火絨草乙醇提取物對(duì)實(shí)驗(yàn)性系膜增生性腎小球腎炎模型的治療作用及機(jī)制初探

火絨草乙醇提取物對(duì)實(shí)驗(yàn)性系膜增生性腎小球腎炎模型的治療作用及機(jī)制初探

水生生殖器腎炎（msn）是一個(gè)病理術(shù)語(yǔ)。它是一組腎衰竭，以通過(guò)光鏡下統(tǒng)治者的腎囊腔為特征。這是中國(guó)核電站腎衰竭綜合征最常見(jiàn)的病理類型。對(duì)于該病現(xiàn)代醫(yī)學(xué)尚無(wú)特效治療方法,臨床仍以糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑及對(duì)癥治療為主,存在一定的不確定性及毒性和不良反應(yīng)。而中藥對(duì)于MsPGN的治療則具有一定的療效且毒性和不良反應(yīng)小?；鸾q草是菊科火絨草屬植物的一種,火絨草具有利尿、降血糖、抗菌、抗炎及鎮(zhèn)痛等功效,其主要有效成分包括咖啡酸、香草酸、原兒茶醛、反式桂皮酸和阿魏酸等化合物,火絨草在治療急、慢性腎炎方面取得了較滿意的療效,但對(duì)火絨草治療MsPGN療效及作用機(jī)制尚不清楚。本研究采用改良的慢性血清病性MsPGN大鼠模型,探索火絨草70%乙醇提取物對(duì)MsPGN大鼠的治療作用,為臨床進(jìn)一步應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1材料和方法1.1beauv.面向火炬的火絨草浸膏的合成實(shí)驗(yàn)用火絨草采集于遼寧營(yíng)口,經(jīng)沈陽(yáng)藥科大學(xué)中藥學(xué)院生藥學(xué)教研室教授李玉山教授鑒定為菊科火絨草屬植物火絨草(Leontopodiumleontopodioides(Willd.)Beauv.)。取火絨草干燥全草3.0kg,剪碎,用9倍量體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液加熱回流提取3次,每次2h,減壓回收溶劑,得浸膏456g,收率為15.2%。雷公藤多苷片(Tripterygiumglycosides),上海復(fù)旦復(fù)華藥業(yè)有限公司生產(chǎn)(批號(hào)Z31020415)。1.2動(dòng)物合格SD大鼠(SPF級(jí))50只,雌雄各半,體重150~200g,由北京華阜康生物科技股份有限公司提供,動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(京)2009-0004。1.3ampsco公司完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑,Sigma公司生產(chǎn)(批號(hào)F5881、F5506);牛血清白蛋白(BSA),Amresco公司生產(chǎn)(批號(hào)0332);尿蛋白定量試劑盒,南京建成生物工程研究所生產(chǎn)(批號(hào)20111028);血清總蛋白定量試劑盒,南京建成生物工程研究所生產(chǎn)(批號(hào)20111022);血、尿肌酐試劑盒,南京建成生物工程研究所生產(chǎn)(批號(hào)20111016);尿素氮試劑盒,南京建成生物工程研究所生產(chǎn)(批號(hào)20111008)。1.4儀器1.5大鼠bsa和24h尿蛋白的檢測(cè)大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,經(jīng)檢測(cè)尿蛋白均為陰性。按體重隨機(jī)留取10只為正常對(duì)照組,其余大鼠均采用改良慢性血清病法復(fù)制MsPGN模型[9~11]:10%水合氯醛(300mg/kg)腹腔注射麻醉,常規(guī)消毒后,通過(guò)背部切除左側(cè)腎臟。而正常對(duì)照組大鼠則進(jìn)行至切開(kāi)肌肉層后縫合。術(shù)后大鼠休養(yǎng)1周,然后開(kāi)始進(jìn)行藥物造模。除正常對(duì)照組,其余造模大鼠雙側(cè)足墊皮下注射完全弗氏佐劑0.1ml加3mgBSA,并于第1、2周末各加強(qiáng)1次。第3周末,腹腔連續(xù)注射4次BSA,間隔時(shí)間1h,注射劑量分別為每只0.5、1.0、1.5、3.0mg,次日晨加強(qiáng)1次(2mg/只)。