第五章 愈傷組織

愈傷組織的誘導(dǎo)與分化愈傷組織的形態(tài)發(fā)生愈傷組織培養(yǎng)的應(yīng)用愈傷組織的繼代培養(yǎng)愈傷組織培養(yǎng)第五章

愈傷組織培養(yǎng)第五章

愈傷組織培養(yǎng)自然生長的植物受損傷時，在愈合傷口處長出的一團瘤狀突起，瘤狀突起內(nèi)的細胞相對于植物體成熟細胞已發(fā)生脫分化的變化。培養(yǎng)中的愈傷組織是指從外植體的內(nèi)部或切口表面形成的一團沒有分化的組織，這種組織具有再分化的能力。愈傷組織第五章

愈傷組織培養(yǎng)愈傷組織培養(yǎng)將母體植株上的各個部分切下作為外值體，接種到無菌的培養(yǎng)基上，進行愈傷組織誘導(dǎo)、生長和發(fā)育的一門技術(shù)。一般情況下，植物組織均能誘發(fā)形成愈傷組織。愈傷組織培養(yǎng)第一節(jié)愈傷組織的誘導(dǎo)與分化愈傷組織培養(yǎng)一、愈傷組織的誘導(dǎo)二、愈傷組織細胞的分化

一、愈傷組織的誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)

植物由細胞構(gòu)成，細胞是生物結(jié)構(gòu)和生命活動的基本單位，具有全能性，即一個植物細胞能產(chǎn)生一個完整植株的固有能力，或植物細胞具有全套遺傳信息，不論是性細胞還是體細胞，在特定環(huán)境下能進行表達，而產(chǎn)生一個獨立完整的個體。

一、愈傷組織的誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)

全能性的體現(xiàn)一個已分化的細胞若要表現(xiàn)其全能性，首先要經(jīng)歷脫分化過程，然后再經(jīng)歷再分化過程。

脫分化：一個已停止分裂的成熟細胞轉(zhuǎn)變?yōu)榉稚鸂顟B(tài)，并形成未分化的愈傷組織的現(xiàn)象。

一、愈傷組織的誘導(dǎo)

不同外植體的比較：一般雙子葉植物比單子葉和裸子植物誘導(dǎo)愈傷組織容易；幼年細胞和組織比成年細胞和組織容易；二倍體細胞比單倍體細胞容易。胡蘿卜愈傷組織一、愈傷組織的誘導(dǎo)

愈傷組織培養(yǎng)

愈傷組織誘導(dǎo)條件：1、離體：擺脫了原來所受到的遺傳上的控制和生理上的制約。在一定的培養(yǎng)條件下就會發(fā)生一種回復(fù)變化，從而失去分化狀態(tài)變?yōu)榉稚毎?、培養(yǎng)條件：激素的種類和濃度，2，4－D、NAA、IAA和細胞分裂素等。3、組織的機械損傷：也作為一種刺激因素誘導(dǎo)細胞開始分裂，愈傷組織往往出現(xiàn)在傷口處。4、有些天然提取物對愈傷組織的誘導(dǎo)和維持十分有益：常用的有椰子汁（10％），0.5％的酵母提取物，5％～10％的番茄汁。二、愈傷組織細胞的分化愈傷組織培養(yǎng)再分化：愈傷組織在一定的培養(yǎng)條件下：

一、可以經(jīng)過胚胎發(fā)生形成雙極性的胚狀體，二、經(jīng)過器官發(fā)生形成單極性的芽或根，進而重新形成完整的植株，這后一段過程一般稱為再分化。二、愈傷組織細胞的分化愈傷組織培養(yǎng)

從單個細胞或外植體上形成典型的愈傷組織，大致要經(jīng)歷三個時期：

（一）誘導(dǎo)期

（二）分裂期

（三）分化期

二、愈傷組織細胞的分化愈傷組織培養(yǎng)

（一）誘導(dǎo)期：誘導(dǎo)期又稱起動期，指細胞準備進行分裂的時期。由于接種的植物材料的組成細胞通常都是成熟細胞，處在靜止狀態(tài)，一般不進行分裂。誘導(dǎo)期的長短，因植物種類和外植體的生理狀況及外部因素而異。菊芋1d，胡蘿卜幾天，不同的光照條件，誘導(dǎo)情況不同，一般弱光易于誘導(dǎo)，且分裂頻率高。特點：

1、RNA含量增加2、細胞核體積明顯增大二、愈傷組織細胞的分化愈傷組織培養(yǎng)

離體培養(yǎng)的細胞在分裂前發(fā)生的變化：

①

在切離和培養(yǎng)后較短時間內(nèi)，細胞的氣體交換迅速增加，特別是在加有生長素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，比無生長素的培養(yǎng)基中氣體交換增加一倍。②多聚核糖體不斷增加。截止M期前，每個細胞中的RNA含量增加到300％；

③蛋白質(zhì)發(fā)生周期性的積累。每個分裂細胞的總增加量約為200％；

④

酶活力也發(fā)生一定的變化。DNA復(fù)制前，DNA聚合酶活力增加；分裂前，與代謝有關(guān)的酶類，如己糖激酶和一些脫氫酶的活力也增加。

愈傷組織培養(yǎng)

