腎絡(luò)寧對(duì)iga腎病腎小球硬化模型的影響

腎絡(luò)寧對(duì)iga腎病腎小球硬化模型的影響

iga腎病的發(fā)病率很高，其發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。到目前為止，還沒有有效的治療方法。大約40%的患者在5.25年內(nèi)開始進(jìn)入腎衰竭（esr）。而腎小球硬化則是IgA腎病發(fā)展至終末期的重要病理基礎(chǔ)。目前已知,細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的積聚是導(dǎo)致腎小球硬化的中間環(huán)節(jié),而TGF-β1己被公認(rèn)為是腎小球硬化治療的靶目標(biāo),在腎小球硬化的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。本實(shí)驗(yàn)在前期系列實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步觀察了IgA腎病腎小球硬化過程中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)的作用、以及ECM成分纖維連結(jié)蛋白(FN)的表達(dá)情況,同時(shí)觀察腎絡(luò)寧、苯那普利以及腎炎康復(fù)片的干預(yù)作用。1材料和方法1.1左腎摘除術(shù)組選用SD雌性大鼠90只,體重(200±20)g,級(jí)別SPF/VAF。動(dòng)物經(jīng)普通飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,尿紅細(xì)胞、蛋白陰性,采用隨機(jī)數(shù)字表的方法分為正常組、模型組、苯那普利組、腎炎康復(fù)片組、腎絡(luò)寧組,每組18只。模型組、苯那普利組、腎絡(luò)寧組、腎炎康復(fù)片組大鼠共72只以戊巴比妥鈉50mg/kg腹腔注射麻醉,行左腎摘除術(shù)(常規(guī)消毒,背部切口1~1.5cm,暴露左腎,剝離腎臟脂肪及腎上腺,結(jié)扎左腎門血管,切除左腎,縫合切口)。造模動(dòng)物分別于2周、4周、6周尾靜脈注射葡萄球菌腸毒素B(SEB)0.6mg/kg,正常組給以等量生理鹽水注射。1.2腎康復(fù)片、苯那普利腎絡(luò)寧由生黃芪15g,柴胡12g,黃芩10g,女貞子15g,山楂12g,扁蓄12g,地錦草15g,生側(cè)柏15g,白花蛇舌草15g組成,按比例稱取后水煎濃縮至每毫升含生藥量3g。裝瓶密封,置入4℃冰箱保存待用。苯那普利(商品名:洛汀新),由瑞士諾華制藥有限公司提供(批號(hào):04140);腎炎康復(fù)片由天津同仁堂制藥廠提供(批號(hào):483028)。治療組自造模第1天起開始給藥,大鼠給藥劑量按藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物給藥方法(馬氏定理)計(jì)算,均給以成人劑量/kg體重的15倍灌胃(腎絡(luò)寧3g/ml;苯那普利0.165g/ml;腎炎康復(fù)片1.2g/ml),其余各組給等量生理鹽水灌胃。1.3樣品處理和觀察方法分別于第6、9、12周末處死大鼠,每次6只,其中第6周末行免疫熒光檢測(cè),其余腎組織進(jìn)行免疫組化染色。1.3.1iga、igg、igm、c組新鮮大鼠腎組織取出液氮速凍,以組織包埋劑OCT包埋后,放置冰凍切片機(jī)(Leica2800型法國)上制成4μm厚的冰凍切片,室溫晾干,0.1MPBS緩沖液洗3min×2,分別滴加FITC標(biāo)記的羊抗大鼠IgA抗體、兔抗大鼠IgG抗體、兔抗大鼠IgM,兔抗大鼠C3(1∶50稀釋),室溫放置1h,PBS洗5min×3,晾干后甘油封片,在Nikon熒光顯微鏡下觀察IgA、IgG、IgM、C3的沉積情況。結(jié)果顯示在系膜區(qū)有以IgA為主的免疫復(fù)合物沉積,表明模型制作成功。1.3.2免疫組化方法和試劑來源免疫組化采用SABC法;兔抗TGF-β1、FN多克隆抗體購自武漢博士德公司。1.4圖像分析結(jié)果采用HPIAS-2000高清晰度彩色圖文病理分析系統(tǒng)軟件進(jìn)行病理圖像分析。每份樣本均在400倍顯微鏡下,視野上、下、左、右、中各取1個(gè)腎小球(共5個(gè)),測(cè)量每個(gè)腎小球中免疫組化染色陽性區(qū)的面積及相應(yīng)腎小球的面積,以二者的比值表示每種成分在腎小球中的相對(duì)含量。1.5同批標(biāo)本比較采用SPSS11.0forWindows,同批標(biāo)本間比較采用單因素方差分析(One-WayANOVA),并對(duì)有關(guān)指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析。2結(jié)果2.1小鼠足跖部tgf-1表達(dá)情況正常組大鼠腎小球內(nèi)見少量TGF-β1的陽性表達(dá),模型大鼠從6周起腎小球內(nèi)可見顯著TGF-β1陽性表達(dá),6、9、12周表達(dá)不斷加強(qiáng)。