一株甲醛耐藥真菌的分離與培養(yǎng)

一株甲醛耐藥真菌的分離與培養(yǎng)

甲醛是一種廣泛使用的重要化工原材料，但它往往導(dǎo)致環(huán)境污染，對人們的健康和健康構(gòu)成威脅。室內(nèi)空氣甲醛污染主要來自家具和裝修用的各種人造板材,它易發(fā)生加成、氧化、還原、聚合反應(yīng),有高度的水溶性和與生物大分子的高度反應(yīng)性,甲醛在接觸部位吸收或降解,進入人體后,主要與人體的蛋白質(zhì)和核酸反應(yīng),損害DNA,引起細胞核的基因突變、DNA單鏈內(nèi)交連、DNA與蛋白質(zhì)交連、抑制DNA損傷的修復(fù);與氨基結(jié)合,改變蛋白質(zhì)的內(nèi)部結(jié)構(gòu)并凝固,擾亂人體細胞的正常代謝。它致畸、致癌,在我國有毒化學(xué)品優(yōu)先控制的名單上居第2位。統(tǒng)計顯示,中國每年有11萬人死于與室內(nèi)污染有關(guān)的疾病,北京兒童醫(yī)院經(jīng)過半年問診調(diào)查發(fā)現(xiàn):近90%的小兒白血患者家中近期都曾經(jīng)裝修過。人一生中約有80%的時間是在室內(nèi)度過,因此找到甲醛污染防治對策刻不容緩,對人類健康意義重大。甲醛降解效果研究總的來說是一個從低濃度到高濃度過程,早期人們著手于低濃度甲醛降解的研究,近年來高濃度甲醛降解時有報道。Adroer等人分離了的P.putidaA2能降解甲醛250mg·L-1,Azachi等人分離了的Halomonassp.MAC能耐受甲醛7500mg·L-1,Doronina等人研究的P.alcaligenes能降解甲醛200mg·L-1,P.putidaJ3能降解甲醛450mg·L-1,M.extorquens能降解甲醛500~1000mg·L-1;一株P(guān).alcaligenes培養(yǎng)3d后能降解甲醛2000mg·L-1,SaeedMirdamadi等人報道M.extorquens(ESS和PSS)和4株P(guān).pseudoalcaligenes(LSW,SSW,NSW,OSS)能降解甲醛1850mg·L-1,其中P.pseudoalcaligenesOSS培養(yǎng)24h將3700mg·L-1甲醛100%消耗,培養(yǎng)72h消耗5920mg·L-1甲醛70%,M.extorquensESS和M.extorquensPSS還能完全降解甲醛2960mg·L-1。Bonastre報道在ρ甲醛為2300mg·dm-3的活性淤泥做基質(zhì)的實驗里能部分的降解甲醛,甲醛能在好氧條件下被好氧菌降解,PseudomonasputidaA2當(dāng)以甲醛為碳源時降解甲醛400mg·dm-3,Zagornaya報道在活性淤泥廠的廢水處理中完全降解甲醛2300mg·dm-3和苯酚2400mg·dm-3,Yamazaki等人從海水里分離了一株甲醛耐受細菌,發(fā)現(xiàn)它在3%的氯化鈉里能降解甲醛400mg·dm-3,在MartaEiroa[12設(shè)計的模型里,指出硝化作用可以降解甲醛,當(dāng)甲醛為碳源和甲醇為伴生碳源,硝化細菌可以降解甲醛的質(zhì)量濃度是30~3890mg·dm-3,而反硝化細菌在有甲醛和甲醇存在時可以降解甲醛1360mg·dm-3。在真菌的研究方面,TetsuyaKondo等人從土壤中分離了一株甲醛耐受真菌(可以稱甲醛降解菌)AspergillusnomiusIRI013,它能生長在最高w(甲醛)=0.45%里并把它完全消耗掉。甲醛降解微生物的研究在國內(nèi)目前尚未見報道,國外甲醛降解真菌方面的研究報道也遠遠少于細菌、酵母菌等微生物,但作為微生物群體重要組成部分的真菌,其數(shù)量之龐大、種類之繁多僅次于細菌,因此應(yīng)該還有大量的甲醛降解真菌不為人們所知,本文試圖從真菌中來尋找甲醛降解菌,以期為甲醛污染防治作出一點貢獻。1材料和方法1.1no3,0.1hpo4,5.2甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液分離基本培養(yǎng)基配方為(w/%):1.0葡萄糖,0.2NaNO3,0.1K2HPO4,0.05MgSO4·7H2O,0.05KCl,0.001FeSO4·7H2O,0.01酵母膏,0.1甲醛(甲醛用市售甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液),pH6.0。