藥用植物瀉提物對(duì)尿草酸鈣結(jié)晶的影響

藥用植物瀉提物對(duì)尿草酸鈣結(jié)晶的影響

尿液中草酸鈉晶體的成核、生長(zhǎng)和積聚是優(yōu)良尿草酸鈉結(jié)晶形成的主要機(jī)理。文獻(xiàn)報(bào)道澤瀉水提取液在體外能明顯抑制尿草酸鈣晶體的生長(zhǎng)和聚集。為了進(jìn)一步確定澤瀉抑制尿草酸鈣結(jié)石形成的活性成分及作用機(jī)理,我們對(duì)澤瀉提取物對(duì)尿草酸鈣結(jié)石形成的影響進(jìn)行了研究?，F(xiàn)報(bào)告如下。材料和方法一、獨(dú)立液濃縮回收將中藥澤瀉飲片制成粗粉,分別用雙蒸水、50%甲醇和純甲醇煎煮,提取液濃縮回收,制備為澤瀉水浸膏、50%甲醇浸膏和澤瀉純甲醇浸膏。用含5%乙醇和7%聚丙烯醋酸纖維素鈉溶液作為澤瀉提取物增溶劑溶解浸膏,制得濃度均相當(dāng)于1.0g澤瀉生藥/ml的3種提取物混懸液。二、采用歸澤提取物測(cè)定草酸鈣神經(jīng)生長(zhǎng)抑制活性1.草酸鈣亞穩(wěn)飽和液的制備取pH6.5Tris緩沖液48ml,加入0.03mol/L氯化鈣和0.03mol/L草酸鈉各1.0ml,混勻得0.6mmol/L的草酸鈣亞穩(wěn)飽和液50ml。2.草酸鈣晶體生長(zhǎng)抑制指數(shù)ao-at各組取50ml草酸鈣亞穩(wěn)飽和液分別加入:空白對(duì)照組(A1組),加1.0ml雙蒸水;陰性對(duì)照組(A2組),加1.0ml澤瀉提取物增溶劑;澤瀉水提取物組:C1組加0.5ml澤瀉水提取液和0.5ml雙蒸水,C2組加澤瀉水提取液1.0ml;50%甲醇提取物組:D1組加50%甲醇提取液0.5ml和0.5ml雙蒸水,D2組加50%甲醇提取液1.0ml;100%甲醇提取物組:E1組加100%甲醇提取液0.5ml和0.5ml雙蒸水,E2組加100%甲醇提取液1.0ml。C1、D1和E1組藥物終濃度為澤瀉生藥材10mg/ml,C2、D2和E2組藥物終濃度為澤瀉生藥20mg/ml。各組均在37℃恒溫振蕩10min后,分別取樣3ml經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾,均加入一水草酸鈣種晶懸液0.5ml(5mg/ml),繼續(xù)恒溫水浴振蕩3h,分別取3ml過(guò)濾。原子吸收分光光度計(jì)測(cè)前后濾液中Ca2+的吸光度(A),按[1-(Ao-At)/(Ao-Ac)]×100的公式計(jì)算各澤瀉提取液對(duì)草酸鈣晶體生長(zhǎng)的抑制指數(shù)(I.I)。式中Ao為加種晶前濾液中Ca2+吸光度;Ac、At分別為對(duì)照組(A1組)和實(shí)驗(yàn)組(A2,C1,C2,D1,D2,E1,E2組)加種晶孵育3h后濾液中Ca2+的吸光度,實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各用3管同時(shí)測(cè)定,取均值計(jì)算。三、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)1.重對(duì)大鼠臟器淋巴的增溶液和劑量8～9周齡Wistar健康雄性大鼠,體重180～220g,常規(guī)顆粒飼料喂養(yǎng)。隨機(jī)分為8組,每組10只,分別為正常對(duì)照組(A組)、成石組(B組)、澤瀉水提取液低劑量組(CL組)和高劑量組(CH組)、50%甲醇提取液低劑量組(DL組)和高劑量組(DH組)、100%甲醇提取液低劑量組(EL組)和高劑量組(EH組)。A組大鼠飲用自來(lái)水加澤瀉提取物增溶劑1.0ml/d灌胃;B組大鼠飲用1%乙二醇飲水加3%NH4Cl3.0ml每天分兩次灌胃加澤瀉提取物增溶劑1.0ml/d灌胃。其余各組均在B組(去掉澤瀉提取物增溶劑)基礎(chǔ)上給予不同劑量澤瀉提取物。CL組:澤瀉水提取液0.5g/d,CH組:澤瀉水提取液1.0g/d,DL組:50%甲醇提取液0.5g/d,DH組:50%甲醇提取液1.0g/d,EL組:100%甲醇提取液0.5g/d,EH組:100%甲醇提取液1.0g/d。2.尿尿酸檢測(cè)各組動(dòng)物均飼養(yǎng)4周,于實(shí)驗(yàn)結(jié)束前1天用代謝籠收集24h尿量。