第10章 分子雜交技術hu

第十章分子雜交技術

南昌大學生命科學學院

胡寶慶Email:baoqinghu@Tel/p>

定義：用標記的已知DNA或RNA片段（探針）來檢測樣品中未知核酸序列，通過核苷酸間堿基互補的原則發(fā)生異源性結合，再經(jīng)顯影或顯色的方法，將結合核酸序列的位置或大小顯示出來。

待測的核酸序列，可以是克隆的基因片段，也可以是未克隆化的基因組DNA和組織細胞的RNA。特點：靈敏度高（<1pg互補序列）速度快（<24h）簡單易行應用：基因克隆的篩選酶切圖譜制作基因組中特定基因序列的定量和定性檢測基因突變分析疾病的診斷、微生物病原體檢測第一節(jié)核酸雜交基本原理 第二節(jié)核酸探針標記的方法第三節(jié)幾種常見的雜交第四節(jié)其他類型雜交介紹第五節(jié)原位雜交分子雜交(簡稱雜交，hybridization)是核酸研究中一項最基本的實驗技術。原理：應用核酸分子的變性和復性的性質(zhì)，使來源不同的DNA(或RNA)片段，按堿基互補關系形成雜交雙鏈分子(heteroduplex)。雜交雙鏈可以在DNA與DNA鏈之間，也可在RNA與DNA鏈之間形成。雜交的本質(zhì)就是在一定條件下使互補核酸鏈實現(xiàn)復性。因此，變性技術也是核酸雜交的一個環(huán)節(jié)。第一節(jié)核酸分子雜交的基本原理1、變性：

在某些理化因素的作用下，核酸雙鏈分子堿基對的氫鍵斷裂，疏水作用被破壞，雙鏈螺旋或發(fā)夾結構被拆開，有規(guī)則的空間結構被破壞，形成單鏈分子，稱為核酸的變性。

引起核酸變性的因素：熱、酸、堿、化學試劑（如：尿素、甲酰胺、甲醛等）。加熱變性是最常用的方法，一般加熱80-100℃數(shù)分鐘即可使核酸分子氫鍵斷裂，雙鏈分開。變性的核酸分子失去了生物活性，同時理化性質(zhì)也隨之改變，其紫外吸收值（A260）也隨之升高?？捎米贤馕盏淖兓瘉砀橠NA的變性過程。以A260吸收值對應溫度作圖，得到DNA的變性曲線或熔解曲線。

A260值達到最大值1/2時的溫度稱為解鏈溫度或熔解溫度（meltingtemperature,Tm)，此時50%的DNA分子發(fā)生了變性。Tm與核酸的G、C含量有關。

Tm=（G+C）%×0.41+69.3Tm也受介質(zhì)中離子強度的影響，離子強度低，熔解溫度也低。

2、復性在適當條件下，變性DNA的兩條互補單鏈重新結合，形成雙鏈的過程稱為復性。在熱變性后，當溫度緩慢冷卻至比Tm值低20-30℃時，變性的單鏈DNA即可恢復雙鏈螺旋結構，這樣的復性又稱為退火。復性過程：第一步是兩條單鏈隨機碰撞形成局部雙鏈，這種局部的雙鏈是暫時的，若周圍的堿基不能配對就會重新解離，一旦找到正確的互補區(qū)，則其局部雙鏈形成核（成核反應），然后核兩側的序列迅速配對，形成完整的雙鏈分子。影響復性的因素單鏈核酸的起始濃度：反應開始時的總濃度可直接影響單鏈分子碰撞的幾率，濃度越高，復性越快。核酸鏈長度（分子量）：分子越長，擴散越慢，形成配對的難度也大，復性也慢。核酸分子的復雜性：復雜性即核酸分子中不同序列的總長度，復雜性越高，形成正確配對的難度也越大，復性越慢。溫度：溫度過高有利于變性；過低則分子運動減慢，少數(shù)堿基形成的局部雙鏈也不易解離。適宜的復性溫度是比Tm低25℃。離子強度（鹽濃度）：適當?shù)碾x子強度可中和核酸分子上磷酸基團所帶的負電，減少雙鏈間的靜電斥力，有利于復性。離子強度過高則不利于復性。分子雜交的基本過程1、樣品制備從待檢樣品提取DNA或RNA。DNA先用酶消化成大小合適的片段，然后用凝膠電泳進行分離，再將含DNA片段的凝膠做變性處理，轉膜固定。RNA樣品可直接在變性條件下電泳分離，然后轉膜固定。2、探針制備作為探針的已知DNA或RNA片段一般為30-50bp，探針上需標記上可直接檢測的元素或分子。3、雜交將處理后結合在硝酸纖維素膜上的待檢樣品與溶液中的標記探針進行雜交，雜交前要進行預雜交，即用非特異性核酸溶液封閉膜上的非特異性結合位點。4、檢測依據(jù)標記探針的方法而異，用放射自顯影或免疫組化的方法來進行檢測。影響核酸分子雜交的因素：探針濃度、長度、復雜性：探針濃度越高，復性速度越快。但雙鏈探針濃度過高會增加自我復性而影響雜交；濃度過高也會增加非特異結合，使雜交背景增強。探針越長擴散速度越慢；復雜性越高，配對難度也增大。離子強度：高離子強度溶液中，正離子可中和DNA鏈磷酸基團的負電荷，削除相互間的靜電斥力，有利于雜交分子形成。溫度：通常在低于Tm20-25℃的溫度下進行雜交。添加劑：硫酸葡聚糖、聚乙二醇、聚丙烯酸等，因其表面可吸附DNA探針，使DNA接觸面增大，而加速雜交反應。雜交條件的嚴謹性：指雜交反應體系中，避免非同源性或部分同源性的核酸序列形成雜交復合物的嚴格程度。它主要與雜交反應的溫度、離子強度和洗膜的溫度有關。實際操作時，一般采用較低嚴謹性雜交以提高反應速率，以較高嚴謹性洗膜以盡量洗去非特異性結合和配對較差的探針，以提高特異性。預雜交

