min。實(shí)驗(yàn)同時(shí)以雙蒸水代替模板為陰性對(duì)照。以管家基因β-actin的轉(zhuǎn)錄數(shù)量作為內(nèi)源性RNA參照。以2–△△Ct表示基因的相對(duì)表達(dá)量,其中△△Ct=△Ct樣品–△Ct基準(zhǔn)=(樣品待測(cè)基因Ct值–樣品β-actinCt值)–(基準(zhǔn)樣品待測(cè)基因Ct值–基準(zhǔn)β-actinCt值)。1.3標(biāo)準(zhǔn)差ue0afs應(yīng)用SPSS17.0軟件系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ue0af±s)表示。計(jì)量資料采用單因素方差分析(one-wayANOVA),兩樣本均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1肥大細(xì)胞不同組織部位甲苯胺藍(lán)染色顯示:正常對(duì)照組大鼠腎組織腎間質(zhì)區(qū)域(主要是血管周圍和腎小管間隙里)偶可見數(shù)個(gè)肥大細(xì)胞散在分布,腎小球未見肥大細(xì)胞和間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。DKD模型組小血管管周、外膜及腎小管間隙、腎間質(zhì)炎癥區(qū)域等可見多個(gè)肥大細(xì)胞,腎小管上皮細(xì)胞間也可見肥大細(xì)胞。8周末時(shí)曲尼斯特干預(yù)組肥大細(xì)胞浸潤(rùn)較DKD模型組明顯減少(圖1,2)。肥大細(xì)胞C3aR免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示:C3aR標(biāo)記的肥大細(xì)胞在正常大鼠腎組織中偶爾可見,主要位于腎小管間隙及血管管周,腎小球未見;DKD大鼠腎組織可見肥大細(xì)胞浸潤(rùn)增多,主要分布于腎小管間隙、血管管周、血管外膜、腎間質(zhì)炎癥區(qū)域、腎小球囊周圍,偶爾可見肥大細(xì)胞分布在腎小管上皮細(xì)胞之間,腎小球中未見肥大細(xì)胞的浸潤(rùn);曲尼斯特能抑制腎組織C3aR的表達(dá),并與其劑量呈正相關(guān)(P<0.05),說明曲尼斯特可減少肥大細(xì)胞的浸潤(rùn)(圖2,3)。2.2曲妮t影響了dkd大鼠腎臟組織的e-qc2.2.1腎組織-sma的表達(dá)正常對(duì)照組腎皮質(zhì)組織上皮細(xì)胞標(biāo)志E-cadherin主要在腎小管上皮細(xì)胞–細(xì)胞連接處及細(xì)胞–基底膜連接處表達(dá)。與正常對(duì)照組相比,DKD模型組腎組織E-cadherin表達(dá)明顯減少(P<0.05),曲尼斯特能上調(diào)E-cadherin的表達(dá)(P<0.05),并隨劑量的增大效果增強(qiáng)(圖4,5)。正常對(duì)照組腎皮質(zhì)組織間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志α-SMA僅少量表達(dá)于腎小血管壁和腎間質(zhì)細(xì)胞。DKD模型組α-SMA不僅表達(dá)于腎小血管管壁及腎間質(zhì)細(xì)胞,許多腎小管上皮細(xì)胞也表達(dá)α-SMA,并隨纖維化程度的加重而表達(dá)逐漸增加。與正常對(duì)照組相比,DKD模型組腎組織α-SMA表達(dá)明顯增加(P<0.05)。曲尼斯特能下調(diào)α-SMA的表達(dá)(P<0.05),并隨劑量0.8的增加下調(diào)作用增強(qiáng)(圖5,6)。2.2.2曲尼特能劑量a對(duì)dkd大鼠腎組織e-cadhenin蛋白表達(dá)的影響與正常對(duì)照組相比,DKD模型組8周末腎組織E-cadherin蛋白表達(dá)減少(P<0.05),α-SMA蛋白表達(dá)增加(P<0.05),曲尼斯特能劑量依賴性上調(diào)DKD大鼠腎組織E-cadherin蛋白的表達(dá)(P<0.05),并抑制DKD大鼠腎組織α-SMA蛋白的表達(dá)(P<0.05,圖7)。2.3coli對(duì)dkd大鼠腎組織fn和coli表達(dá)的影響2.3.1曲尼特對(duì)k-小鼠肝腎fn表達(dá)的調(diào)節(jié)作用FN主要沉積于正常對(duì)照組大鼠腎小球、腎小管基底膜及小血管周圍;DKD大鼠腎組織腎間質(zhì)區(qū)域特別是小血管周圍及炎癥區(qū)域FN的表達(dá)明顯增加(P<0.05);曲尼斯特能下調(diào)腎小球和腎小管FN表達(dá)(P<0.05),并且隨劑量的增加效果增強(qiáng)(圖8,9)。