測(cè)24h尿量及尿Mg2+、Ca2+、P、BUN、Cr含量(OlympusAu1000自動(dòng)分析儀)。過(guò)氧化氫-鹽酸苯肼法測(cè)定尿草酸。處死動(dòng)物后腹腔靜脈穿刺取血,離心取血清,測(cè)血清Mg2+、Ca2+、P、BUN、Cr含量。切取雙腎縱向剖開(kāi),在解剖顯微鏡下觀察草酸鈣結(jié)晶形成情況,取右腎置10%中性福爾馬林中固定,作石蠟切片Von-Kossa染色,鏡下觀察腎小管中草酸鈣結(jié)晶分布和腎小管擴(kuò)張情況。原子吸收分光光度法測(cè)腎組織Mg2+、Ca2+和尿總Mg2+、Ca2+含量。四、統(tǒng)計(jì)分析采用SAS統(tǒng)計(jì)軟件,組間比較用方差分析,單因素方差分析檢驗(yàn)各組間差異顯著性。結(jié)果一、e組i.i比較A2、C1、C2、D1、D2、E1、E2組I.I分別為3.12%,90.56%、76.47%、74.38%、86.41%、61.17%和11.89%。二、腎組織ca2+、mg2+含量檢測(cè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中共有8只大鼠死亡,B、CL、CH、DL、EH組分別死亡2、2、1、1、2只。8組大鼠的血清生化檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可見(jiàn):A組大鼠血清BUN、Cr明顯低于其余各組(P<0.05);而Ca2+、P含量組間差異無(wú)顯著性意義(P>0.05);各澤瀉試驗(yàn)組和B組間血清BUN、Cr、Ca2+、P差異無(wú)顯著性意義(P>0.05)。8組大鼠24h尿Ox、Ca2+、Mg2+和每克濕腎組織中Ca2+、Mg2+含量結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可見(jiàn):24h尿Ox含量,A組顯著低于B組(P<0.05),各澤瀉實(shí)驗(yàn)組與B組相比雖有下降趨勢(shì),但組間差異無(wú)顯著性意義(P>0.05);在24h尿Ca2+分泌量方面,A組顯著低于B組(P<0.05),而澤瀉各實(shí)驗(yàn)組與B組之間差異無(wú)顯著性意義(P>0.05),CL和DH組僅有減少趨勢(shì);24h尿Mg2+分泌量各組間差異無(wú)顯著性意義(P>0.05)。A、CH、DL組和DH組均比B組腎組織Ca2+含量明顯降低,差異有顯著性意義(P<0.05),而其它實(shí)驗(yàn)組與B組相比差異無(wú)顯著性意義(P>0.05)。各組間腎組織Mg2+含量差異無(wú)顯著性意義(P>0.05)。各組大鼠腎臟病理切片中草酸鈣晶體形成和腎小管擴(kuò)張情況:A組大鼠腎小管未見(jiàn)擴(kuò)張和任何草酸鈣晶體沉積;B組大部分鼠腎組織腫脹,表面點(diǎn)狀分布黃白色結(jié)晶或鈣化,腎盂積水、擴(kuò)張,其內(nèi)可見(jiàn)游離結(jié)石或鈣化斑,腎小管管腔明顯擴(kuò)張,多數(shù)管腔內(nèi)存在彌漫散布無(wú)色透明草酸鈣結(jié)晶(HE切片),Van-Kossa染色呈褐黑色晶體,大多呈連續(xù)片狀結(jié)晶,皮質(zhì)多于髓質(zhì)。CL、CH組中腎小管腔內(nèi)可見(jiàn)點(diǎn)狀散在草酸鈣結(jié)晶,少見(jiàn)成片狀,管腔擴(kuò)大較B組輕。DL和DH組腎小管腔僅可見(jiàn)少許散在草酸鈣結(jié)晶存在,管腔未見(jiàn)明顯擴(kuò)張;EL、EH組腎小管中草酸鈣結(jié)晶和管腔擴(kuò)張情況與B組相似。小鼠肝腎功能損害作用機(jī)理澤瀉為澤瀉科植物,具有利水、滲濕、泄熱之功效,可與多種中草藥配伍組成方劑,用于尿石癥的治療。1985年小川由英報(bào)告豬苓湯可降低尿液中草酸排泄量和腎組織草酸含量而抑制大鼠實(shí)驗(yàn)性腎結(jié)石的形成?？敌铝⒌葎t發(fā)現(xiàn)五苓散水提液在體外和體內(nèi)對(duì)腎草酸鈣結(jié)石形成均表現(xiàn)出明顯的抑制活性,能明顯減少實(shí)驗(yàn)性腎結(jié)石大鼠腎組織中一水草酸鈣含量。