為了減少探針與廣泛存在的非互補核酸的非特異性結合，在雜交前可用封閉物將這些非特異位點封閉。在雜前的這些處理過程稱為預雜交。常用于預雜交的封閉物：變性的非特異性DNA：常用鮭魚精子DNA或小牛胸腺DNA。當與濾膜一起孵育后，除濾膜上已吸附樣品DNA的區(qū)域外，它們可被吸附到所有其它區(qū)域，使整個背景覆蓋一層。由于它們與探針無同源性，在交雜反應中可大大減少探針的非特異性結合，使背影清晰。高分子化合物：某些高分子化合物具有封閉膜上非特異位點的能力。一般常用Denhard`t溶液，包括聚乙烯吡咯酮、小牛血清白蛋白、聚蔗糖。一、核酸探針定義：核酸探針是指能與特定核酸序列發(fā)生特異性互補的已知核酸片段。一般而言，核酸探針帶有特殊的標記物。第二節(jié)核酸探針標記的方法核酸探針的類型：

1、寡核苷酸探針

2、基因組DNA探針

3、cDNA探針

4、RNA探針

5、單鏈DNA探針

1、寡核苷酸探針：由實驗者設計、經(jīng)核苷酸合成儀合成。目前的合成儀均可合成70-100bp長的寡核苷酸，但一般常用的寡核苷酸針長18-30bp。優(yōu)點：（1）制備方便，實驗者可根據(jù)需要自行設計，避免了天然核酸探針存在的高度重復序列。（2）由于大多數(shù)寡核苷酸探針長度只有15-30bp，其中即使有一個堿基不配對也會顯著影響影響其熔解溫度。因此它特別適用于基因點突變分析。（3）比活度高，適用于大多數(shù)雜交，如DNA序列測定、Sounthern、Northern原位雜交等。

缺點：探針短，與靶序列形成的雜交體穩(wěn)定性差，對雜交及漂洗的溫度、鹽濃度等條件要求高，操作難度大；探針特異性差，背景噪音也大。2、基因組DNA探針：利用機械剪切或限制性內(nèi)切酶消化基因組DNA制備成一定大小的DNA片段，再將這些片段插入到適當?shù)妮d體中，轉化宿主細胞，構建成基因組DNA文庫，進而在文庫中篩選出含有目的基因的陽性克隆，經(jīng)擴增、提取DNA、酶切及電泳分離，即可得到足夠量的基因片段，經(jīng)適當?shù)臉擞浐?，即可作為探針使用。PCR方法也可制備DNA探針。在選擇此類探針時要特別注意真核基因組中存在的高度重復序列。要盡可能使用基因的編碼順序（外顯子）作為探針，而避免使用內(nèi)含子及其它非編碼順序，否則探針中可能因高度重復序列存在引起非特異性雜交而出現(xiàn)假陽性。

3、cDNA探針：由mRNA轉錄而來，在逆轉錄酶的作用下，以mRNA為模板，合成cDNA第一鏈，進而合成第二鏈。將合成的cDNA插入到適當?shù)妮d體中，構建cDNA文庫，然后篩選適當?shù)年栃钥寺?，再進一步擴增、酶切及純化該cDNA片段即可。也可利用反向技術制備，即以mRNA為模板逆轉錄合成第一鏈cDNA，然后加入一對相應于目的序列兩端的PCR引物進行PCR擴增，再電泳分離、純化，即可得到特定的cDNA片段。優(yōu)點雙鏈探針，長度較長，可與靶序列形成的雜交體穩(wěn)定性、特異性比寡核苷酸探針高，雜交信號強。缺點由于是雙鏈，必須先變性再雜交，在雜交過程中還存在自我復性現(xiàn)象。

4、RNA探針：

以雙鏈DNA為模板，利用噬菌體依賴于DNA的RNA聚合酶于體外轉錄而成。優(yōu)點①RNA/RNA比RNA/DNA雜交體系穩(wěn)定性高。②單鏈，不存在變性和自我復性。③RNA中不存在高度重復序列，非特異性雜交少。④雜交后可用RNase將未雜交的游離探針消化掉，從而使本底降低。缺點

RNA容易降解。5、單鏈DNA探針：

利用M13噬菌體載體合成。優(yōu)點無自我復性現(xiàn)象。缺點需再克隆到M13載體中雜交體不如RNA探針穩(wěn)定技術難度大探針所攜帶的標記物應具備的條件：標記后的探針的分子結構要盡可能與原來的分子結構相同，絕不影響其堿基配對特異性，不影響探針分子的主要理化特性，尤其是雜交特性。標記探針的檢測方法簡便、省時、準確可靠、重復性好、靈敏度高。穩(wěn)定性好、環(huán)境污染少、價廉。常用的探針標記物：放射性同位素：

3H、32P、35S、125I等。非放射性同位素：地高辛素、辣根過氧化酶、堿性磷酸酶等。常用的探針標記法：1、切口移位(平移)法2、引物延伸法3、末端標記法4、PCR法1切口平移法(nicktranslation)當雙鏈DNA分子的一條鏈上產(chǎn)生切口時，E.coliDNA聚合酶Ⅰ就可將核苷酸連接到切口的3‘羥基末端。該酶同時具有從5’→3‘的核酸外切酶活性，能從切口的5’端除去核苷酸。由于在切去核苷酸的同時又在切口的3‘端補上核苷酸，從而使切口沿著DNA鏈移動，用放射性核苷酸代替原先無放射性的核苷酸，將放射性同位素摻入到合成新鏈中。最合適的切口平移片段一般為50-500個核苷酸。切口移位（平移）法切口平移法現(xiàn)基本上被隨機引物法取代。切口平移法存在的主要問題是難以平衡反應中的DNA酶Ⅰ和

