第十章核技術(shù)在生物技術(shù)中的應(yīng)用

核技術(shù)在生物技術(shù)中的應(yīng)用

第一節(jié)

核技術(shù)在核酸分子雜交中的應(yīng)用一、核酸分子雜交的一般原理

核酸分子雜交技術(shù)：

具一定同源性的兩條(DNA或RNA)單鏈在適宜的溫度及離子強(qiáng)度等條件下,可按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則特異性地復(fù)性，形成雙鏈。探針(已知核酸片斷，單鏈)待測(cè)核苷酸序列(單鏈)

核酸分子雜交技術(shù)，是在1968年由華盛頓卡內(nèi)基學(xué)院（CarnegieInstituteofWashington）的RoyBritten及其同事發(fā)明的。所依據(jù)的原理是，帶有互補(bǔ)的特定核苷酸序列的單鏈DNA或RNA，當(dāng)它們混合在一起時(shí)，其相應(yīng)的同源區(qū)段將會(huì)退火形成雙鏈的結(jié)構(gòu)。

一、核酸分子雜交的一般原理

一、核酸分子雜交的一般原理

DNA變性方法熱變性：90~100℃酸堿變性：常采用堿變性化學(xué)試劑變性：尿素、甲酰胺、甲醛等特點(diǎn)：粘度增加、密度增加、增色效應(yīng)、溶解溫度(meltingtemperature,Tm)DNA復(fù)性或雜交(hybridization)DNA/DNA,DNA/RNA,RNA/RNA等二、核酸分子雜交的基本類型

Southern印跡法Northern印跡法Western印跡法原位雜交斑點(diǎn)印跡雜交液相雜交SouthernDNA印跡雜交

使在電泳凝膠中分離的DNA片段轉(zhuǎn)移并結(jié)合在適當(dāng)?shù)臑V膜上，然后通過(guò)同標(biāo)記的單鏈DNA或RNA探針的雜交作用檢測(cè)這些被轉(zhuǎn)移的DNA片段，這種實(shí)驗(yàn)方法叫做DNA印跡雜交技術(shù)。由于它是由英國(guó)人EdwinMellorSouthern于1975年首先設(shè)計(jì)出來(lái)的，故又叫Southernblot。二、核酸分子雜交的基本類型

二、核酸分子雜交的基本類型

Southern雜交的主要步驟待測(cè)DNA樣品的制備、酶切待測(cè)DNA樣品的電泳分離：瓊脂糖凝膠電泳凝膠中DNA的變性：堿變性Southern轉(zhuǎn)膜：硝酸纖維素(NC)膜、尼龍膜毛細(xì)管虹吸印跡法、電轉(zhuǎn)印法、真空轉(zhuǎn)移法探針的制備

Southern雜交雜交結(jié)果的檢測(cè)（a）（b）（c）（d）（e）基因組DNADNA限制片段硝酸纖維素濾膜同探針同源雜交的基因DNA片段X光底片二、核酸分子雜交的基本類型

DNA凝膠電泳SouthernDNA印跡雜交之X光顯像圖片水稻（OryzasativaL.)的葉綠體DNA分別用核酸內(nèi)切限制酶BglⅡ(A-C)、BamHⅠ（D-F）、EcoRⅠ（G-I）、和HindⅢ（J-L）消化，加樣在含有EtBr染料的1%的瓊脂糖凝膠電泳中作電泳分離，然后同32P標(biāo)記的玉米psbA探針作Southern雜交。X光底片中顯現(xiàn)的陽(yáng)性條帶，表明含有水稻的psbA基因序列二、核酸分子雜交的基本類型

Northern雜交*1979年，J.C.Alwine等人發(fā)展而來(lái)，是將RNA分子從電泳凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或其他化學(xué)修飾的活性濾紙上，進(jìn)行核酸雜交的一種實(shí)驗(yàn)方法。也稱為Northern印跡（NorthernBlot），用以檢測(cè)某一特定的RNA（通常是mRNA）片段的存在及表達(dá)量。*因這種方法與Southernblot雜交技術(shù)十分類似，與DNA的雜交（Southern雜交）相對(duì)應(yīng)，被趣稱為Northern雜交。二、核酸分子雜交的基本類型