ColI主要表達(dá)于正常對(duì)照組大鼠腎小球及腎小管基底膜、腎間質(zhì)、血管外膜及血管周圍;DKD大鼠腎小球周圍、腎小管間質(zhì)及血管外膜及血管周圍ColI表達(dá)明顯增加,在空泡樣變的腎小管上皮細(xì)胞胞膜中也有少量的表達(dá)。曲尼斯特能下調(diào)ColI的表達(dá)(P<0.05),并且隨劑量的增加下調(diào)作用更明顯(圖9,10)。2.3.2曲尼特對(duì)dkd大鼠腎組織fn與正常對(duì)照組相比,DKD模型組8周末腎組織FN,ColI的蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.05),曲尼斯特可劑量依賴性抑制DKD大鼠腎組織FN,ColI蛋白(P<0.05,圖11)。2.3.3dkd對(duì)正常腎組織的肝腎scf及c-傳統(tǒng)表達(dá)的影響與正常對(duì)照組相比,DKD模型組8周末腎組織FN,ColImRNA的表達(dá)上調(diào)(P<0.05),8周末時(shí)腎組織FN,ColImRNA的表達(dá)曲尼斯特低劑量組較DKD模型組開始下降(P<0.05),高劑量組表達(dá)明顯下降,與DKD組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而與正常對(duì)照組相比上調(diào)不明顯(P>0.05,圖12)。SCF在正常腎組織的腎小管、腎間質(zhì)區(qū)域可見少量的表達(dá)。DKD模型組大鼠腎小管上皮細(xì)胞胞漿、腎小球系膜細(xì)胞及上皮細(xì)胞、腎間質(zhì)炎癥細(xì)胞的胞漿及血管壁可見明顯棕色陽性顆粒表達(dá),腎小管上皮細(xì)胞胞漿及腎小管間隙,部分腎小管管腔表達(dá)尤其明顯。曲尼斯特可減少SCF的表達(dá)(P<0.05),并隨劑量的增加抑制作用增強(qiáng)(P<0.05;圖13,14)。c-kit在正常腎組織的腎小管上皮細(xì)胞包膜、胞漿、腎小球內(nèi)及腎間質(zhì)區(qū)域均未見明顯表達(dá)。DKD組大鼠腎小管上皮細(xì)胞胞漿、胞膜、腎間質(zhì)炎癥細(xì)胞的胞膜中表達(dá)明顯增加,特別是在空泡樣變的腎小管上皮細(xì)胞胞膜中連續(xù)表達(dá),但腎小球無表達(dá)。曲尼斯特可抑制c-kit的表達(dá)(P<0.05),與其劑量呈正相關(guān)(P<0.05;圖14,15)。2.4.2dkd大鼠腎scf、c-pet蛋白表達(dá)與正常對(duì)照組相比,DKD模型組8周末腎組織SCF,c-kit的蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05),曲尼斯特可下調(diào)DKD大鼠腎組織SCF、c-kit蛋白的表達(dá)(P<0.05),并呈劑量依賴性(P<0.05,圖16)。2.4.3dkd大鼠腎scf的mrna表達(dá)與正常對(duì)照組相比,8周末DKD模型組腎組織SCF,c-kitmRNA表達(dá)均明顯上調(diào)(P<0.05),曲尼斯特可下調(diào)DKD大鼠腎組織SCF,c-kitmRNA的表達(dá)(P<0.05),并與其劑量呈正相關(guān)(P<0.05,圖17)。2.5腎組織肥大細(xì)胞浸漬程度及肝腎間質(zhì)fn腎組織SCF,c-kit蛋白的表達(dá)與腎組織肥大細(xì)胞浸潤(rùn)程度及腎小管間質(zhì)FN,ColI蛋白的表達(dá)呈顯著正相關(guān)(P<0.01,表2)。3dkd模型中腎間質(zhì)纖維化的表達(dá)腎間質(zhì)纖維化是包括DKD在內(nèi)的各種腎臟疾病進(jìn)展到終末期腎衰竭的共同途徑和主要病理基礎(chǔ)。目前認(rèn)為腎間質(zhì)纖維化是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程,涉及多種炎癥細(xì)胞及細(xì)胞因子、血管活性物質(zhì)以及細(xì)胞外基質(zhì)的生成失衡等諸多因素。腎小管上皮細(xì)胞在尿糖、尿蛋白、氧化應(yīng)激等病理性刺激下極易發(fā)生結(jié)構(gòu)及功能的損傷,出現(xiàn)上皮細(xì)胞空泡樣變、脫落及凋亡,部分腎小管上皮細(xì)胞為了對(duì)抗環(huán)境的損傷,逃脫潛在的凋亡,可通過表型轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞,進(jìn)入間質(zhì)、異常合成ECM(細(xì)胞外基質(zhì)),這一過程即為腎小管上皮向間充質(zhì)上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(EMT)。正常情況下,腎小管上皮細(xì)胞通過不同的細(xì)胞黏附機(jī)制緊密連接在一起,E-cadherin是一種特異性的黏附分子蛋白,它對(duì)維持腎小管上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的完整性起到關(guān)鍵作用。