DNA聚合酶Ⅰ的活性，切口過多會產(chǎn)生過多的起始位點，導致大量的放射性標記物的摻入，但產(chǎn)生過短的片段，切口過少則使切口平移起始位點數(shù)目受限，而產(chǎn)生低比活性的產(chǎn)物。2引物合成法隨機引物合成雙鏈探針是使寡核苷酸引物與DNA模板結合，在Klenow酶的作用下，合成DNA探針。合成產(chǎn)物的大小、產(chǎn)量、比活性依賴于反應中模板、引物、dNTP和酶的量。通常，產(chǎn)物平均長度為400-600個核苷酸。優(yōu)點：(1)Klenow片段沒有5‘→3’外切酶活性，反應穩(wěn)定，可以獲得大量的有效探針。(2)反應時對模板的要求不嚴格，用微量制備的質(zhì)粒DNA模板也可進行反應。(3)反應產(chǎn)物的比活性較高，可達4×109cpm/μg探針。(4)隨機引物反應還可以在低熔點瓊脂糖中直接進行。隨機引物標記示意圖

用T4多核苷酸激酶標記DNa5’末端寡核苷酸探針或短的RNA和DNA探針可選用此法標記，寡核苷酸探針一般多用這種標記。T4多核苷酸激酶（polynucleotidekinase,PNK）是由T4噬菌體感染的大腸桿菌中提取的，此酶能催化ATP的γ-磷酸轉移至DNA或RNA的5’－OH末端。在過量ADP存在時，也可促進磷酸交換反應，使PNK將DNA末端5’磷酸轉移到ADP上生成ATP，然后催化[α-32P]dNTP上的標記磷酸轉移至DNA的5’末端，從而使DNA重新磷酸化，并藉此得到標記。顯然，PNK標記DNA末端需要[γ-32P]dNTP，這與前述酶促標記方法不同。通常，對于5’磷酸化的DNA探針，要先用堿性磷酸酶去掉磷酸基團，然后再用于PNK催化的5’末端標記，這樣標記效率較高。