Northern印跡雜交

1、基本原理和基本過(guò)程與Southernblot基本相同

2、鑒別RNA3、探針可用DNA或RNA片段

4、待測(cè)樣品為總RNA或mRNANorthern印跡與Southern印跡的不同點(diǎn)

1、變性：RNA電泳前加熱變性、電泳時(shí)加變性劑保持RNA處于變性狀態(tài)，DNA電泳前和電泳中不變性與Southern印跡雜交不同之處：

RNA電泳避免單鏈RNA自身形成高級(jí)結(jié)構(gòu)和自身降解

變性凝膠電泳(甲醛、尿素、甲酰胺等)RNase抑制環(huán)境二、核酸分子雜交的基本類型

2、轉(zhuǎn)膜：RNA轉(zhuǎn)膜前不需變性和中和處理,Southern印跡時(shí)，DNA轉(zhuǎn)膜前需進(jìn)行堿變性及中和處理

3、靶核酸為RNA二、核酸分子雜交的基本類型

斑點(diǎn)及狹縫印跡雜交

1、斑點(diǎn)印跡為圓形

2、狹縫印跡為線狀

3、鑒別DNA、RNA4、簡(jiǎn)單、快速，同一張膜可檢測(cè)多個(gè)樣品

5、特異性不高、不能鑒別核酸分子量二、核酸分子雜交的基本類型

斑點(diǎn)印跡雜交(dotbloting)將RNA或DNA變性后直接點(diǎn)樣于NC膜或尼龍膜上優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單、快速、可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品二、核酸分子雜交的基本類型

原位雜交(insituhybridization)*細(xì)胞或染色體的原位雜交，用于基因定位。

*細(xì)菌菌落的原位雜交：篩選陽(yáng)性克隆。將標(biāo)記的核酸探針與固定在細(xì)胞或組織中的核酸進(jìn)行雜交，稱原位雜交。根據(jù)檢測(cè)物分細(xì)胞內(nèi)原位雜交和組織切片內(nèi)原位雜交；根據(jù)探針與待檢核酸分：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA雜交。特點(diǎn)能在成分復(fù)雜的組織中進(jìn)行單一細(xì)胞的研究不需從組織或細(xì)胞中提取核酸，對(duì)含量極低的靶序列靈敏度高能準(zhǔn)確反映組織細(xì)胞的相互關(guān)系及功能狀態(tài)二、核酸分子雜交的基本類型

原位雜交

1、定義：將標(biāo)記的核酸探針與固定在細(xì)胞或組織中的核酸進(jìn)行雜交，稱原位雜交。根據(jù)檢測(cè)物分細(xì)胞內(nèi)原位雜交和組織切片內(nèi)原位雜交；根據(jù)探針與待檢核酸分：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA雜交二、核酸分子雜交的基本類型

保持組織細(xì)胞的形態(tài)對(duì)核酸無(wú)抽提，修飾與降解作用不改變核酸在組織細(xì)胞內(nèi)的定位不阻礙核酸與探針的雜交過(guò)程對(duì)雜交信號(hào)無(wú)遮蔽作用理化性質(zhì)穩(wěn)定2、雜交過(guò)程：（1）組織或細(xì)胞的固定理想固定液應(yīng)具備：二、核酸分子雜交的基本類型

（2）組織細(xì)胞雜交前的預(yù)處理

去垢劑（如Tritonx-100和SDS）和蛋白酶

K去除核酸表面的蛋白質(zhì)組織細(xì)胞內(nèi)的核酸與蛋白質(zhì)結(jié)合成核酸蛋白復(fù)合體控制消化時(shí)間，避免細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞和核酸從載玻片上脫落二、核酸分子雜交的基本類型

