第三章 基因克隆載體1

主講教師:任國(guó)領(lǐng)生命科學(xué)學(xué)院第三章

基因克隆載體基因克隆載體概述DNA克隆載體通過(guò)不同途徑將承載的外源DNA片段（基因）帶入受體細(xì)胞且能在其中維持的DNA分子。也稱(chēng)DNA克隆載體。1、具有多種單一核酸內(nèi)切酶切割位點(diǎn)（多克隆位點(diǎn)）

(一個(gè)或多個(gè))外源DNA插入，不影響載體復(fù)制。2、能攜帶外源DNA片段進(jìn)入受體細(xì)胞

能自我復(fù)制，或整合到染色體隨受體細(xì)胞DNA復(fù)制而復(fù)制。3、有選擇克隆子的標(biāo)記基因（篩選標(biāo)記）。必備條件基因克隆載體概述4、分子量小，拷貝數(shù)高，易從宿主細(xì)胞中分離。5、安全性(不含損害受體的基因,不任意轉(zhuǎn)入別的,尤其人的細(xì)胞)?；蚩寺≥d體概述必備條件基因克隆載體概述分類(lèi)基因克隆載體概述基因工程常見(jiàn)的載體有5類(lèi)：質(zhì)粒（Plasmid）單鏈DNA噬菌體M13λ噬菌體的衍生物柯斯質(zhì)粒（comsid）動(dòng)物病毒（Virus）3.1質(zhì)粒克隆載體一、質(zhì)粒（Plasmid）獨(dú)立于染色體外能夠自主復(fù)制的雙鏈閉合環(huán)狀DNA分子（少數(shù)為線狀）。大腸桿菌質(zhì)粒3.1質(zhì)?？寺≥d體一、質(zhì)粒（Plasmid）質(zhì)粒性質(zhì)3.1質(zhì)?？寺≥d體一、質(zhì)粒（Plasmid）3.1質(zhì)?？寺≥d體二、質(zhì)粒適于載體構(gòu)建的一般特點(diǎn)１、組成與構(gòu)型質(zhì)粒(plasmid)是染色體外裸露的雙鏈DNA分子（細(xì)菌、真菌、藍(lán)藻、綠藻）。構(gòu)型：l-DNAoc-DNAccc-DNA２、分子小1～200kb大小差異很大，一般在10Kb左右。3.1質(zhì)?？寺≥d體二、質(zhì)粒適于載體構(gòu)建的一般特點(diǎn)3、復(fù)制特點(diǎn)3.1質(zhì)粒克隆載體二、質(zhì)粒適于載體構(gòu)建的一般特點(diǎn)特點(diǎn)：在宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行單向復(fù)制?？截悢?shù)（細(xì)胞內(nèi)質(zhì)粒與染色體數(shù)量之比值）（１）每種質(zhì)粒在其宿主細(xì)胞內(nèi)的拷貝數(shù)相對(duì)穩(wěn)定。 嚴(yán)緊控制型：1～數(shù)個(gè)拷貝；大質(zhì)粒 松馳控制型：10個(gè)以上拷貝；小質(zhì)粒。經(jīng)氯霉素處理，宿主中質(zhì)粒大量擴(kuò)增（如ColE1拷貝數(shù)達(dá)3000個(gè)）。3、復(fù)制特點(diǎn)3.1質(zhì)?？寺≥d體二、質(zhì)粒適于載體構(gòu)建的一般特點(diǎn)（２）質(zhì)粒復(fù)制的控制因素cop基因：指令宿主合成阻遏物，當(dāng)質(zhì)粒復(fù)制到一定拷貝數(shù)時(shí)，阻遏物也合成積累，直到阻止質(zhì)粒的繼續(xù)復(fù)制。3、復(fù)制特點(diǎn)3.1質(zhì)?？寺≥d體二、質(zhì)粒適于載體構(gòu)建的一般特點(diǎn)rep基因：指令宿主合成一種調(diào)節(jié)蛋白，促進(jìn)質(zhì)粒的復(fù)制3、復(fù)制特點(diǎn)3.1質(zhì)?？寺≥d體二、質(zhì)粒適于載體構(gòu)建的一般特點(diǎn)