3、末端標記法末端標記法4PCR標記法：

在PCR反應底物中，將一種dNTP換成標記的dNTP，這樣標記的dNTP就可在PCR反應的同時摻人到新合成的DNA鏈上。

四、探針的純化1、乙醇沉淀法：無水乙醇可以沉淀DNA片段，可去除dNTP和蛋白質(zhì)2、凝膠過濾柱層析法：利用凝膠的分子篩作用，將大分子DNA和小分子dNTP、磷酸根離子及寡核苷酸（<80bp)等物質(zhì)分離，常用凝膠基質(zhì)是SephadexG-503、微柱離心法：其原理與上述凝膠過濾柱層析法相同，不同的是上述采用洗脫的方式純化探針，而此法則是利用離心的方式來純化探針第三節(jié)幾種常見的雜交3.1Southern雜交3.2Northern雜交3.3菌落雜交法colonyhybridizationmethod3.4噬菌斑雜交法plaquebybridization3.5western雜交一、類型：根據(jù)反應環(huán)境分為1.固相雜交：將需要雜交的一條核酸鏈先固定 在固體支持物上，另一條核酸 鏈游離在液體中。2.液相雜交：參與反應的兩條核酸鏈都游 離在液體中。二、固體支持物種類硝酸纖維素膜、尼龍膜、乳膠顆粒、磁珠、微孔板等。選擇原則：①具有較強的結合核酸的能力；②與核酸的結合比較穩(wěn)定③盡量少的非特異性吸附5.1Southern雜交(以哺乳動物基因組DNA為例)一、待測核酸樣品的制備（一）制備待測DNA基因組DNA是從動物組織（或）細胞制備。1.采用適當?shù)幕瘜W試劑裂解細胞，或者用組織勻漿器研磨破碎組織中的細胞；2.用蛋白酶和RNA酶消化大部分蛋白質(zhì)和RNA；3.用有機試劑（酚/氯仿）抽提方法去除蛋白質(zhì)。（二）DNA限制酶消化基因組DNA很長，需要將其切割成大小不同的片段之后才能用于雜交分析，通常用限制酶消化DNA。一般選擇一種限制酶來切割DNA分子，但有時為了某些特殊的目的，分別用不同的限制酶消化基因組DNA。切割DNA的條件可根據(jù)不同目的設定，有時可采用部分和充分消化相結合的方法獲得一些具有交叉順序的DNA片段。消化DNA后，加入EDTA，65℃加熱滅活限制酶,樣品即可直接進行電泳分離，必要時可進行乙醇沉淀，濃縮DNA樣品后再進行電泳分離。二、瓊脂糖凝膠電泳分離待測DNA樣品（一）基本原理Southern印跡雜交是先將DNA樣品(含不同大小的DNA片段)先按片斷長短進行分離，然后進行雜交。這樣可確定雜交靶分子的大小。另外為了便于測定待測DNA分子量的大小或是所處的分子大小范圍，往往同時在樣品鄰近的泳道中加入已知分子量的DNA樣品即標準分子量DNA（DNAmarker）進行電泳。（二）基本步驟1.制備瓊脂糖凝膠，盡可能薄。DNA樣品與上樣緩沖液混勻，上樣。推薦使用的靶基因的上樣量見不同條件下上樣本的使用指針比較表。一般而言，對地高辛雜交系統(tǒng)，所需DNA樣品的濃度較低，每道加2.5-5μg人類基因組DNA；如果基因組比人類DNA更復雜（如植物DNA）則上樣量可達10μg；每道上質(zhì)粒DNA<1ng。2.分子質(zhì)量標志物（DIG標記）上樣。3.電泳，使DNA條帶很好的分離4.評價靶DNA的質(zhì)量。在電泳結束后，0.25-0.50μg/mlEB染色15-30min，紫外燈下觀察凝膠。三、電泳凝膠預處理（一）原理DNA樣品在制備和電泳過程中始終保持雙鏈結構。為了進行有效地實現(xiàn)Southern印跡轉移，對電泳凝膠做預處理十分必要。分子量超過10kb的較大的DNA片段與較短的小分子量DNA相比，需要更長的轉移時間。所以為了使DNA片段在合理的時間內(nèi)從凝膠中移動出來，必須將最長的DNA片段控制在大約2kb以下。DNA的大片段必須被打成缺口以縮短其長度。因此，通常是將電泳凝膠浸泡在0.25mol/L的HCl溶液短暫的脫嘌呤處理之后，移至于堿性溶液中浸泡，使DNA變性并斷裂形成較短的單鏈DNA片段，再用中性pH的緩沖液中和凝膠中的緩沖液。這樣，DNA片段經(jīng)過堿變性作用，亦會使之保持單鏈狀態(tài)而易于同探針分子發(fā)生雜交作用。（二）基本步驟1.如果靶序列>5kb，則需進行脫嘌呤處理。(1)把凝膠浸在0.25mol/LHCl中，室溫輕輕晃動，直到溴酚藍從藍變黃。注意：處理人類基因組DNA≤10分鐘；處理植物基因組DNA≤20分鐘。(2)把凝膠浸在滅菌雙蒸水中2.如果靶序列<5kb，則直接進行下面的步驟(1)把凝膠浸在變性液（0.5mol/LNaOH，1.5mol/LNaCl）中，室溫2×15分鐘，輕輕晃動。(2)把凝膠浸在滅菌雙蒸水中(3)把凝膠浸在中和液中（0.5mol/LTris-HCl，pH7.5，1.5mol/LNaCl），室溫2×15分鐘。(4)在20×SSC中平衡凝膠至少10分鐘。四、轉膜即將凝膠中的單鏈DNA片段轉移到固相支持物上。而此過程最重要的是保持各DNA片段的相對位置不變。DNA是沿與凝膠平面垂直的方向移出并轉移到膜上，因此，凝膠中的DNA片段雖然在堿變性過程已經(jīng)變性成單鏈并已斷裂，轉移后各個DNA片段在膜上的相對位置與在凝膠中的相對位置仍然一樣，故而稱為印跡（blotting）。用于轉膜的固相支持物有多種，包括硝酸纖維素膜（NC膜）、尼龍（Nylon）膜、化學活化膜和濾紙等，轉膜時可根據(jù)不同需要選擇不同的固相支持物用于雜交。其中常用的是NC膜和Nylon膜.五、探針標記用于Southern印跡雜交的探針可以是純化的DNA片段或寡核苷酸片段。探針可以用放射性物質(zhì)標記或用地高辛標記，放射性標記靈敏度高，效果好；地高辛標記沒有半衰期，安全性好。人工合成的短寡核苷酸可以用T4多聚核苷酸激酶進行末端標記。探針標記的方法有隨機引物法、切口平移法和末端標記法。六、預雜交（prehybridizafion）將固定于膜上的DNA片段與探針進行雜交之前，必須先進行一個預雜交的過程。因為能結合DNA片段的膜同樣能夠結合探針DNA，在進行雜交前，必須將膜上所有能與DNA結合的位點全部封閉，這就是預雜交的目的。預雜交是將轉印后的濾膜置于一個浸泡在水浴搖床的封閉塑料袋中進行，袋中裝有預雜交液，使預雜交液不斷在膜上流動。預雜交液實際上就是不含探針的雜交液，可以自制或從公司購買，不同的雜交液配方相差較大，雜交溫度也不同。但其中主要含有鮭魚精子DNA（該DNA與哺乳動物的同源性極低，不會與DNA探針DNA雜交）、牛血清等，這些大分子可以封閉膜上所有非特異性吸附位點。具體步驟如下：一）配制預雜交液：6XSSC，5XDenhardt’s試劑，0.5%SDS，50%(v/v)甲酰胺，ddH2O，100ug/ml鮭魚精DNA變性后加入。注：1.每平方硝酸纖維素膜需預雜交液0.2ml。2.預雜交液制備時可用或不用poly(A)RNA。3.當使用32P標記的cDNA作探針時，可以在預雜交液或雜交液中加入poly(A)RNA以避免探針同真核生物DNA中普遍存在的富含胸腺嘧啶的序列結合。