（二）分裂期

分裂期指細胞通過一分為二的方式，不斷增生子細胞的過程。外植體的細胞一但經(jīng)過誘導(dǎo)，細胞脫分化，其外層細胞開始細胞分裂。

①

細胞的數(shù)目迅速增加。胡蘿卜組織培養(yǎng)7d后，細胞數(shù)可增加10倍。

②

每個細胞平均鮮重下降。這是由于鮮重的增加趕不上細胞數(shù)目的增加之故。二、愈傷組織細胞的分化愈傷組織培養(yǎng)

③

正在分裂的細胞體積小，內(nèi)無大液泡：如同根尖和莖尖的分生組織細胞一樣。

④細胞的核和核仁增大到最大。

⑤細胞中的RNA含量減少，而DNA含量保持不變。

⑥隨著細胞不斷分裂和組織生長，組織的總干重、蛋白質(zhì)和核酸含量大大增加，新細胞壁的合成極快。處于分裂期的愈傷組織的特征是：細胞分裂快，結(jié)構(gòu)疏松，缺少組織結(jié)構(gòu)，顏色淺而透明。二、愈傷組織細胞的分化愈傷組織培養(yǎng)

（三）分化期

是指停止分裂的細胞發(fā)生生理代謝變化而形成由不同形態(tài)和功能的細胞組成的愈傷組織。在細胞分裂末期，細胞內(nèi)開始發(fā)生一系列的形態(tài)和生理變化，導(dǎo)致細胞在形態(tài)和生理功能上的分化，出現(xiàn)形態(tài)和功能各異的細胞。分化期愈傷組織內(nèi)的細胞主要出現(xiàn)下列變化。二、愈傷組織細胞的分化愈傷組織培養(yǎng)

（1）細胞分裂部位和方向發(fā)生改變分裂期的細胞分裂局限在組織的外緣，主要是平周分裂；而在分化期開始后，愈傷組織表層細胞的分裂逐漸減慢，直至停止；進而轉(zhuǎn)向愈傷組織內(nèi)部深處的局部地區(qū)的細胞開始分裂，使分裂面的方向改變了，出現(xiàn)了瘤狀結(jié)構(gòu)的外表和內(nèi)部分化。二、愈傷組織細胞的分化愈傷組織培養(yǎng)

（2）分生組織瘤狀結(jié)構(gòu)和維管組織形成生長中的愈傷組織，一個共同的特征是：形成由分生組織組成的瘤狀結(jié)構(gòu)，變成不再進一步分化的生長中心，并在其周緣產(chǎn)生擴展的薄壁細胞。瘤狀結(jié)構(gòu)則成團分散分布在愈傷組織塊中。形成了維管組織，但不形成維管系統(tǒng)，而呈分散的節(jié)狀和短束狀結(jié)構(gòu)，它可由木質(zhì)部組成，也可由木質(zhì)部、韌皮部乃至形成層組成，細胞分裂素對促進組織維管化有重要作用。

二、愈傷組織細胞的分化

愈傷組織培養(yǎng)

（3）細胞的體積不再減小

愈傷組織分化時外植體細胞的大小發(fā)生十分明顯的變化，生長的愈傷組織的細胞平均大小不再減小，至此以后，保持相對不變。

（4）出現(xiàn)各種類型的細胞如薄壁細胞、分生細胞、管胞、石細胞、纖維細胞、色素細胞、毛狀細胞以及細胞絲狀體等。

（5）出現(xiàn)一定的形態(tài)特征生長旺盛的愈傷組織一般呈奶黃色或白色，有光澤，也有淡綠色或綠色的，老化的愈傷組織多轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色甚至褐色。二、愈傷組織細胞的分化愈傷組織培養(yǎng)

不同外植體來源的愈傷組織有一定的均一性。如葉柵欄組織細胞和根細胞在大小和形態(tài)上有一定的差異，但是兩者誘導(dǎo)形成的愈傷組織就失去了原有的差異，變得比較均一。

二、愈傷組織細胞的分化愈傷組織培養(yǎng)

誘導(dǎo)條件不同，愈傷組織的形態(tài)和物理性質(zhì)也有一定的變化，有的緊密堅實，有的疏松脆弱。例如，在柑橘子葉培養(yǎng)中，在MS附加1mg/lNAA與0.2mg/l6-BA的培養(yǎng)基上形成的愈傷組織緊密堅實呈瘤狀，而在MS附加0.2mg/l2,4-D與0.2mg/l6-BA培養(yǎng)基上形成的愈傷組織則疏松易脆。

二、愈傷組織細胞的分化愈傷組織培養(yǎng)

優(yōu)良的愈組織通常具備以下4個特性中的2-3個特性：1、高度的胚性或再分化能力。2、容易散碎，建立優(yōu)良的懸浮系，并能分離出全能性原生質(zhì)體。3、旺盛的自我增殖能力。4、經(jīng)過長期繼代保存而不喪失胚性，以便有可能對它們進行各種遺傳操作。

