第8章-制備色譜技

第7章制備色譜技術(shù)7.1制備薄層色譜技術(shù)7.2常規(guī)柱色譜技術(shù)7.3加壓液相色譜技術(shù)制備色譜技術(shù)制備色譜的特點：薄層色譜柱色譜1）最有效的制備性分離技術(shù)；2）實驗室規(guī)模、小批量生產(chǎn)、產(chǎn)業(yè)化制備；3）不同領(lǐng)域產(chǎn)品量不一樣，闡明化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物活性，30－50mg足夠；分析用標(biāo)準(zhǔn)品100mg以上；有機合成通常需要g級以上；制備色譜技術(shù)設(shè)備簡單，操作方便、分離快、高靈敏度及分辨率切割譜帶更加方便；自動化：自動點樣儀、自動程序展開儀、薄層掃描儀、多種強制流動技術(shù)、多種聯(lián)用技術(shù)如傅立葉變換紅外、拉曼、質(zhì)譜等。7.1

制備薄層色譜技術(shù)制備色譜技術(shù)常規(guī)制備薄層色譜PTLC薄層板制備：為了增大上樣量，增加了吸附劑用量。固定相：硅膠、氧化鋁、纖維素、C2、C18等反相健合硅膠支撐：玻璃板或鋁箔平均25m,5~40m硅膠H、硅膠G、硅膠F254、硅膠F365、硅膠P制備色譜技術(shù)硅膠粒徑范圍影響：越細越均勻，分離度越高，但流速？粒徑范圍寬，分離效率低，怎么辦？----薄層厚度的漸變薄層厚度從底部到前沿逐漸增加，這樣展開劑的速度逐漸變慢，樣品譜帶在展開過程中逐步富集，可保持較窄的譜帶。制備色譜技術(shù)薄層板的制作方法：常采用濕法：平鋪法和涂鋪法。混合平鋪涂鋪器自然干燥一夜105-120℃活化黏合劑硅膠煅石膏或羧甲基纖維素鈉水溶液制備色譜技術(shù)薄層色譜條件選擇操作參數(shù)流速展開模式分離距離樣品量流動相選擇性溶劑強度黏度展開缸類型薄層板和展開缸空腔體積比值溫度蒸氣相固定相薄層厚度顆粒大小質(zhì)量開放型操作不連續(xù)點樣樣品溶液的制備點樣設(shè)備和技術(shù)樣品溶液的制備a純品溶解-用溶劑溶解至一定濃度b樣品的提取與凈化①單一溶劑提取法②液液萃取法③液固萃取法—過柱子④特殊的薄層板—帶濃集區(qū)的薄層板分離，得到濃集的窄帶⑤衍生化作用⑥原位反應(yīng)法點樣設(shè)備和技術(shù)1）點樣方式、點樣量及點樣設(shè)備的選擇取決于分析的目的、樣品溶液的濃度及被測物質(zhì)的溶解度。2）溶劑的粘度不宜過高，以便于點樣，溶劑的沸點要適中，太低會改變?nèi)芤旱臐舛龋卟灰讚]發(fā)易殘留導(dǎo)致改變展開劑的選擇性，溶劑必須全部除去后方可進行展開，但避免高溫加熱。點樣設(shè)備和技術(shù)點狀點樣管口平整毛細管點樣，樣點直徑不超過5mm;d1=1-1.5cm;d2約2cm；定量時用定容管點樣；展開劑

薄層色譜條件：依據(jù)被分離物質(zhì)的性質(zhì)（溶解度、酸堿性及極性）、吸附劑（活性、非活性）及展開劑三種因素決定。展開劑千變?nèi)f化，可以是單一溶劑、更多的是應(yīng)用二元、三元或多元的混合溶劑作為展開劑。展開劑也稱為溶劑系統(tǒng)、流動相或洗脫劑。常用溶劑(1)電子接受體溶劑：苯、甲苯、乙酸乙酯、丙酮等；(2)質(zhì)子給體溶劑：異丙醇、正丁醇、甲醇、無水乙醇等；(3)強質(zhì)子給體溶劑：氯仿、冰醋酸、甲酸、水等；(4)質(zhì)子受體溶劑：三乙胺、乙醚等；(5)偶極作用溶劑：二氯甲烷(6)惰性溶劑：環(huán)己烷、正己烷等。制備色譜技術(shù)溶劑的極性大小順序：水＞甲酸＞二甲基亞砜＞甲醇＞乙醇＞正丙醇＞丙酮＞乙酸＞乙酸乙酯＞蓖麻油＞乙醚＞氯仿＞植物油＞四氯化碳＞液體石蠟。溶劑強度(1)吸附薄層色譜法(2)分配薄層色譜法和紙色譜法(3)聚酰胺薄層色譜法(4)離子交換薄層色譜法(5)凝膠薄層色譜法溶劑強度(1)吸附薄層色譜法