4.按照探針、靶基因和雜交液的特性確定合適的雜交溫度（Thyb）。（如果使用標準雜交液，靶序列DNAGC含量為40%，則Thyb為42℃。）（二）把預雜交液放在滅菌的塑料瓶中，在水浴中預熱至雜交溫度。（三）將表面帶有目的DNA的硝酸纖維素濾膜放入一個稍寬于濾膜的塑料袋，用5-10ml2×SSC浸濕濾膜。（四）將鮭魚精DNA置沸水浴中10min，迅速置冰上冷卻1-2min，使DNA變性。（五）從塑料袋中除凈2×SSC，加入預雜交液，按每平方濾膜加0.2ml。（六）加入變性的鮭魚精DNA置終濃度200μg/ml。（七）盡可能除凈袋中的空氣，用熱封口器封住袋口，上下顛倒數(shù)次以使其混勻，置于42℃水浴中溫育4h.七、Southern雜交（一）原理轉印后的濾膜在預雜交液中溫育4-6h，即可加入標記的探針DNA（探針DNA預先經(jīng)加熱變性成為單鏈DNA分子），即可進行雜交反應。雜交是在相對高離子強度的緩沖鹽溶液中進行。雜交過夜，然后在較高溫度下用鹽溶液洗膜。離子強度越低，溫度越高，雜交的嚴格程度越高，也就是說，只有探針和待測順序之間有非常高的同源性時，才能在低鹽高溫的雜交條件下結合。（二）步驟1.將標記的DNA探針置沸水浴10min，迅速置冰上冷卻1-2min，使DNA變性。2.從水浴中取出含有濾膜和預雜交液的塑料袋，剪開一角，將變性的DNA探針加到預雜交液中。3.盡可能除取袋中的空氣，封住袋口，滯留在袋中的氣泡要盡可能地少，為避免同位素污染水浴，將封好的雜交袋再封入另一個未污染的塑料袋內(nèi)。4.置42℃水浴溫育過夜（至少18h）。八、洗膜取出NC膜，在2XSSC溶液中漂洗5min，然后按照下列條件洗膜：2×SSC/0.1%SDS，42℃，10min，1S×SCC/0.1%SDS，42℃，10min，0.5S×SCC/0.1%SDS，42℃，10min，0.2×SSC/0.1%SDS，56℃，10min，0.1×SSC/0.1%SDS，56℃，10min。采用核素標記的探針或發(fā)光劑標記的探針進行雜交還需注意的關鍵一步就是洗膜。在洗膜過程中，要不斷振蕩，不斷用放射性檢測儀探測膜上的放射強度。當放射強度指示數(shù)值較環(huán)境背景高1-2倍時，即停止洗膜。洗完的膜浸入2×SSC中2min，取出膜，用濾紙吸干膜表面的水分，并用保鮮膜包裹。注意保鮮膜與NC膜之間不能有氣泡。九、放射性自顯影檢測（一）將濾膜正面向上，放入暗盒中（加雙側增感屏）。（二）在暗室內(nèi)，將2張X光底片放入曝光暗盒，并用透明膠代固定，合上暗盒。（三）將暗盒置-70℃低溫冰箱中使濾膜對X光底片曝光（根據(jù)信號強弱決定曝光時間，一般在1-3天）。（四）從冰箱中取出暗盒，置室溫1-2h，使其溫度上升至室溫，然后沖洗X光底片（洗片時先洗一張，若感光偏弱，則在多加兩天曝光時間，再洗第二張片子）。（注：注意同位素的安全使用）雜交流程示意圖Southern雜交能否檢出雜交信號取決于很多因素,包括目的DNA在總DNA中所占的比例、探針的大小和比活性、轉移到濾膜上的DNA量以及探針與目的DNA間的配對情況等。在最佳條件下，放射自顯影曝光數(shù)天后，Southern雜交能很靈敏地檢測出低于0.1pg與32P標記的高比活性探針的(>109cpm/μg)互補DNA。如果將10μg基因組DNA轉移到濾膜上，并與長度為幾百個核苷酸的探針雜交，曝光過夜，則可檢測出哺乳動物基因組中1kb大小的單拷貝序列。Southern雜交的用途：進行克隆基因的酶切圖譜分析、基因組DNA的定性、定量分析、基因突變分析及限制性片段長度多態(tài)性分析。DNA從凝膠中轉移到固體支持物上有3種方法:(1)毛細管轉移本方法由Southern發(fā)明，故又稱為Southern轉移(或印跡)。優(yōu)點：簡單，不需要用其他儀器。缺點：轉移時間較長，轉移后雜交信號較弱。(2)真空轉移將硝酸纖維素膜或尼龍膜放在真空室上面的多孔屏上，再將凝膠置于濾膜上，緩沖液從上面的一個貯液槽中流下，洗脫出凝膠中的DNA，使其沉積在濾膜上。優(yōu)點：快速，在30分鐘內(nèi)就能從正常厚度(4-5mm)和正常瓊脂糖濃度(<1%)的凝膠中定量地轉移出來。轉移后得到的雜交信號比Southern轉移強2-3倍。缺點：如不小心，會使凝膠碎裂,并且在洗膜不嚴格時，其背景比毛細轉移要高。(3)電泳轉移將DNA變性后,可電泳轉移至帶電荷的尼龍膜上。優(yōu)點:不需要脫嘌呤/水解作用，可直接轉移較大的DNA片段。缺點：轉移中電流較大，溫度難以控制。通常只有當毛細管轉移和真空轉移無效時，才采用電泳轉移5.2Northern雜交Northern印跡雜交（Northernblot）。這是一種將RNA從瓊脂糖凝膠中轉印到硝酸纖維素膜上的方法。DNA印跡技術由Southern于1975年創(chuàng)建，稱為Southern印跡技術，RNA印跡技術正好與DNA相對應，故被稱為Northern印跡雜交，與此原理相似的蛋白質(zhì)印跡技術則被稱為Westernblot。Northern印跡雜交的RNA吸印與Southern印跡雜交的DNA吸印方法類似，只是在上樣前用甲基氫氧化銀、乙二醛或甲醛使RNA變性，而不用NaOH，因為它會水解RNA的2'-羥基基團。RNA變性后有利于在轉印過程中與硝酸纖維素膜結合，它同樣可在高鹽中進行轉印，但在烘烤前與膜結合得并不牢固，所以在轉印后用低鹽緩沖液洗脫，否則RNA會被洗脫。在膠中不能加EB，因為它會影響RNA與硝酸纖維素膜的結合。為測定片段大小，可在同一塊膠上加分子量標記物一同電泳，之后將標記物切下、上色、照相，樣品膠則進行Northern轉印。標記物膠上色的方法是在暗室中將其浸在含5μg/mlEB的0.1mol/L醋酸銨中10min，光在水中就可脫色，在紫外光下用一次成像相機拍照時，上色的RNA膠要盡可能少接觸紫外光，若接觸太多或在白熾燈下暴露過久，會使RNA信號降低。瓊脂糖凝膠中分離功能完整的mRNA時，甲基氫氧化銀是一種強力、可逆變性劑，但是有毒，因而許多人喜用甲醛作為變性劑。所有操作均應避免RNase的污染。RNA甲醛凝膠電泳和吸印方法<1>試劑10×MSE緩沖液：0.2mol/L嗎啉代丙烷磺酸（MOPS），pH7.0，50mmol/L醋酸鈉，1mmol/LEDTApH8.0。5×載樣緩沖液：50%甘油，1mmol/LEDTA，0.4%溴酚藍。甲醛：用水配成37%濃度（12.3mol/L），應在通風柜中操作，pH高于4.0。20×SSC；去離子甲酰胺；50mmol/LNaOH(含10mmol/LNaCl)；0.1mol/LTris，pH7.5。<2>步驟[1]40ml水中加7g瓊脂糖，煮沸溶解，冷卻到60℃，加7ml10×MSE緩沖液，11.5ml甲醛，加水定容至70ml，混勻后倒入盛膠槽。