之后每日腹腔注射BSA,劑量從每只0.5mg開(kāi)始,每日增加0.5mg至5.0mg,然后繼續(xù)每周加量1mg至10mg為止。除麻醉意外和超敏反應(yīng)死亡3只,將剩余大鼠于造模第5周末應(yīng)用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定所有大鼠24h尿蛋白含量。剔除造模后尿蛋白反應(yīng)呈弱陽(yáng)性的3只,其余大鼠按24h尿蛋白水平隨機(jī)均衡分為模型對(duì)照組、雷公藤多苷片組、火絨草高劑量和火絨草低劑量組。于造模第6周開(kāi)始灌胃給藥(10ml/kg),每日1次,連續(xù)6周:(1)正常組和模型組:按體重給予相應(yīng)容量的0.5%CMC-Na溶劑;(2)雷公藤多苷片組:15mg/kg劑量灌胃;(3)火絨草低劑量組:以400mg/kg劑量灌胃;(4)火絨草高劑量組:以800mg/kg/d劑量灌胃。1.5.1測(cè)定的尿液指數(shù)為分別于造模第5周末、給藥第3周末、第6周末(即實(shí)驗(yàn)結(jié)束前一天),收集大鼠24小時(shí)尿液,測(cè)量24h尿蛋白、尿量及尿肌酐水平。1.5.2血清尿素氮的測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),所有大鼠以10%水合氯醛(300mg/kg)腹腔注射麻醉后,腹主動(dòng)脈采血,3000rpm離心10min后,取上清,然后立刻進(jìn)行血清肌酐,血清尿素氮和血清總蛋白等血液生化指標(biāo)的測(cè)定。1.5.3腎組織病理學(xué)形態(tài)的觀察2不同著性的差異給藥3周和6周后,模型組大鼠24h尿蛋白水平升高,與正常組相比具有極顯著性的差異。給藥3周后,與模型組相比,雷公藤多苷片組及火絨草提取物高(800mg/kg)劑量組24h尿蛋白水平顯著降低,而給藥6周后,各給藥組24h尿蛋白水平均下降,與模型組相比具有極顯著性的差異,見(jiàn)表1。2.2兩組患者的比較如表2所示,模型組大鼠右側(cè)腎重及腎重指數(shù)均有所增加,與正常組相比具有極顯著性的差異。雷公藤多苷片組及火絨草高(800mg/kg)劑量組大鼠的腎重指數(shù)有所下降,與模型組相比具有顯著性差異。2.3各組小鼠血清心肌指標(biāo)比較如表3所示,模型組大鼠尿肌酐和肌酐清除率水平降低,與正常組相比具有顯著性的差異,血清肌酐水平升高,與正常組相比具有極顯著性的差異。各給藥組尿肌酐水平均升高,與模型組相比具有極顯著性的差異,雷公藤多苷片組及火絨草提取物高(800mg/kg)劑量組血清肌酐和肌酐清除率水平與模型組相比有顯著性差異。2.4各組尿素氮水平比較如表4所示,模型組大鼠血清總蛋白和血清尿素氮水平與正常組相比具有極顯著性的差異。各給藥組與模型組相比,血清總蛋白水平均明顯升高,血清尿素氮水平均明顯降低。2.5組織病理學(xué)檢查正常組腎小球及腎小管結(jié)構(gòu)正常,系膜細(xì)胞和基質(zhì)無(wú)增生,腎小球毛細(xì)血管管腔通暢,無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維化。模型組腎小球明顯增大,部分腎小管上皮細(xì)胞呈空泡狀或顆粒狀變性或水腫,毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和系膜細(xì)胞彌漫性增生,系膜基質(zhì)增多,部分腎小球毛細(xì)血管管腔受壓變窄甚或閉塞,腎小球囊腔出現(xiàn)灶狀粘連,組織伴有多形核炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。雷公藤多苷片組腎小球腫脹較輕,腎小球大小變化較模型組減輕,腎小管結(jié)構(gòu)基本正常,系膜細(xì)胞和基質(zhì)增生程度亦有所減輕;腎小球囊腔基本無(wú)粘連,組織伴有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)?；鸾q草提取物高(800mg/kg)劑量組腎小球增大不明顯,腎小管結(jié)構(gòu)基本正常,系膜細(xì)胞和基質(zhì)增生程度較模型組均有所減輕,毛細(xì)血管管腔受壓程度亦明顯減輕,腎小球囊腔粘連減少,基本無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn),見(jiàn)圖1。