1.2培養(yǎng)基平板畫線培養(yǎng)于家具廠無處理出水口處取淤泥樣,在超凈工作臺上,取10g淤泥樣置于90mL無菌水中,振蕩15min,放置20s,取1mL上清液接種于培養(yǎng)液里,在搖床上160r·min-130℃培養(yǎng)5d,生長起來的真菌再多次用PDA培養(yǎng)基平板畫線,直到分離到單菌落為止。1.3評估1.3.1培養(yǎng)基菌落特征觀察選取察氏培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基、加孟加拉紅的PDA培養(yǎng)基,將接種針經(jīng)火焰滅菌并冷卻后,蘸取極少量的孢子,點植于平板上的中間位置,將平板置于25℃培養(yǎng)8d,觀察菌落的特征。1.3.2顯微鏡觀察用解剖針從培養(yǎng)皿的菌落上,挑取少許菌體,置載玻片的水滴中,于顯微鏡下觀察其形態(tài)特征。1.3.3系統(tǒng)成分分析DNA的提取參照CTAB法進行,DNA濃度和純度的檢測,采用核酸/蛋白分析儀于NucleicAcid程序下測定。PCR采用真菌18SrDNA擴增通用引物;上游引物F1:GATCCTGCCAGTAGTCATATGC,下游引物ITS2:GCTGCGTTCTTCATCGATGC,反應(yīng)條件為94℃5min,94℃1min、56℃1min、72℃1min進行30個循環(huán)后,于72℃反應(yīng)7min。用w=1.0%的瓊脂糖凝膠電泳40min,于UVI凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果。擴增產(chǎn)物測序由上海英俊生物技術(shù)有限公司完成,測序結(jié)果在Genbank數(shù)據(jù)庫內(nèi)進行同源序列搜索(blastsearch),找出該菌株與數(shù)據(jù)庫中同源性最高的模式菌株。1.4減少二甲苯的能力1.4.1真菌生長曲線圖選取產(chǎn)孢良好的真菌,接種在ρ(甲醛)=0.1%的基本培養(yǎng)基中,于搖床上160r·min-130℃培養(yǎng)8~9d,間隔測定A475值,并記錄數(shù)據(jù),作出真菌生長曲線圖,觀察進入快速生長的時間并記錄。1.4.2生長活性的測定選取大口250mL三角瓶21個,配制液體培養(yǎng)基,ρ(甲醛)按約1100mg·L-1加入,瓶口用無菌封口培養(yǎng)膜封口(無菌封口培養(yǎng)膜是環(huán)凱公司生產(chǎn)的雙層膜,上有直徑0.6cm的圓孔兩個,中間有直徑3cm、孔徑小于0.2μm的無菌濾紙片,多用于組培生產(chǎn)),培養(yǎng)剛進入對數(shù)生長期的真菌(A475值0.167),除空白外每瓶加入5mL,置搖床上160r·min-1培養(yǎng),每天取3瓶用于測ρ(甲醛)和生長A值,其中一瓶為空白,兩瓶加一級種子菌種5mL,共取7次,A值測定用北京普析通用儀器有限責(zé)任公司TU-1800型紫外可見分光光度計,ρ(甲醛)用AHMT分光光度法檢測,測ρ(甲醛)前先離心、過濾。2結(jié)果與分析2.1培養(yǎng)基和分生孢子囊在加了孟加拉紅的PDA培養(yǎng)基上呈環(huán)狀生長(圖1),菌絲綠色,反面無色,直接鏡檢孢子著生成葡萄狀(圖4);在察氏培養(yǎng)基上生長8d,直徑可達52mm,平薄,粗糙或稍呈顆粒狀,最外緣為白色,內(nèi)部為黃色,后期稍呈綠色,干燥無滲出液,表面無輻射狀紋,反面蛋殼黃色,基質(zhì)有不規(guī)則的輻射皺折溝紋(圖2);在麥芽汁培養(yǎng)基上菌絲生長旺盛,呈棉絮狀,較厚,產(chǎn)孢后呈橄欖綠色,接種點附近下沉,呈圓形圍湖溝,有同心環(huán)狀,無滲出液,無輻射紋,反面淡黃色,有輻射皺折溝紋(圖3)。鏡檢分生孢子囊初為球形,后呈輻射狀,200~500μm,或裂成幾個疏松的柱狀體,分生孢子梗大多自基質(zhì)伸出,壁厚,粗糙;頂囊近球形,直徑23~50μm,大部分表面可育,產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)雙層,也有單雙層者;分生孢子球形,直徑2.4~4.1mm,壁稍粗糙(圖5)。2.2srdna序列該甲醛降解真菌的18SrDNA序列與黃曲霉(Aspergillusflavus)同源率達99.8%,18SrDNA序列長度為1661bp。