[2]等膠凝固后，去掉梳子和膠布，將盛膠槽放入1×MSE緩沖液的電泳槽。[3]使RNA變性（最多20μg），RNA4.5ml,10×MSE緩沖液20ml，甲醛3.5ml，去離子甲酰胺10ml。

[4]55℃加熱15min，冰浴冷卻。

[5]加2ml5×載樣緩沖液。

[6]上樣、同時加RNA標記物（同位素（32P）dCTP）。

[7]60伏電泳過夜。

[8]取出凝膠，水中浸泡2次，每次5min。

[9]室溫下將膠浸到50mmol/LNaOH和10mmol/LNaCl中45min，水解高分子RNA，以增強轉印。

[10]室溫下將膠浸到0.1mmol/LTrisHCl(pH7.5)中45min,使膠中和。

[11]20×SSC洗膠1h。

[12]20×SSC中過夜轉印到硝酸纖維素膜上。[13]取出硝酸纖維素膜，80℃真空烘烤2h。在紫外光下用一次成像相機拍照時，上色的RNA膠要盡可能少接觸紫外光，若接觸太多或白熾燈下暴露過久，會使RNA信號降低。從瓊脂糖凝膠中分離功能完整的mRNA時，甲基氫氧化汞是一種強力、可逆變性劑，但是有毒，因而許多人喜用甲醛作為變性劑。所有操作均應避免RNase的污染。5.3菌落雜交法colonyhybridizationmethod對分散在若干個瓊脂平板上的少數(shù)菌落（100~200）進行克隆篩選時，可采用本方法。將這些菌落歸并到一個瓊脂主平板，第二個瓊脂平板表面鋪一張硝酸纖維素濾膜。經(jīng)培養(yǎng)一段時間后，對菌落進行原位裂解。主平板應貯存于4℃直至得到篩選結果。5.4噬菌斑雜交法plaquebybridization噬菌體為載體進行DNA克隆繁殖時所常用的方法。把基因組中含有特定堿基序列的噬菌體，通過核酸雜交，從多數(shù)噬菌體的噬菌斑中選出的方法。將在瓊脂培養(yǎng)基上形成的噬菌體的噬菌斑，移于硝酸纖維素濾紙上，堿處理使噬菌體DNA變性；DNA固定于硝酸纖維素濾紙上，與用放射性同位素標記的特定的RNA或DNA片段進行雜交；通過放射自顯影法來識別含有所需DNA序列的噬菌體的噬菌斑，并從原來的瓊脂培養(yǎng)基中選出與其對應的噬菌斑。5.5斑點雜交（dothybridization）斑點雜交是指將DNA或RNA樣品直接點在硝酸纖維素濾膜上，然后與核酸探針分子雜交，以顯示樣品中是否存在特異的DNA或RNA。同一種樣品經(jīng)不同倍數(shù)的稀釋，還可以得到半定量的結果。簡便、快速、經(jīng)濟的分析DNA或RNA的方法，在基因分析和基因診斷中經(jīng)常用到，是研究基因表達的有力工具。目的序列未與非目的序列分離，不能了解目的序列的長度。尤其當本底干擾較高時，難以區(qū)分目的序列信號和干擾信號。5.5.1DNA斑點雜交①先將膜在水中浸濕，再放到15×SSC中。②將DNA樣品溶于水或TE，煮沸5min，冰中速冷。③用鉛筆在濾膜上標好位置，將DNA點樣于膜上，每個樣品一般點5μl(2~10μgDNA)。④將膜烘干，密封保存?zhèn)溆谩?.5.2RNA斑點雜交與DNA斑點雜交類似，每個樣品至多加10μg總RNA（經(jīng)酚/氯仿或異硫氰酸胍提取純化）方法：將RNA溶于5μlDEPC水，加5μl甲醛/SSC緩沖液（10×SSC中含6.15mol/L甲醛），使RNA變性，然后取5-8μl點樣于處理好的濾膜上，烘干。細胞標本處理技術可以簡化，不用提取和純化RNA。方法：用含0.5%NonidetP40的低滲緩沖液對多種動物細胞作簡單處理，離心去掉細胞核和細胞碎片，就得到基本不帶DNA而富含RNA的細胞質(zhì)提取物，這一粗RNA在高鹽下用甲醛變性，不需加工直接點到硝酸纖維素膜上。本法可以快速檢測大量標本，而只需極少量的細胞（5×104）或組織。整個RNA實驗中，要防止激活內(nèi)源性RNase，有許多種預防措施，有一種是在樣品中加入核糖核苷氧礬基復合物（RVC）。5.5.3完整細胞斑點雜交類似檢測細菌菌落，將整個細胞點到膜上，經(jīng)NaOH處理，使DNA暴露、變性和固定，再按常規(guī)方法進行雜交與檢測。有人曾用此法從105個培養(yǎng)細胞中檢測到至少5pg的Epstein-Barr病毒DNA?？梢杂糜诤Y選大量標本，因為它使細胞直接在膜上溶解，所以DNA含量甚至比常用的提取法還高，又不影響與32P標記的探針雜交。不適用于非放射性標記探針，因為DNA純度不夠，會產(chǎn)生高本底。五、Western雜交

Western雜交是將蛋白質(zhì)電泳、印跡、免疫測定融為一體的特異性蛋白質(zhì)的檢測方法。其原理是：生物中含有一定量的目的蛋白。先從生物細胞中提取總蛋白或目的蛋白，將蛋白質(zhì)樣品溶解于含有去污劑和還原劑的溶液中，經(jīng)SDS電泳將蛋白質(zhì)按分子量大小分離，再把分離的各蛋白質(zhì)條帶原位轉移到固相膜（硝酸纖維素膜或尼龍膜）上，接著將膜浸泡在高濃度的蛋白質(zhì)溶液中溫育，以封閉其非特異性位點。然后加入特異抗性體（一抗），膜上的目的蛋白（抗原）與一抗結合后，再加入能與一抗專一性結合的帶標記的二抗（通常一抗用兔來源的抗體時，二抗常用羊抗兔免疫球蛋白抗體），最后通過二抗上帶標記化合物（一般為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶）的特異性反應進行檢測。根據(jù)檢測結果，從而可得知被檢生物（植物）細胞內(nèi)目的蛋白的表達與否、表達量及分子量等情況。Western