par序列：

附著在細(xì)胞膜上，使質(zhì)粒隨細(xì)胞分裂而正確地分配到子細(xì)胞中，維持相對(duì)穩(wěn)定的拷貝數(shù)。４、質(zhì)粒的不親合性3.1質(zhì)?？寺≥d體二、質(zhì)粒適于載體構(gòu)建的一般特點(diǎn)親和性質(zhì)粒：能在同一細(xì)胞中復(fù)制的幾種質(zhì)粒不親和性（不相容性）質(zhì)粒：不能在同一細(xì)胞中復(fù)制的質(zhì)粒。意義：宿主細(xì)胞內(nèi)的原有質(zhì)粒與克隆載體的質(zhì)粒必須是親和性質(zhì)粒，最好不含內(nèi)源性質(zhì)粒。４、質(zhì)粒的不親合性3.1質(zhì)?？寺≥d體５、質(zhì)粒遷移3.1質(zhì)?？寺≥d體二、質(zhì)粒適于載體構(gòu)建的一般特點(diǎn)（１）接合質(zhì)粒：含tra基因→合成細(xì)胞表面物質(zhì)（鞭毛）→質(zhì)粒DNA入受體細(xì)胞

含tra基因的質(zhì)粒稱(chēng)為接合質(zhì)粒。如F、Ti等

不含tra基因的質(zhì)粒稱(chēng)為非接合質(zhì)粒。如ColE1、pPbS等（２）遷移作用：不含tra基因而含bom（oriＴ）位點(diǎn)的質(zhì)粒，當(dāng)宿主細(xì)胞存在輔助質(zhì)粒mob基因產(chǎn)物時(shí)，即可打開(kāi)oriＴ位點(diǎn)，非結(jié)合質(zhì)粒借助接合質(zhì)粒tra基因的產(chǎn)物而遷移入受體細(xì)胞。這種現(xiàn)象稱(chēng)～質(zhì)粒的遷移作用５、質(zhì)粒遷移3.1質(zhì)粒克隆載體二、質(zhì)粒適于載體構(gòu)建的一般特點(diǎn)６、顯性質(zhì)粒和隱蔽質(zhì)粒3.1質(zhì)?？寺≥d體二、質(zhì)粒適于載體構(gòu)建的一般特點(diǎn)宿主因含某種質(zhì)粒而呈現(xiàn)出新的性狀，稱(chēng)為顯性質(zhì)粒。顯性質(zhì)粒 Ｒ質(zhì)粒：含有氨芐青霉素Ap/Amp（抗性質(zhì)粒）

氯霉素Cm/Cap

卡那霉素Km/Kan

四環(huán)素Tc/Tet

Col質(zhì)粒（產(chǎn)大腸桿菌素）Ｆ質(zhì)粒（引起細(xì)胞結(jié)合的育性質(zhì)粒） 降解毒物的降解質(zhì)粒Ｔi質(zhì)粒隱蔽質(zhì)粒

藍(lán)藻內(nèi)源質(zhì)粒能夠催化雙鏈DNA片段緊靠在一起的3’羥基端與5’磷酸基團(tuán)末端之間形成磷酸二酯鍵，使兩末端連接起來(lái)的酶。DNA連接酶兩種類(lèi)型（1）E.coliDNA連接酶（2）T4DNA連接酶知識(shí)回顧DNA重組類(lèi)型知識(shí)回顧插入重組：外源DNA片斷兩端具有相同的末端，待重組的DNA分子用某種限制性核酸內(nèi)切酶切割后產(chǎn)生與外源DNA相同的末端，并且這種限制性核酸內(nèi)切酶在此DNA分子上只有一個(gè)識(shí)別序列。置換重組外源DNA兩端具有相同的末端；待重組DNA這樣的限制性?xún)?nèi)切酶有兩個(gè)識(shí)別序列，酶切后與外源DNA連接，產(chǎn)生重組DNA分子。1.DNA連接酶連接作用的特點(diǎn)正確的是（）多選題知識(shí)回顧A.DNA連接酶需要一條DNA鏈的3’－末端有一個(gè)游離的羥基（－OH），另一條DNA鏈的5’－末端有一個(gè)磷酸基（－P）的情況下，才能發(fā)揮連接DNA分子的作用。B.只有當(dāng)3’－OH和5’－P彼此相鄰，并且各自位于與互補(bǔ)鏈上的互補(bǔ)堿基配對(duì)的兩個(gè)脫氧核苷酸末端時(shí)，DNA連接酶才能將它們連接成磷酸二酯鍵。C.DNA連接酶不能連接兩條單鏈的DNA分子或環(huán)化的單鏈DNA分子，被連接的DNA鏈必須是雙螺旋DNA分子的一部分。D.DNA連接酶可以用以封閉雙鏈DNA的某一條鏈上失去一個(gè)或數(shù)個(gè)核苷酸所形成的單鏈裂口（gap）。ABC