陽性物質(zhì)主要位于腎小球固有細(xì)胞胞漿、系膜區(qū)及基底膜,圖像分析結(jié)果顯示3個(gè)時(shí)段內(nèi),腎小球硬化模型組大鼠腎小球內(nèi)TGF-β1陽性相對(duì)面積顯著高于正常組(P<0.01);腎絡(luò)寧、苯那普利、腎炎康復(fù)片治療組腎小球內(nèi)TGF-β1的陽性表達(dá)面積較模型組顯著減少(P<0.05或P<0.01)。在3個(gè)時(shí)段內(nèi)腎絡(luò)寧均優(yōu)于苯那普利與腎炎康復(fù)片組,其中9周后腎絡(luò)寧組比腎炎康復(fù)片組優(yōu)勢(shì)明顯(P<0.05)。見表1。2.2腎絡(luò)寧的表達(dá)情況正常組大鼠腎小球中FN少量分布在系膜基質(zhì)、胞漿、基底膜。各治療組與模型組比較FN的蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05或P<0.01),3個(gè)時(shí)段內(nèi)腎絡(luò)寧組與苯那普利組之間無明顯差異,9周后腎絡(luò)寧的效果顯著優(yōu)于腎炎康復(fù)片(P<0.01)。見表2。3腎絡(luò)寧的治療及其不足腎小球硬化是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程,涉及到細(xì)胞、細(xì)胞因子和ECM等多種因素、多個(gè)環(huán)節(jié)相互作用和相互調(diào)節(jié)的復(fù)雜過程,最終結(jié)局是大量ECM堆積?？梢哉J(rèn)為,腎小球硬化是ECM沉積所致,其中FN不僅是ECM的重要成分,同時(shí)也是一種重要的調(diào)理介質(zhì),能與整合素受體結(jié)合在細(xì)胞增殖和ECM產(chǎn)生和沉積中發(fā)揮著重要介導(dǎo)作用。在腎小球硬化的形成過程有多種細(xì)胞因子參與,而TGF-β1具有重要的作用。腎小球系膜細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞及間質(zhì)成纖維細(xì)胞均能表達(dá)TGF-βmRNA,并合成TGF-β。TGF-β促進(jìn)ECM沉積,在腎臟炎癥,尤其在腎小球硬化及間質(zhì)纖維化發(fā)生上有重要作用。為了更好地研究腎絡(luò)寧防治IgA腎病腎小球硬化的效果,我們?cè)谇捌诘难芯炕A(chǔ)上采用單腎切除聯(lián)合尾靜脈注射SEB的方法制作IgA腎病模型,該方法的特點(diǎn)在于:模型制作周期短,腎小球硬化發(fā)生率高;符合人類IgA腎病的病變過程。我們?cè)诒敬螌?shí)驗(yàn)中觀察到,腎絡(luò)寧能夠有效地抑制TGF-β1和FN的表達(dá),表明其可以減少ECM的生成、降低致纖維化因子的作用,進(jìn)而達(dá)到防治IgA腎病腎小球硬化的目的。疏利少陽法是黃文政教授根據(jù)多年治療腎病的臨床經(jīng)驗(yàn),在傳統(tǒng)中醫(yī)少陽三焦氣化學(xué)說理論的基礎(chǔ)上,提出少陽三焦樞機(jī)不利為IgA腎病腎小球硬化病機(jī)關(guān)鍵,創(chuàng)立了以疏利少陽為主,融益氣養(yǎng)陰、清熱利濕、解毒泄?jié)?、活血化瘀為一體的治療方法,具有中醫(yī)理論的繼承和創(chuàng)新性,腎絡(luò)寧正是這一方法的優(yōu)化組方。該方的特點(diǎn)是清補(bǔ)清化,使益氣不過于甘溫、養(yǎng)陰不過于滋膩、清熱解毒利濕不過于苦寒、活血化瘀不過于峻猛。腎絡(luò)寧方以功能劃分為三組藥物:以柴胡、黃芩疏利少陽、清解郁熱、暢達(dá)三焦、樞轉(zhuǎn)氣機(jī),恢復(fù)三焦的網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)功能;以女貞子滋補(bǔ)肝腎之陰,生黃芪平補(bǔ)脾肺之氣,二藥相伍,使滋陰不至于呆膩、補(bǔ)氣不過于溫燥;以山楂、生側(cè)柏、萹蓄、地錦草、白花蛇舌草活血化瘀、清熱解毒利濕,清除體內(nèi)久蘊(yùn)之水濕、濕熱、瘀血等病理產(chǎn)物,恢復(fù)機(jī)體的正常代謝功能。綜觀全方,既有整體調(diào)節(jié),又有對(duì)因治療,從多臟腑,多因素的角度增強(qiáng)或恢復(fù)臟腑的氣化功能,從而達(dá)到控制并延緩疾病發(fā)展的目的。我們?cè)谇捌诘难芯恐邪l(fā)現(xiàn),腎絡(luò)寧可通過降低尿蛋白而發(fā)揮保護(hù)腎小管間質(zhì)的作用;通過降低IgA腎病模型大鼠腎間質(zhì)Col-Ⅲ蛋白的表達(dá),下調(diào)PAI-1、TIMP-1mRNA的表達(dá),上調(diào)MMP-1mRNA的表達(dá),發(fā)揮調(diào)節(jié)ECM代謝的作用;還可通過提高腎組織中抗炎癥因子IL-10蛋白及其mRNA,從而抑制活化的單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-1、IL-6、TNF-α的表達(dá),進(jìn)而抑制其刺激腎小球系膜細(xì)胞增生的作用。同時(shí),我們采用疏