雜交技術是一種蛋白質(zhì)的固定和分析技術，是將已用聚丙烯酰胺凝膠或其它凝膠或電泳分離的蛋白質(zhì)轉移到硝酸纖維濾膜上，固定在濾膜上的蛋白質(zhì)成分仍保留抗原活性及與其它大分子特異性結合的能力，所以能與特異性抗體或核酸結合，其程序SouthernBlot相似，故稱為WesternBlot,第一抗體與膜上特異抗原結合后，再用標記的二抗(同位素或非同位素的酶)來檢測，此方法可檢測1ng抗原蛋白。Western雜交方法靈敏度高，通常可從植物總蛋白中檢測出50ng的特異性的目的蛋白。試劑配制(1)轉移電泳緩沖液：20mmol/LTrisHCLpH8.0150mmol/L

甘氨酸加14.5gTris粉67.08g甘氨酸于4L水中，加入1200mL甲醇，加水至6L(2)麗春紅S溶液：0.5%麗春紅S1%乙酸操作步驟(1)用已制備好的SDS分離的蛋白凝膠。(2)用一張濾紙，剪成與膠同樣大小，在轉移電泳緩沖液中預濕，放在Scotch-BritPad上，在膠的陰性端放上濾紙，膠的表面用該緩沖液浸濕，排出所有氣泡。(3)在膠的陽極面放置同樣大小浸濕的硝酸纖維素膜，排出氣泡，再在濾膜的陽極端放置一張濾紙，排出氣泡，再放一個Scotch-BritPad。(4)將以上“三明治”樣裝置放入一個塑料支撐物中間，將支撐物放入電轉移裝置中，加入電轉移緩沖液。(5)接通電源：使膠上的蛋白轉移到硝酸纖維素膜上，電壓為14V4℃轉移4小時或過夜。(6)將濾膜放入麗春紅S溶液中5分鐘，蛋白染色水中脫色2分鐘，照像，用印度墨水將分子量標準染色，在水中完全脫色。(7)將濾膜放在塑料袋中，每3張加入5mL封閉緩沖液(1克速溶去脂奶粉溶于100mlPBS中)，封閉特異性抗體結合位點，室溫1h，搖動，倒出封閉緩沖液。(8)在封閉緩沖液中稀釋第一抗體，加入后室溫放置1小時，將濾膜轉到塑料盒中，用200mLPBS洗四次，搖動。(9)在封閉緩沖液中稀釋辣根過氧化物酶標記的二抗，重復步驟8。(10)將濾膜放在100mL新配制的DAB底物溶液中，大約2～3分鐘就可顯色，用水沖洗終止反應、照像。結果分析：分析陽性(顯色)條帶的分子量大小，而且根據(jù)信號(顏色)強弱分析蛋白表達量WestBlot雜交（一抗與特定蛋白結合）漂洗去除多余的一抗二抗與一抗結合漂洗去多余的二抗結果檢測第四節(jié)原位雜交4.1原位核酸分子雜交技術的發(fā)展4.2原位分子雜交技術的基本方法4.3RNA原位核酸雜交4.4雙重原位雜交方法4.5原位雜交的PCR增敏法4.6原位雜交的CSA增敏法原位核酸分子雜交技術簡稱原位雜交(insituhybridizationISH)是應用已知堿基順序并帶有標記物的核酸探針與組織、細胞中待檢測的核酸按堿基配對的原則進行特異性結合而形成雜交體；然后再應用與標記物相應的檢測系統(tǒng)，通過組織化學或免疫組織化學方法在被檢測的核酸原位形成帶顏色的雜交信號，在顯微鏡或電子顯微鏡下進行細胞內(nèi)定位。4.1原位核酸分子雜交技術的發(fā)展1969年，美國耶魯大學Gall和Pardue創(chuàng)立原位雜交，他們用爪蟾核糖體基因探針與其卵母細胞雜交，確定該基因定位于卵母細胞的核仁中。與此同時，BuongiornoNardelli和Amaldi,John及其同事等相繼利用同位素標記核酸探針進行了細胞或組織的基因定位。1970年，Orth應用3H標記的兔乳頭狀瘤病毒cRNA探針與兔乳頭狀瘤組織的冰凍切片進行雜交，首次用原位雜交技術檢出了病毒DNA在細胞中的定位。1981年，Bauman等首先應用熒光素標記cRNA探針做原位雜交，然后用熒光顯微鏡觀察獲得成功。1982年，Shroyer報道用2，4二硝基苯甲醛(DNP)標記DNA探針，使該DNA探針具有抗原性，然后用兔抗DNP的酶標抗體來識別雜交后的探針，最后經(jīng)免疫過氧化物酶組織化學的方法顯示雜交信號。1983年，Brigat首先建立生物素標記的探針在組織切片上檢出了病毒DNA，通過生物素與抗生物素結合，過氧化物酶抗過氧化物酶顯示系統(tǒng)顯示病毒DNA在細胞中的定位，生物素標記探針技術目前已被廣泛應用，特別是在病毒學和病理學的臨床診斷中。1987年，地高辛標記的有關試劑及藥盒被投放市場，和其它非放射性標記物一樣，地高辛較放射性標記系統(tǒng)安全，方便、省時間。同時在敏感性和質(zhì)量控制方面比生物素標記技術要優(yōu)越，地高辛標記法顯示的顏色為紫藍色(標記堿性磷酸酶抗堿性磷酸酶顯色系統(tǒng))，有較好的反差背景，更有利于與免疫組織化學相結合，同時可以檢測基因表達。4.2原位分子雜交技術的基本方法原位雜交技術的基本方法包括：①雜交前準備，包括固定、取材、玻片和組織的處理，如何增強核酸探針的穿透性、減低背景染色等；②雜交；③雜交后處理；④顯示(visualization)：包括放射自顯影和非放射性標記的組織化學或免疫組織化學顯色。4.2.1固定固定的目的是為了保持細胞形態(tài)結構，最大限度地保存細胞內(nèi)的DNA或RNA的水平；使探針易于進入細胞或組織。對于DNA的定位來說，固定劑的種類和濃度并不十分重要。相反，在RNA的定位上，如果要使RNA的降解減少到最低限度，那么，不僅固定劑的種類濃度和固定的時間十分重要，而且取材后應盡快予以冷凍或固定。(1)最常用多聚甲醛固定組織，因其不會與蛋白質(zhì)產(chǎn)生廣泛的交叉連接，不會影響探針穿透入細胞或組織。(2)醋酸-酒精的混合液和Bouin′s固定劑也能獲得較滿意的效果。(3)mRNA定位，將組織固定于4%多聚甲醛磷酸緩沖液中1~2h，冷凍前浸入15%蔗糖溶液置4℃冰箱過夜，次日切片或保存在液氮中待恒冷箱切片機或振蕩切片機切片。(4)組織也可在取材后直接置入液氮冷凍，切片后才將其浸入4%多聚甲醛約10min，空氣干燥后保存在-70℃。如冰箱溫度恒定，在-70℃切片可保存數(shù)月之久不會影響雜交結果。在病理學活檢取材時多用福爾馬林固定和石蠟包埋，這種標本對檢測DNA和mRNA有時也可獲得雜交信號；石蠟包埋切片由于與蛋白質(zhì)交聯(lián)的增加，影響核酸探針的穿透，因而雜交信號常低于冰凍切片。同時，在包埋的過程中可減低mRNA的含量。各種固定劑均有各自的優(yōu)缺點：沉淀性(Precipitating)固定劑：酒精/醋酸混合液、Bouin′s液、Carnoy′s液等能為增加核酸探針的穿透性提供最佳條件，但它們不能最大限度地保存RNA，而且對組織結構有損傷。戊二醛較好地保存RNA和組織形態(tài)結構，但由于和蛋白質(zhì)產(chǎn)生廣泛的交聯(lián)，從而大大地影響了核酸探針的穿透性。4.2.2玻片和組織切片的處理