（3）探針的選擇與標(biāo)記

以獲得最好雜交效果為依據(jù)選擇探針探針的長(zhǎng)度一般為50~300bp,有時(shí)達(dá)1.5kb

放射性核素標(biāo)記探針敏感性高，操作簡(jiǎn)便穩(wěn)定檢測(cè)結(jié)果分辨率高，但信號(hào)檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)非核素標(biāo)記探針安全、穩(wěn)定性好、顯色快，易于觀察二、核酸分子雜交的基本類型

（4）雜交

雜交液體積小：10~20μlcDNA和RNA探針雜交溫度約為50℃

雜交時(shí)間:DNA探針雜交為2~4h.RNA探針雜交過(guò)夜雜交前一般將組織切片置95℃5~15分鐘使DNA變性沖洗溫度一般不超過(guò)50℃（5）雜交結(jié)果檢測(cè)

所用探針為核素標(biāo)記,放射自顯影檢測(cè)所用探針為非核素標(biāo)記,比色或化學(xué)發(fā)光檢測(cè)

核技術(shù)在生物技術(shù)中的應(yīng)用

第二節(jié)

核酸探針的放射性核素標(biāo)記核酸雜交的探針

(1)常用探針類型：

①人工合成寡核苷酸探針②基因組DNA探針③cDNA探針④RNA探針

(2)探針標(biāo)記物①放射性標(biāo)記物

32P高放射性半衰期14.3d

35S放射性較弱半衰期87.1d

3H放射性弱半衰期12.35a

②非放射性標(biāo)記物

半抗原：生物素、地高率配體：生物素是親和素的配體熒光素：異硫氰酸熒光素、羅丹明等化學(xué)發(fā)光探針：標(biāo)記物與某種底物反應(yīng)發(fā)光，如生物素酰化的堿性磷酸酶可使發(fā)光底物發(fā)光

(2)探針標(biāo)記物理想標(biāo)記物應(yīng)具備的特性：

高度靈敏性不影響堿基配對(duì)的特異性不影響探針?lè)肿拥闹饕砘再|(zhì)對(duì)酶促反應(yīng)活性無(wú)影響或影響不大檢測(cè)方法具有高度靈敏性和高度特異性(3)探針標(biāo)記方法

切口平移法(nicktranslation)隨機(jī)引物法(randomprimer)：六核苷酸殘基的引物PCR標(biāo)記法末端標(biāo)記法1、利用DNaseI在DNA雙鏈上造成單鏈切口2、利用大腸桿菌DNA聚合酶I的53核酸外切酶活性在切口處將舊鏈從5

末端逐步切除3、在DNA聚合酶I的53聚合酶催化下，以互補(bǔ)的DNA單鏈為模板依次將dNTP連接到切口的3末端-OH上，合成新的DNA鏈，同時(shí)將標(biāo)記的核苷酸摻入到新的DNA鏈中1、切口平移法（nicktranslation)①切口平移法(nicktranslationlabeling)5’5’3’3’3’3’3’5’5’5’5’5’5’3’3’3’3’5’5’5’5’5’5’3’DNA酶IDNA聚合酶I+標(biāo)記的dNTP5’3’變性探針平均長(zhǎng)度600bp2、隨機(jī)引物法

其原理是隨機(jī)引物能與各種單鏈DNA模板結(jié)合，作為合成新鏈的引物，在DNA聚合酶的催化下，按53方向合成一新的DNA鏈，其核苷酸序列與模板DNA完全互補(bǔ)。另一單鏈DNA模板同樣合成一條新的完全互補(bǔ)的DNA鏈。合成時(shí)，帶放射性核素標(biāo)記的核苷酸摻入到新合成的DNA分子中隨機(jī)引物法所具有的優(yōu)點(diǎn)：1、能進(jìn)行雙鏈DNA、單鏈DNA或RNA探針的標(biāo)記2、操作簡(jiǎn)單方便，避免因DNaseI處理濃度掌握不當(dāng)所帶來(lái)的一系列問(wèn)題3、標(biāo)記活性高，標(biāo)記活性可達(dá)108cpm/μgDNA以上4、可直接在低熔點(diǎn)瓊脂糖溶液中進(jìn)行標(biāo)記②隨機(jī)引物法(randomprimedDNAlabeling)5’3’5’3’5’3’5’3’隨機(jī)6-12bp單核苷酸引物變性一般探針長(zhǎng)度在400-600bp之間3、單鏈DNA探針