DNA克隆載體通過(guò)不同途徑將承載的外源DNA片段（基因）帶入受體細(xì)胞且能在其中維持的DNA分子。也稱(chēng)DNA克隆載體。知識(shí)回顧1、具有多種單一核酸內(nèi)切酶切割位點(diǎn)（多克隆位點(diǎn)）

(一個(gè)或多個(gè))外源DNA插入，不影響載體復(fù)制。2、能攜帶外源DNA片段進(jìn)入受體細(xì)胞

能自我復(fù)制，或整合到染色體隨受體細(xì)胞DNA復(fù)制而復(fù)制。3、有選擇克隆子的標(biāo)記基因（篩選標(biāo)記）。必備條件知識(shí)回顧4、分子量小，拷貝數(shù)高，易從宿主細(xì)胞中分離。5、安全性(不含損害受體的基因,不任意轉(zhuǎn)入別的,尤其人的細(xì)胞)。知識(shí)回顧親和性質(zhì)粒不親和性質(zhì)粒能在同一細(xì)胞中復(fù)制的幾種質(zhì)粒。不能在同一細(xì)胞中復(fù)制的質(zhì)粒。不含tra基因而含bom（oriＴ）位點(diǎn)的質(zhì)粒，當(dāng)宿主細(xì)胞存在輔助質(zhì)粒mob基因產(chǎn)物時(shí)，即可打開(kāi)oriＴ位點(diǎn)，非結(jié)合質(zhì)粒借助接合質(zhì)粒tra基因的產(chǎn)物而遷移入受體細(xì)胞。這種現(xiàn)象稱(chēng)～遷移作用知識(shí)回顧１、能進(jìn)行有效復(fù)制——復(fù)制起始位點(diǎn)（最好是多拷貝）復(fù)制子由復(fù)制起點(diǎn)、復(fù)制區(qū)、復(fù)制終點(diǎn)組成。是能夠進(jìn)行獨(dú)立復(fù)制的一種遺傳因子。每一個(gè)復(fù)制子都含有一個(gè)特定的RNA聚合酶結(jié)合的序列和DNA復(fù)制起始部位，即開(kāi)始復(fù)制的復(fù)制區(qū)。3.1質(zhì)?？寺≥d體三、質(zhì)粒載體的構(gòu)建用來(lái)插入外源DNA片段，且不影響復(fù)制。2、標(biāo)記基因——抗性基因，LacZ’基因篩選的標(biāo)志，理想的載體應(yīng)該有兩種抗菌素抗性的基因。3、克隆位點(diǎn)——組裝MCS連桿3.1質(zhì)粒克隆載體三、質(zhì)粒載體的構(gòu)建3.1質(zhì)粒克隆載體三、質(zhì)粒載體的構(gòu)建４、分子盡可能小（轉(zhuǎn)化率高），

＞15kb轉(zhuǎn)化率↓↓５、組裝各種“元件”，如啟動(dòng)子、終止子等3.1質(zhì)?？寺≥d體三、質(zhì)粒載體的構(gòu)建嚴(yán)密的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)→構(gòu)建（切割、修飾和連接重組）過(guò)

程構(gòu)建原則

1、選用合適的出發(fā)質(zhì)粒：含必備的元件，如ori、選擇標(biāo)記、

克隆位點(diǎn)、啟動(dòng)子和終止子。 2、正確獲得構(gòu)建質(zhì)粒克隆載體的元件。 3、組裝合適的標(biāo)記基因。 4、選用合適的啟動(dòng)子。 5、構(gòu)建過(guò)程力求簡(jiǎn)單。1、pBR322構(gòu)建

目標(biāo)是縮小基因組的體積，移去一些對(duì)基因克隆載體無(wú)關(guān)緊要的DNA片段，限制酶識(shí)別位點(diǎn)。質(zhì)粒載體命名法則 “pBR322”

p：質(zhì)粒（plasmid) BR：兩位主要構(gòu)建者 322：實(shí)驗(yàn)編號(hào)3.1質(zhì)?？寺≥d體四、代表性實(shí)例（一）pBR322及其衍生載體ColE1

松馳型，篩選系統(tǒng)復(fù)雜。

衍生的pMB1為出發(fā)質(zhì)粒（松弛型復(fù)制起始位點(diǎn)，但缺較好的選擇標(biāo)記基因和克隆位點(diǎn)）。

pSC101（最早用于DNA克隆的載體），嚴(yán)緊型，含有Tcr基因。構(gòu)建過(guò)程(出發(fā)質(zhì)粒：pMB1)