澤瀉主要含有揮發(fā)油、樹(shù)脂、蛋白質(zhì)、淀粉、糖類、脂肪酸等,并分離出幾種三萜類化合物,如澤瀉醇A、澤瀉醇B、乙酸澤瀉醇A酯,乙酸澤瀉醇B酯和表澤瀉醇A等,均具有利尿和調(diào)節(jié)免疫的作用。1991年Utsunomiya等對(duì)組成豬苓湯的單味中藥進(jìn)行逐一篩選試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)澤瀉水提取液體外能明顯抑制草酸鈣結(jié)晶的生長(zhǎng)和聚集。Kawamura等通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)澤瀉水提取物能強(qiáng)烈抑制草酸鈣晶體生長(zhǎng)和聚集的作用,同時(shí)發(fā)現(xiàn)澤瀉中不含有葡胺聚糖類物質(zhì),但是澤瀉中所含相對(duì)分子質(zhì)量>10000的物質(zhì)具有強(qiáng)烈抑制草酸鈣晶體生長(zhǎng)和聚集作用。Yamaguchi等發(fā)現(xiàn)澤瀉水提取液在大鼠體內(nèi)能明顯降低腎組織鈣含量和抑制大鼠實(shí)驗(yàn)性腎草酸鈣結(jié)石形成。尹春萍等通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),隨著人工尿液的離子強(qiáng)度降低和pH值升高,澤瀉抑制草酸鈣晶體生長(zhǎng)和聚集的活性逐漸增強(qiáng),推測(cè)其作用機(jī)理可能是由于低離子強(qiáng)度和高pH值,澤瀉水提取物中活性成分吸附于草酸鈣晶體表面的能力增強(qiáng),從而導(dǎo)致抑制作用增強(qiáng)。Honda等研究發(fā)現(xiàn),健康人服用澤瀉提取物500mg/d組尿液中草酸鈣結(jié)晶比服藥前明顯縮小,表明澤瀉可增強(qiáng)人尿液對(duì)結(jié)晶生長(zhǎng)的抑制作用。研究發(fā)現(xiàn),澤瀉煮沸提取物的成分中相對(duì)分子質(zhì)量<10000及50000～300000的組分有抑制草酸鈣結(jié)晶生長(zhǎng)的作用。本研究結(jié)果顯示,澤瀉水溶性提取物及50%甲醇提取物和100%甲醇提取物低劑量均能明顯抑制草酸鈣晶體生長(zhǎng),50%甲醇提取物和100%甲醇提取物的體外抑制實(shí)驗(yàn)文獻(xiàn)未見(jiàn)報(bào)道,而水溶性提取物與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,A組大鼠血清BUN、Cr明顯低于其余各組,而Ca2+、P含量組間差異均無(wú)顯著性意義,各澤瀉試驗(yàn)組和B組間血清BUN、Cr、Ca2+、P差異無(wú)顯著性意義。表明上述實(shí)驗(yàn)濃度的甲醇提取物對(duì)大鼠腎功能有一定影響,但澤瀉不同劑量水溶性及脂溶性提取物在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)大鼠的腎功能無(wú)顯著影響,且對(duì)大鼠的Ca2+、P代謝無(wú)明顯影響。24h尿Ox含量,A組顯著低于B組,各澤瀉實(shí)驗(yàn)組與B組相比雖有下降趨勢(shì),但組間差異無(wú)顯著性,表明澤瀉對(duì)草酸的代謝無(wú)顯著性影響,這與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致。澤瀉50%甲醇溶液提取物可顯著降低實(shí)驗(yàn)性草酸鈣結(jié)石大鼠腎組織Ca2+的含量,明顯減少腎小管中草酸鈣結(jié)晶的形成,減輕腎小管的擴(kuò)張程度;澤瀉水溶性提取物高劑量組可明顯降低腎組織Ca2+的含量,對(duì)24h尿Ca2+也有減少的趨勢(shì),但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,也可一定減輕腎小管擴(kuò)張程度和草酸鈣結(jié)晶的形成;而澤瀉100%甲醇提取物組似乎沒(méi)有任何作用。我們認(rèn)為,雖然澤瀉50%甲醇提取物組體外對(duì)尿草酸鈣結(jié)晶的抑制作用不是最強(qiáng)的,但其在動(dòng)物體內(nèi)卻比水提取物和純甲醇提取物能更有效地降低腎組織Ca2+含