①底劑：展開劑中比例較大的溶劑極性相對較小，起溶解物質(zhì)和基本分離的作用。②調(diào)節(jié)劑：展開劑中比例較小的溶劑極性相對較大，對被分離物質(zhì)有較強的洗脫力，幫助化合物在薄層上移動，可增大Rf值，但不能提高分辨率，可稱為極性調(diào)節(jié)劑。

溶劑強度(1)吸附薄層色譜法③抑制劑：展開劑中加入少量酸、堿，可抑制某些酸堿化合物或其鹽類的解離而產(chǎn)生斑點的脫尾，稱為拖尾抑制劑。④其他：展開劑中有時加入丙酮等中等極性溶劑，主要是促使不相混合的溶劑混溶，并可降低展開劑的粘度，加快展速。溶劑強度(2)分配薄層色譜法和紙色譜法①水作固定相②親水有機相作固定相③反相分配色譜溶劑強度(3)聚酰胺薄層色譜法氫鍵作用展開劑洗脫能力順序：水＜乙醇＜甲醇＜丙酮＜稀氫氧化銨（鈉）溶液＜甲酰胺＜二甲基甲酰胺溶劑強度(4)離子交換薄層色譜法①緩沖溶液②鹽溶液③蒸餾水④上述溶液加入一些有機溶劑溶劑強度(5)凝膠薄層色譜法在Sephadex-100，150，200凝膠薄層色譜板上，用磷酸緩沖液作展開劑分離蛋白選擇展開劑的方法a）三角形法b）點滴試驗法c）展開室法a）三角形法按照展開劑、固定相及被分離物質(zhì)三者的相互影響，設(shè)計了三因素的組合。Rf=0.2～0.8b點滴試驗法將被分離物質(zhì)的溶液間隔的點在薄層板上，待溶劑揮發(fā)后，用吸滿不同展開劑的毛細管點到不同樣品點的中心，借毛細管的作用，展開劑從圓心向外擴展，這樣就出現(xiàn)了不同的圓心色譜，通過比較就可以找到最合適的展開劑和吸附劑。制備色譜技術(shù)上樣和展開先用甲醇展開一次，除去可能存在的雜質(zhì)；低揮發(fā)性溶劑溶解樣品會引起樣品帶變寬，因此選用揮發(fā)性溶劑（己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯等），且溶劑極性盡可能小。樣品濃度以能均勻分布于吸附劑表面不析出為宜，5-10%；帶狀點樣，盡可能窄；如點樣帶太寬，可用高極性溶劑展開至點樣帶上方2cm處進行濃縮，然后將鋪板干燥后再用展開劑展開。？制備色譜技術(shù)樣品檢測有色物質(zhì)直接觀察斑點；熒光物質(zhì)在紫外燈下觀察；無色無熒光可在熒光板分離，紫外光下顯示暗斑；噴顯色劑，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定且不易氧化物質(zhì)可以用碘蒸氣顯色，可逆；制備色譜技術(shù)常用顯色劑：硫酸：硫酸:乙醇(1:1)溶液，噴后110℃烤5分鐘，不同有機物顯不同的顏色；0.05%高錳酸鉀溶液，還原性物質(zhì)顯黃色，背景淡紅色；酸性重鉻酸鉀：5%重鉻酸鉀濃硫酸溶液，必要時150℃烤薄層；5%磷鉬酸乙醇溶液：噴后120℃烤，還原性物質(zhì)顯藍色，再用氨氣熏，背景無色。制備色譜技術(shù)樣品收集：切割：刮刀或與真空相連的管型刮離器；回收：極性盡可能低的溶劑洗脫，通常1g吸附劑用5mL溶劑，丙酮和氯仿常用，甲醇因溶解硅膠及其中含有的雜質(zhì)不常用。4型玻璃沙芯漏斗過濾洗脫液，再用0.2-0.45m濾膜過濾。硅膠的黏合劑以及熒光指示劑等雜質(zhì)，可用SephadexLH-20過濾純化。制備色譜技術(shù)常規(guī)制備TLC速度慢，效率低，如何提高？加壓離心加壓制備OPLC

彈性氣墊，外壓使沒有氣相存在，展開劑強制流動，展開速度加快制備色譜技術(shù)更細的固定相顆粒、更長的薄層板離心制備CTLC

離心力加速流動相，分離速度快，操作簡單，占用空間小，使用溶劑少，可反復(fù)使用，可進行梯度洗脫，進樣量大，一次分離量0.1-0.2g.制備色譜技術(shù)不同制備TLC方法的比較