用雙鏈探針雜交檢測(cè)另一個(gè)遠(yuǎn)緣DNA時(shí),探針序列與被檢測(cè)序列間有很多錯(cuò)配.而兩條探針互補(bǔ)鏈之間的配對(duì)卻十分穩(wěn)定,即形成自身的無(wú)效雜交,結(jié)果使檢測(cè)效率下降.采用單鏈探針則可解決這一問(wèn)題.單鏈DNA探針的合成方法主要有下列兩種:

(1)以M13載體衍生序列為模板,用Klenow片段合成單鏈探針;

(2)以RNA為模板,用反轉(zhuǎn)錄酶合成單鏈cDNA探針.

從M13載體衍生序列合成單鏈DNA探針：

合成單鏈DNA探針可將模板序列克隆到噬粒或M13噬菌體載體中,以此為模板,以特定的通用引物或以人工合成的寡合苷酸為引物,在[a-32P]-dNTP的存在下,由Klenow片段作用合成放射標(biāo)記探針,反應(yīng)完畢后得到部分雙鏈分子.在克隆序列內(nèi)或下游用限制性內(nèi)切酶切割這些長(zhǎng)短不一的產(chǎn)物,然后通過(guò)變性凝膠電泳(如變性聚丙烯酰胺凝膠電泳)將探針與模板分離開(kāi).雙鏈RF型M13DNA也可用于單鏈DNA的制備,選用適當(dāng)?shù)囊锛纯芍苽湔溁蜇?fù)鏈單鏈探針.材料：已制備好的單鏈DNA模板。

設(shè)備：高速臺(tái)式離心機(jī),恒溫水浴鍋等.

4、從RNA合成單鏈cDNA探針

cDNA單鏈探針主要用來(lái)分離cDNA文庫(kù)中相應(yīng)的基因.用RNA為模板合成cDNA探針?biāo)玫囊镉袃煞N:(1)用寡聚dT為引物合成cDNA探針.本方法只能用于帶Poly(A)的mRNA,并且產(chǎn)生的探針極大多數(shù)偏向于mRNA3'末端序列.(2)可用隨機(jī)引物合成cDNA探針.該法可避免上述缺點(diǎn),產(chǎn)生比活性較高的探針.但由于模板RNA中通常含有多種不同的RNA分子,所得探針的序列往往比以克隆DNA為模板所得的探針復(fù)雜得多,應(yīng)預(yù)先盡量富集mRNA中的目的序列.

反轉(zhuǎn)錄得到的產(chǎn)物RNA/DNA雜交雙鏈經(jīng)堿變性后,RNA單鏈可被迅速地降解成小片段,經(jīng)SephadexG-50柱層析即可得到單鏈探針.

5、末端標(biāo)記法(terminallabeling)3’末端

5’末端[注意]

1、利用本方法可對(duì)DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行標(biāo)記,利用它可定位因片段太小而無(wú)法在凝膠中觀察的DNA片段.

2、對(duì)DNA的純度不很?chē)?yán)格,少量制備的質(zhì)粒也可進(jìn)行末端標(biāo)記合成探針.

3、末端標(biāo)記還有其他的一些方法,如利用T4多核苷酸激酶標(biāo)記脫磷的5'端突出的DNA和平末端凹缺DNA分子,也可利用該酶進(jìn)行交換反應(yīng)標(biāo)記5'末端.

6、寡核苷酸探針

利用寡核苷酸探針可檢測(cè)到靶基因上單個(gè)核苷酸的點(diǎn)突變.常用的寡核苷酸探針主要有兩種:單一已知序列的寡核苷酸探針和許多簡(jiǎn)并性寡核苷酸探針組成的寡核苷酸探針庫(kù).單一已知序列寡核苷酸探針能與它們的目的序列準(zhǔn)確配對(duì),可以準(zhǔn)確地設(shè)計(jì)雜交條件,以保證探針只與目的序列雜交而不與序列相近的非完全配對(duì)序列雜交,對(duì)于一些未知序列的目的片段則無(wú)效.