2、pBR322優(yōu)點(diǎn)（1）較小的分子量10kb以?xún)?nèi)DNA分子純化過(guò)程中可避免斷裂，pBR322易于自身純化，且可克隆6kb左右的外源DNA。（2）較高的拷貝數(shù)經(jīng)氯霉素?cái)U(kuò)培后達(dá)1000～3000copys/cell（3）兩種抗菌素抗性基因插入失活，分兩次先后選擇。3.1質(zhì)粒克隆載體四、代表性實(shí)例（二）、pUC18/19質(zhì)粒載體與pBR322區(qū)別：乳糖操縱子的一個(gè)DNA片段（lacZ`基因）替換Tcr基因；組裝了一個(gè)多克隆位點(diǎn)（MCS）連桿。命名pUC——UniversityofCalifornia的科學(xué)家首先構(gòu)建。

圖3-3pUC包括四個(gè)組成部分：（1）復(fù)制起點(diǎn)pBR322的ori。（2）Apmr基因pBR322的Ampr。（3）lacZ的啟動(dòng)子大腸桿菌（4）在lacZ`基因大腸桿菌lacZ的a-肽鏈序列，是LacZ的氨基酸片段。

含乳糖操縱子的啟動(dòng)子、調(diào)節(jié)因子和 β-半乳糖苷酶的N端146殘基(α-肽)合成有活性的基因（lacZ`）的質(zhì)粒載體引入可編β-半乳糖苷酶碼C端部分殘基的宿主(與LacZ`互補(bǔ)的大腸桿菌) 在含IPTG（異丙基-β-D-硫代半乳糖苷）和 X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖）藍(lán)色菌落 的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)在N端α-肽的編碼區(qū)插入MCS不影響lacZ`基因功能插入外源DNA滅活lacZ`基因白色菌落LacZ`篩選機(jī)制：pUC質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn)分子量更小、拷貝數(shù)更高篩選方便X-gal顯色、抗菌素雙重直接選擇。克隆便利具有多克隆位點(diǎn)（MCS），使兩個(gè)不同粘性末端的外源DNA方面的插入。測(cè)序方便TA克隆載體——針對(duì)PCR產(chǎn)物的克隆原理PCR產(chǎn)物在Taq酶的非模板依賴(lài)活性作用下，于3`端加一非配對(duì)的A。故可研制一種線性載體，其5`端各帶一不配對(duì)T，可直接與PCR產(chǎn)物以TA連接進(jìn)行克隆，即TA克隆。TA載體的再生方法（1）克隆載體線性化（2）克隆載體末端補(bǔ)平反應(yīng)（3）克隆載體末端加T反應(yīng)注：再生后的TA載體，原線性化的酶切位點(diǎn)消失3.2病毒（噬菌體）克隆載體一、病毒的一般特征病毒基本結(jié)構(gòu)DNA（或RNA）+外殼蛋白感染細(xì)菌的病毒，稱(chēng)為噬菌體。分類(lèi)溫和性病毒：溶原性增殖烈性病毒：溶菌性增殖生活周期

溶菌周期

感染細(xì)菌后立即在菌體內(nèi)復(fù)制和合成蛋白質(zhì)外殼，重新組裝成噬菌體顆粒，并導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞解體，釋放出大量子代噬菌體。3.2病毒（噬菌體）克隆載體一、病毒的一般特征溶源周期

感染細(xì)菌后，將自己的DNA整合到細(xì)菌的染色體DNA中。形成這一過(guò)程稱(chēng)為溶源化。生活周期

3.2病毒（噬菌體）克隆載體一、病毒的一般特征噬菌體載體單鏈?zhǔn)删w載體----M13雙鏈?zhǔn)删w載體----λ噬菌體cosmid克隆載體3.2病毒（噬菌體）克隆載體一、λ噬菌體克隆載體λDNA+外殼蛋白1、λDNA(48.5kb)噬菌體中：線性宿主細(xì)胞：環(huán)狀(cos位點(diǎn))3.2病毒（噬菌體）克隆載體（一）性質(zhì)cos位點(diǎn)2、λ噬菌體基因組有基因61個(gè)以上 有一半是必須的，與自身的活動(dòng)有關(guān)，成簇排列；大約1/3為非必須的，J與N、P與Q之間為非必需序列3.2病毒（噬菌體）克隆載體（一）性質(zhì)3、限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn):56種