制備色譜技術(shù)參數(shù)PTLCOPLCCTLC流動相遷移方法毛細作用加壓離心薄層厚度/mm0.5-20.5-21-4分離長度/cm181812分離模式線形線形環(huán)形組分分開方法離線在線在線典型上樣量/mg50-15050-30050-500分離譜帶數(shù)2-52-72-12可使用較大直徑的色譜柱，更多的固定相，因此樣品量可以更大；分離速度較慢，樣品可能被不可逆吸附；不適合小顆粒的吸附劑？改進方法：減壓、加壓等制備色譜技術(shù)7.2常規(guī)柱色譜技術(shù)

柱色譜常用固定相(1)硅膠：官能團和分子的幾何形狀，對異構(gòu)體的分離選擇性遠大于其他色譜方法。烷基<鹵素（F<Cl<Br<I）<醚<硝基混合物<腈<叔胺<酯<酮<醛<醇<酚<伯胺<酰胺<羧酸<磺酸摻雜硅膠：如硝酸銀處理，對不飽和烴有好的分離效果。1%-10%的添加劑的水或丙酮溶液與硅膠混合，稍干后110℃干燥即可。制備色譜技術(shù)(2)健合硅膠制備色譜技術(shù)(3)氧化鋁堿性氧化鋁：其水提取液為pH9-10，常用于碳氫化合物的分離，從碳氫化合物中除去含氧化合物。中性氧化鋁：5%乙酸處理，水提取液為pH7.5，適用于醛、酮、醌、某些苷以及酸堿溶液中不穩(wěn)定成分如酯、內(nèi)酯等化合物的分離。酸性氧化鋁：2MHCl溶液處理，水提取液pH為4-4.5，適合于天然及合成酸性色素以及某些醛、酸的分離。制備色譜技術(shù)(4)活性炭：分離水溶性物質(zhì)吸附作用在水溶液中最強，用有機溶劑洗脫。對芳香族的吸附力大于脂肪族；對大分子吸附力大于小分子；對極性基團多的分子吸附力大于少的；易吸附氣體“中毒”，用前需活化，120℃加熱4-5小時；制備色譜技術(shù)(5)聚酰胺：又稱為錦綸或尼龍同時具有良好的親水性和親脂性；可溶于濃鹽酸、甲酸，不溶于常見溶劑；含有豐富的酰胺基，與酚類、黃酮類、醌類、脂肪酸類物質(zhì)形成氫鍵；還含有非極性脂肪鏈，雙重保留機理；制備色譜技術(shù)(6)大孔吸附樹脂：苯乙烯和丙烯酸酯骨架結(jié)構(gòu)決定樹脂的極性：

非極性、弱極性----苯乙烯或二乙烯基苯聚合而成；

中等極性----甲基丙烯酸酯；

極性、強極性----含氧硫基、酰胺基、氮氧等基團；吸附和分子篩分離相結(jié)合：網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，大比表面積制備色譜技術(shù)大孔吸附樹脂使用：用前需預(yù)處理除去雜質(zhì)：

回流法、水蒸氣蒸餾法；

滲漉法----乙醇丙酮等有機溶劑濕法裝柱，浸泡12h后洗脫2-3倍柱體積，再浸泡3-5h后洗脫2-3倍柱體積，重復(fù)直到流出的有機溶劑與水混合不呈現(xiàn)白色乳濁現(xiàn)象為止，用大量蒸餾水洗去乙醇即可。如單獨采用有機溶劑洗不盡雜質(zhì)，則可用酸堿處理，2-5%鹽酸、2-5%NaOH溶液浸泡，洗脫，水洗。制備色譜技術(shù)(7)凝膠：交聯(lián)葡聚糖Sephadex----葡聚糖和3氯-1，2環(huán)氧丙烷以醚健交聯(lián)形成的三維空間多孔凝膠

交聯(lián)度大，孔小，吸水膨脹小

型號以其吸水量的10倍命名，如SephadexG-25表示每克干膠吸水2.5g；

引入羥丙基，為LH型烷基化葡聚糖凝膠，不僅可分離水溶性成分，還可分離親脂性成分，常用于最后的純化，除去微量固體、鹽類和其他外來雜質(zhì)，純化過程中樣品損失極小。制備色譜技術(shù)甲基丙烯酸酯共聚物ToyopearlHW系列----乙二醇、甲基丙烯酸縮水甘油酯和二甲基丙烯酸季戊四醇酯共聚而成穩(wěn)定性好，pH2-12；機械強度高，常用于加壓柱色譜；在蛋白質(zhì)、酶、核酸、多糖的純化處理中應(yīng)用較多；

Toyop