2.6小鼠系膜細(xì)胞增殖的表現(xiàn)正常組腎小球系膜細(xì)胞和系膜基質(zhì)無(wú)增生,內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常,足細(xì)胞足突結(jié)構(gòu)清晰完整,呈杵樣并列排列于基底膜外側(cè),基底膜結(jié)構(gòu)完整,厚度均勻。模型組腎小球系膜細(xì)胞明顯增生,系膜基質(zhì)增多,系膜區(qū)增寬,內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)不規(guī)則,基底膜呈節(jié)段性不規(guī)則增厚,足突腫脹,排列紊亂,出現(xiàn)節(jié)段性輕、中度融合,系膜區(qū)可見(jiàn)云霧狀電子致密物質(zhì)沉積。雷公藤多苷片組腎小球系膜細(xì)胞和系膜基質(zhì)增生不明顯,或僅呈輕度增生,足突形態(tài)結(jié)構(gòu)基本正常?；鸾q草高(800mg/kg)劑量組腎小球系膜細(xì)胞和系膜基質(zhì)增生不明顯,系膜區(qū)寬度與模型組相比,明顯變窄,足突結(jié)構(gòu)有部分損傷,基底膜結(jié)構(gòu)和厚度基本正常,云霧狀電子致密物沉積不明顯,見(jiàn)圖2。3病理組織學(xué)檢測(cè)本研究采用了改良的慢性血清病腎炎法復(fù)制大鼠MsPGN模型。從我們對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的連續(xù)觀察發(fā)現(xiàn),自注射BSA后第2周,造模組大鼠開(kāi)始出現(xiàn)蛋白尿,至最終實(shí)驗(yàn)結(jié)束,其尿蛋白水平進(jìn)一步升高;血清肌酐、血清尿素氮水平亦較正常組升高;同時(shí)病理檢查可見(jiàn)模型組大鼠系膜細(xì)胞增生,系膜區(qū)增寬及系膜基質(zhì)增多,符合MsPGN病理改變,與文獻(xiàn)報(bào)道的一致。這表明本實(shí)驗(yàn)成功復(fù)制了MPsGN動(dòng)物模型。24h尿蛋白定量是反映腎小球功能正常與否的重要指標(biāo),一般說(shuō)來(lái),持續(xù)性的蛋白尿往往代表腎臟有病變,尿蛋白的多少反映了病變程度,臨床可據(jù)此作療效觀察。本實(shí)驗(yàn)研究表明,火絨草治療組的24h尿蛋白水平明顯低于模型組,且火絨草高(800mg/kg)劑量組的降低程度與陽(yáng)性對(duì)照雷公藤多苷片組相似,提示火絨草提取物能有效減輕模型大鼠腎臟病變程度。當(dāng)腎小球?yàn)V過(guò)功能受損時(shí),血中肌酐濃度將隨之升高。因此臨床常把測(cè)定血清肌酐濃度作為判斷腎功能的一項(xiàng)重要指標(biāo)。尿素氮是人體蛋白質(zhì)代謝的主要終末產(chǎn)物,在腎功能正常的情況下,尿素氮從腎小球?yàn)V出,故其用作腎小球?yàn)V過(guò)功能的診斷指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)研究表明,火絨草治療組血清尿素氮、血清肌酐明顯低于模型組,提示火絨草提取物具有較好的改善腎功能和腎小球?yàn)V過(guò)率,促進(jìn)損傷組織修復(fù)的作用。殘余腎的代償性肥大和高代謝狀態(tài)是腎小球腎炎進(jìn)行性惡化的重要機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)研究表明,與模型組相比,火絨草治療組大鼠右腎重量、腎重指數(shù)均有所降低,提示火絨草提取物能抑制腎臟代償性肥大,有助于減少腎小球硬化的發(fā)生,延緩腎小球腎炎的進(jìn)一步發(fā)展。此外,腎組織病理學(xué)結(jié)果表明火絨草能有效地抑制大鼠系膜細(xì)胞增殖,減少基質(zhì)積聚,與陽(yáng)性對(duì)照藥雷公藤多苷片相比無(wú)明顯差異,進(jìn)一步證實(shí)火絨草提取物具有減輕MsPGN模型大鼠腎臟病理?yè)p害、促進(jìn)腎小球病理改變恢復(fù)的作用,為火絨草提取物治療MsPGN提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。IX71型倒置