玻片的處理玻片包括蓋片和載玻片應用熱肥皂水刷洗，自來水清洗干凈后，置于清潔液中浸泡24h，清水洗凈烘干，95%酒精中浸泡24h后蒸餾水沖洗、烘干、烘箱溫度最好在150℃或以上過夜以去除任何RNA酶。蓋玻片在有條件時最好用硅化處理，錫箔紙包裹無塵存放。用粘附劑預先涂抹在玻片上，干燥后待切片時應用，以保證在整個實驗過程中切片不致脫落。常用的粘附劑有鉻礬明膠液，其優(yōu)點是價廉易得，粘附效果較差。多聚賴氨酸液具有較好的粘附效果，但價格昂貴。新粘附劑APES粘附效果好，價格較多聚賴氨酸便宜，制片后可長期保存應用。

增強組織的通透性和核酸探針的穿透性增強組織通透性常用的方法如應用稀釋的酸洗滌、去垢劑(detergent)或稱清洗劑TritonX100、酒精或某些消化酶如蛋白酶K，胃蛋白酶、胰蛋白酶、膠原蛋白酶和淀粉酶(diastase)等。這種廣泛的去蛋白作用無凝可增強組織的通透性和核酸探針的穿透性，提高雜交信號，但同時也會減低RNA的保存量和影響組織結構的形態(tài)，因此，在用量及孵育時間上應填為掌握。

減低背景染色背景染色的形成是諸多因素構成的。雜交后的酶處理和雜交后的洗滌均有助于減低背景染色。在多聚甲醛固定后，浸入乙酸酐和三乙醇胺中以減低靜電效應，減少探針對組織的非特異性背景染色。預雜交是減低背景染色的一種有效手段。預雜交液和雜交液的區(qū)別在于前者不含探針和硫酸葡聚糖。將組織切片浸入預雜交液中可達到封閉非特異性雜交點的目的，從而減低背景染色。在雜交后洗滌中采用低濃度的RNA酶溶液(20μg/ml)洗滌一次，以減低殘留的內(nèi)源性的RNA酶，減低背景染色。

防止RNA酶的污染由于在手指皮膚及實驗用玻璃皿上均可能有RNA酶，為防止其污染影響實驗結果，在整個雜交前處理過程都需戴消毒手套。所有實驗用玻璃器皿及鑷子都應于實驗前一日置高溫(240℃)烘烤以達到消除RNA酶的目的。要破壞RNA酶，其最低溫度必需在150℃左右。4.2.3雜交雜交是將雜交液滴于切片組織上，加蓋硅化的蓋玻片，或采用無菌的蠟膜代替硅化的蓋玻片，加蓋片防止孵育過程中雜交液的蒸發(fā)。在蓋玻片周圍加液體石蠟封固或加橡皮泥封固。硅化的蓋玻片的優(yōu)點是清潔無雜質(zhì)，光滑不會產(chǎn)生氣泡和影響組織切片與雜交液的接觸，蓋玻片自身有一定重量能使有限的雜交液均勻覆蓋?？蓪陀泄杌w玻片進行雜交的載玻片放在盛有少量5×SSC或2×SSC(standardsalinecitrate,SSC)溶液的濕盒中進行孵育。4.2.4雜交后處理(Posthybridisationtreatment)雜交后處理包括系列不同濃度，不同溫度的鹽溶液的漂洗。一般遵循的共同原則是鹽溶液濃度由高到低而溫度由低到高。大多數(shù)的原位雜交實驗是在低嚴格度條件下進行的，非特異性的探針片段粘附在組織切片上，從而增強了背景染色。RNA探針雜交時產(chǎn)生的背景染色特別高，能通過雜交后的洗滌有效減低背景染色，獲得較好的反差效果。在雜交后漂洗中的RNA酶液洗滌能將組織切片中非堿基配對RNA除去。4.2.5顯示(Visualization)顯示又可稱為檢測系統(tǒng)(Detectionsystem)。根據(jù)核酸探針標記物的種類分別進