二、愈傷組織細胞的分化愈傷組織培養(yǎng)

質(zhì)地不同的兩種愈傷組織有時是可互變的，有時是不可逆的。脆性愈傷組織由松散排列的細胞組成；而堅實愈傷組織則由緊密排列的細胞組成。

加入高濃度的生長物質(zhì)，可使堅實的愈傷組織變?yōu)樗纱?；減低或除去生長物質(zhì)，則松脆愈傷組織可轉(zhuǎn)變?yōu)閳詫崱?/p>

二、愈傷組織細胞的分化愈傷組織培養(yǎng)

影響愈傷組織培養(yǎng)的主要因素：1、選擇適當?shù)幕蛐秃瓦m當?shù)耐庵搀w2、選擇正確的培養(yǎng)基，特別是正確的植物激素的種類和濃度。3、采用某些特殊的理化因素改變愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件二、愈傷組織細胞的分化愈傷組織培養(yǎng)

王海波（1991）小麥、高粱和玉米等谷物植物體細胞組織分為3種類型：1、保守分裂型：結(jié)構(gòu)致密、生長較慢、容易分化成苗。2、亢進分裂型：結(jié)構(gòu)松脆、生長旺盛、色澤鮮艷、增殖很快。3、衰敗型：結(jié)構(gòu)疏松、生長緩慢、色澤暗淡。123可在一定程度上得到控制。生長素、氨態(tài)氮等可起到明顯促進作用。細胞分裂素、硝態(tài)氮等具有抑制細胞分裂的作用。二、愈傷組織細胞的分化第二節(jié)愈傷組織的繼代培養(yǎng)愈傷組織培養(yǎng)

一、培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件二、繼代培養(yǎng)物的分化潛力愈傷組織培養(yǎng)

（一）

培養(yǎng)基

1．無機營養(yǎng)大量元素、微量元素。

2．植物生長物質(zhì)

生長素IAA、NAA、IBA、2,4-D，濃度0.1-10mg/l

細胞分裂素BA、2-ipKTZT濃度0.1-10mg/l

植物生長物質(zhì)之間的配比控制器官發(fā)生的類型

控制器官發(fā)生的類型也受絕對用量的影響，不同的生長素和細胞分裂素，對生根和長芽的效果不同。

NAA生根比IBA和IAA效果好，但用IAA和IBA生根比較健壯,而NAA生根較細。

一、培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件愈傷組織培養(yǎng)細胞分裂素和生長素使用濃度之間的關(guān)系。

細胞分裂素/生長素

一、培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件愈傷組織培養(yǎng)

3．有機成分

糖、硫胺素、煙酸、吡哆醇、肌醇、甘氨酸、水解酪蛋白、水解乳蛋白。

糖提供給外植體能量，而且還能維持一定的滲透壓。培養(yǎng)基中的滲透壓，對細胞增殖和體細胞胚的形成都有十分明顯的影響，尤其在花藥培養(yǎng)中受到重視。

不同種類和濃度的糖，對組織培養(yǎng)的增殖及以后的器官分化均有明顯影響。常用的有果糖、葡萄糖、蔗糖等，用量通常為20～70g／L。一、培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件愈傷組織培養(yǎng)

4．物理性質(zhì)

包括培養(yǎng)基的形式（固態(tài)或液態(tài)）、滲透壓和pH等方面。它對形態(tài)的發(fā)生有明顯的作用。

在胡蘿卜和石刁柏的培養(yǎng)過程中，需要改變培養(yǎng)基的形式，才能順利地分化出苗。其方法為：在誘導(dǎo)愈傷組織的第一階段，應(yīng)在固態(tài)瓊脂培養(yǎng)基上進行；而細胞和體細胞胚增殖的第二階段，應(yīng)在液態(tài)培養(yǎng)基中完成；第三階段由胚狀體發(fā)育成植株，又應(yīng)轉(zhuǎn)到固態(tài)瓊脂培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)一、培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件愈傷組織培養(yǎng)

培養(yǎng)基的水分對芽的分化有一定影響，而且往往隨培養(yǎng)基的失水和養(yǎng)分消耗而發(fā)生變化。

培養(yǎng)基的pH應(yīng)調(diào)整到5.6～6.0的范圍，過高或過低均會對組織培養(yǎng)有不利影響。一、培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件愈傷組織培養(yǎng)

（二）培養(yǎng)條件

1．光照

在組織培養(yǎng)中光對器官的作用是一種誘導(dǎo)反應(yīng)，而不是提供光合作用的能源。除某些植物組織培養(yǎng)要求在黑暗中生長外，一般均需一定的光照條件，滿足苗的形成、根的發(fā)生、芽分化和體細胞胚形成等分化和形態(tài)建成。一、培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件愈傷組織培養(yǎng)

可以通過調(diào)節(jié)光強、光照時數(shù)及光質(zhì)來滿足對光照條件的需要。

例如對短日照敏感的葡萄品種，其莖切段的組織培養(yǎng)物只有在短日照條件下才能形成根。對于煙草愈傷組織來說，要誘導(dǎo)芽的形成，有效光譜為藍光，而紅