核技術(shù)在生物技術(shù)中的應(yīng)用

第三節(jié)

放射性核素在基因檢測(cè)中的應(yīng)用Maxam-Gilbert化學(xué)降解法

化學(xué)降解法：人們用專一性作用于A、T、G、C堿基的化學(xué)藥劑分別處理經(jīng)內(nèi)切酶切割而成的一定長(zhǎng)度DNA片段，通過(guò)控制反應(yīng)時(shí)間，既可獲得分別以A、T、G、C為結(jié)尾的四組由所有可能長(zhǎng)度核苷酸片段組成的DNA片段群。除了要研究與DNA的高級(jí)結(jié)構(gòu)、DNA-蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)相關(guān)性采用化學(xué)降解法外，對(duì)于單純以測(cè)序?yàn)槟康牡膶?shí)驗(yàn)，普遍采用后面所講的酶促合成法。

Sanger鏈終止法1977年Sanger設(shè)計(jì)了一種通過(guò)DNA復(fù)制來(lái)識(shí)別4種堿基的方法，進(jìn)行DNA序列測(cè)定，即雙脫氧鏈終止法。Sanger法獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。一、Sanger雙脫氧鏈終止法原理在模板指導(dǎo)下，DNA聚合酶不斷將dNTP加到引物的3’-OH末端，使引物延長(zhǎng)，合成出新的互補(bǔ)的DNA鏈，如果加入雙脫氧三磷酸核苷(ddNTP)，由于雙脫氧核糖的3’位置上缺少一個(gè)羥基，故不能同后續(xù)的dNTP形成磷酸二酯鍵，即形成一種全部具有相同5’-引物端和以ddNMP殘基為3’端結(jié)尾的一系列長(zhǎng)短不一片段的混合物。由于雙脫氧核苷酸在每個(gè)DNA分子中摻入的位置不同，采用聚丙烯酰胺凝膠電泳區(qū)分長(zhǎng)度差一個(gè)核苷酸的單鏈DNA，從而讀取DNA核苷酸序列。

二、雙脫氧終止法測(cè)序反應(yīng)體系：DNA聚合酶單鏈DNA模板帶有3-OH末端的單鏈寡核苷酸引物Mg2+4種dNTP(aATP、dGTP、dCTP和dTTP)4種ddNTP(ddATP、ddGTP、ddCTP和ddTTP)測(cè)序過(guò)程:1.模板與引物雜交2.引物的延長(zhǎng)和合成阻斷四個(gè)試管分別加入：DNA聚合酶、dNTPs、標(biāo)記引物終止劑不同：ddA、ddG、ddC、ddT四個(gè)試管中所有產(chǎn)物是一系列長(zhǎng)度只差一個(gè)核苷酸的聚合鏈3.電泳：ACGT次序，高壓電泳4.放射自顯影得到直讀圖象外源基因表達(dá)研究中的應(yīng)用1.外源基因的轉(zhuǎn)錄

啟動(dòng)子類型：組成型啟動(dòng)子原核生物T7啟動(dòng)子

誘導(dǎo)型啟動(dòng)子原核生物lac、trp等組織特異性表達(dá)啟動(dòng)子

2.mRNA的延伸與穩(wěn)定性

原核生物避免序列存在衰減子(attenuator)

帶有正常轉(zhuǎn)錄終止序列受體細(xì)胞情況

ABtrp衰減子帶有正常轉(zhuǎn)錄終止序列

真核生物要帶有轉(zhuǎn)錄終止序列與poly(A)

滲入位點(diǎn)

poly(A)滲入信號(hào)序列AAUAAA受體細(xì)胞情況原核生物最佳選擇RNase缺失個(gè)體真核生物mRNA正確加工，提高穩(wěn)定性3.外源基因mRNA的有效翻譯原核生物

①AUG(ATG)首選起始密碼子