E-cadherin是正常腎小管上皮細(xì)胞的標(biāo)志分子,其表達(dá)的下調(diào)將可能導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性破壞。α-SMA是一種有收縮功能的細(xì)胞骨架微絲結(jié)構(gòu),是腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化形成肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)志。DKD腎小管上皮細(xì)胞E-cadherin表達(dá)減少、α-SMA表達(dá)上調(diào),腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化成肌成纖維細(xì)胞,導(dǎo)致ECM合成增加、降解減少,大量ECM積聚并沉積于腎小球、腎間質(zhì)內(nèi),導(dǎo)致腎小球硬化及腎間質(zhì)纖維化。FN及ColI是目前公認(rèn)的主要細(xì)胞外基質(zhì)成分。因此,早期逆轉(zhuǎn)或抑制腎小管上皮細(xì)胞EMT,減少FN,ColI在腎組織的異常合成及過度沉積對(duì)治療DKD腎間質(zhì)纖維化、緩解DKD患者腎功能進(jìn)展具有重要作用。肥大細(xì)胞起源于骨髓CD34+多能祖細(xì)胞,胞漿顆粒中富含炎癥介質(zhì)。肥大細(xì)胞作為一種重要的炎癥細(xì)胞,近年來其在腎間質(zhì)纖維化中的作用越來越受到重視。筆者既往的研究發(fā)現(xiàn):肥大細(xì)胞在蛋白負(fù)荷腎病大鼠腎間質(zhì)明顯增多,推測(cè)其在蛋白尿所致腎間質(zhì)纖維化過程中起重要作用。目前已經(jīng)有很多臨床及動(dòng)物研究表明:IgA腎病、膜性腎病、狼瘡性腎炎、過敏性紫癜、馬兜鈴酸腎病和DKD等多種腎病的腎間質(zhì)中均有肥大細(xì)胞浸潤(rùn),且與腎間質(zhì)纖維化和腎功能損傷的嚴(yán)重程度呈明顯正相關(guān)。肥大細(xì)胞可通過脫顆粒釋放大量的炎癥介質(zhì),如糜蛋白酶、腎素、組胺及TGF-β等,激活腎素–血管緊張素–醛固酮系統(tǒng),上調(diào)TGF-β的表達(dá),激活腎組織局部炎癥,參與腎小管上皮細(xì)胞EMT的發(fā)生等,從而參與腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)程;肥大細(xì)胞活化后也可分泌類胰蛋白酶,能促進(jìn)VEGF的產(chǎn)生,促進(jìn)炎癥反應(yīng)及細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生,從而促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化。Soma等通過將曲尼斯特制劑用于早期及進(jìn)展期DKD患者,發(fā)現(xiàn)曲尼斯特能延緩早期及進(jìn)展期DKD患者腎間質(zhì)纖維化。最新發(fā)現(xiàn)曲尼斯特在單側(cè)輸尿管梗阻性腎病中具有明顯的抗纖維化作用。曲尼斯特可通過抑制TGF-β的表達(dá)從而減少腎小管EMT、保護(hù)腎小管基底膜、緩解腎小管的損傷,從而緩解腎間質(zhì)纖維化。本研究通過構(gòu)建STZ誘導(dǎo)的DKD大鼠模型,發(fā)現(xiàn)DKD模型組大鼠腎組織肥大細(xì)胞的浸潤(rùn)較正常對(duì)照組增多,并與腎間質(zhì)纖維化呈顯著正相關(guān),曲尼斯特干預(yù)組腎間質(zhì)肥大細(xì)胞浸潤(rùn)減少。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)作為間充質(zhì)細(xì)胞表型標(biāo)志的α-SMA只表達(dá)于正常腎組織的小血管管壁以及很少的間質(zhì)細(xì)胞中,腎小管上皮細(xì)胞未見表達(dá),上皮細(xì)胞標(biāo)記蛋白E-cadherin在正常腎小管上皮細(xì)胞均表達(dá)明顯。而DKD模型組中腎小管上皮細(xì)胞有一定量的α-SMA的表達(dá),E-cadherin在腎小管上皮細(xì)胞中表達(dá)明顯下降;應(yīng)用曲尼斯特干預(yù)后,α-SMA的表達(dá)有所下降而E-cadherin的表達(dá)增加。曲尼斯特呈劑量依賴性的下調(diào)α-SMA的表達(dá)和上調(diào)E-cadherin的表達(dá),具有逆轉(zhuǎn)DKD腎小管EMT的作用。同時(shí)DKD大鼠腎組織FN,ColI蛋白及m