2.3減少二甲苯的能力2.3.1接種后8h的穩(wěn)定性本實驗通過定時測定真菌在190h內(nèi)的A值,可以看出真菌在pH5.0~6.0都能很好的生長,在接種孢子后的33~48h開始進入快速生長期,在144h逐漸轉(zhuǎn)入平衡生長期。在pH5.5中,雖然接種后0hA值為0.014,比pH6.0要低(pH6.0A值為0.021),但在33h以后A值就明顯高于pH6.0和pH5.5,48~144h為快速生長期,pH5.5的A值也一直高于其余兩個(圖6)。本結(jié)果證明該真菌最適pH值為5.5,以下的實驗培養(yǎng)基pH值即調(diào)整到pH5.5。2.3.2平行誤差小空白值的結(jié)果變化不大,也就說明大約1100mg·L-1甲醛水溶液揮發(fā)不大,僅在144h時ρ(甲醛)有下降的趨勢,該真菌在144h消耗甲醛量約1237mg·L-1,平行誤差小,沒有出現(xiàn)較大的波動。在培養(yǎng)的96h內(nèi)ρ(甲醛)下降迅速,A值上升緩慢,培養(yǎng)到120h時ρ(甲醛)為10mg·L-1時,真菌A值從0.210、0.225快速上升到144h時的0.862、0.857,進入快速生長期,甲醛下降速度減緩(表1和下頁表2),原因可能是前期高濃度的甲醛抑制真菌生長,A值上升緩慢,真菌利用甲醛和葡萄糖同時為碳源,當(dāng)ρ(甲醛)下降到10mg·L-1時,甲醛也不足以抑制真菌的生長,真菌繁殖迅速,A值快速上升,真菌優(yōu)先利用葡萄糖,ρ(甲醛)下降緩慢。3分生孢子及其降解甲醛的特性該甲醛降解真菌能在甲醛培養(yǎng)基里生長,且能將高ρ(甲醛)為1241mg·L-1在培養(yǎng)144h內(nèi)降解到10mg·L-1以下。在加了孟加拉紅的PDA培養(yǎng)基上呈環(huán)狀生長,菌絲綠色,反面無色(圖1),直接鏡檢孢子著生成葡萄狀(圖4);在察氏培養(yǎng)基上生長8d,直徑可達52mm(圖2);在麥芽汁培養(yǎng)基上菌絲生長旺盛,呈棉絮狀,產(chǎn)孢后呈橄欖綠色,接種點附近下沉,呈圓形圍湖溝,有同心環(huán)狀,無滲出液,無輻射紋,反面淡黃色,有輻射皺折溝紋(圖3)。鏡檢分生孢子囊初為球形,分生孢子梗大多自基質(zhì)伸出,壁厚,粗糙,分生孢子球形,直徑2.4~4.1mm(圖5),其18SrDNA序列分析與黃曲霉(Aspergillusflavus)同源率達99.8%,我們把該真菌命名為AspergillusflavusH4。它最適pH值為pH5.5(見圖6),能降解甲醛,該真菌在144h消耗甲醛量約1237mg·L-1,平行誤差小,在培養(yǎng)的96h內(nèi)ρ(甲醛)下降迅速,A值上升緩慢,培養(yǎng)到120hρ(甲醛)為10mg·L-1時,真菌A值從0.210、0.225快速上升到0.862、0.857,進入快速生長期,甲醛下降速度減緩。AspergillusflavusH4是甲醛降解菌。4菌株、培養(yǎng)基和真菌的生長近年來微生物的多種甲醛解毒系統(tǒng)均有報道,比如甲醛固定酶,己酮糖磷酸合成酶(HPS)和己酮糖磷酸異構(gòu)酶(PHI),也屬于解毒系統(tǒng),主要是甲基細菌含有,耐熱的甲基菌BacillusbrevisS1的HPS和PHI基因表達3-己酮糖-6-磷酸酶和6-己-3-磷酸酶,磷酸核酮糖路徑操縱子編碼甲醛固定。Methylobacteriumsp.MF1是能有效降解甲醛并把它作為碳源的甲基細菌,該菌能生長在多種碳源的培養(yǎng)基上,也能生長在只有甲醛為碳源的培養(yǎng)基上。當(dāng)培養(yǎng)基使用1.2g·L-1的甲醛作為碳源時,甲醛在200h內(nèi)全部被消耗完,在有甲醇和甲醛的恒化培養(yǎng)器中分批加料培養(yǎng)時,甲醛也能被有效的消耗。Methylobacteriumsp.MF1先利用甲醇作為碳源并吸收甲醛,通過甲醇脫氫酶形成代謝媒介,甲醛被甲醛脫氫酶以NAD+為輔酶、谷胱甘肽存在的條件下被代謝掉或吸收。近年來先后報道非甲基細菌也有HPS和PHI,Bacillussubtilis在與甲醛接觸之后HPS和PHI也得到表達。MethylobacteriumextorquensAM1的轉(zhuǎn)移/水解聯(lián)合酶(Fhc)可將甲醇和甲醛氧化成CO2,產(chǎn)生甲酸