4、λ噬菌體的生長(zhǎng)途徑

溶菌生長(zhǎng)途徑

溶源生長(zhǎng)途徑5、λDNA的復(fù)制模型

復(fù)制

滾環(huán)式復(fù)制

3.2病毒（噬菌體）克隆載體（一）性質(zhì)進(jìn)入溶原狀態(tài)時(shí)，只有少量基因表達(dá)，包括編碼阻遏物的cI基因（抑制裂解基因的表達(dá)），正向調(diào)控自身基因的表達(dá)；int基因的表達(dá)（整合到基因組）。

研究E.coliDNA復(fù)制時(shí)，采用3H標(biāo)記的T，經(jīng)放射自顯影和電子顯微鏡拍照，展示了“θ”形結(jié)構(gòu)而得名。3.2病毒（噬菌體）克隆載體

這種復(fù)制方式在下列生物DNA中有：（1）噬菌體：M13、φ

174、G4、λDNA基因復(fù)制。（2）細(xì)菌：E.coliDNA、細(xì)菌致育因子F。（3）真核生物：非洲爪蟾卵母細(xì)胞rDNA的復(fù)制。3.2病毒（噬菌體）克隆載體一、λ噬菌體克隆載體滾環(huán)復(fù)制過(guò)程（1）雙鏈環(huán)狀DNA的（+）鏈從“ori”處切刻開(kāi)。5’-端離開(kāi)環(huán)。(-)5’ori（+）3.2病毒（噬菌體）克隆載體一、λ噬菌體克隆載體

DNA聚合酶以（-）鏈環(huán)為模板，從（+）鏈的3’-OH端共價(jià)延伸，合成子代（+）鏈DNA。(-)5’3’(2)SSB覆蓋在（+）鏈的5’-端單鏈上，（+）3.2病毒（噬菌體）克隆載體一、λ噬菌體克隆載體

(4)DNA聚合酶以延伸的單鏈DNA為模板，合成子代雙鏈DNA。(-)5’3’3’5’(3)象拉卷尺一樣，（+）鏈越拉越長(zhǎng)。67（+）3.2病毒（噬菌體）克隆載體一、λ噬菌體克隆載體

(5)連接各崗崎片段，子代DNA形成線狀或環(huán)狀。(-)5’3’3’5’68（+）3.2病毒（噬菌體）克隆載體一、λ噬菌體克隆載體3.2病毒（噬菌體）克隆載體一、λ噬菌體克隆載體1、λ噬菌體是一種溫和噬菌體對(duì)大腸桿菌有很高的感染性，以原噬菌體的形式長(zhǎng)期潛伏在溶原細(xì)胞里，容易保存。在一定條件下又可轉(zhuǎn)入溶菌生長(zhǎng)途徑，進(jìn)行大量繁殖。2、能承載較大的外源DNA片段 λDNA頭部可包裝約36.4～51kb(自身的75%～105%)，且約有20kbλDNA可缺失（生長(zhǎng)非必需）3、在λDNA上有多種限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)（二）構(gòu)建依據(jù)3.2病毒（噬菌體）克隆載體一、λ噬菌體克隆載體策略:切去部分非必需區(qū);刪掉多余的限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn);插入選擇性標(biāo)記基因;建立體外包裝系統(tǒng)。3.2病毒（噬菌體）克隆載體一、λ噬菌體克隆載體（三）構(gòu)建的基本策略與技術(shù)路線技術(shù)路線1、用限制性酶切去非必需區(qū)，抹去多余識(shí)別位點(diǎn) 選定一種酶，以gtWES–λβ為例，EcoRI（如圖）。 （48.5kb）λDNAEcoRI6個(gè)片段 A=21.6B=4.9C=5.5D=7.5E=5.9F=3.3

B片段是λ噬菌體生長(zhǎng)非必需的； C片段缺失可阻斷溶原生長(zhǎng)途徑，但不影響溶菌途徑； E片段去掉不影響溶菌生長(zhǎng)途徑的min5序列（2.6kb）。

兩端EcoRI別點(diǎn)經(jīng)點(diǎn)突變或甲基化處理，即得gtWES–λβ：（48.5-5.5-2.6=40.4kb）克隆能力： 替換B（置換重組）：最大：51-(40.4-4.9)=15.5kb

最小：36.4-(40.4-4.9)=0.9kb插入B的任一側(cè)（插入重組）最大：51-40.4＝10.6

最?。簾o(wú) 實(shí)際應(yīng)用時(shí)克隆能力略有出入 2、在λDNA的非必需區(qū)內(nèi)插入選擇標(biāo)記基因 （1）取代red和gam基因 外源DNA取代獲Spi-表型

在P2噬菌體溶原性細(xì)胞中能生長(zhǎng)

野生型λ噬菌體(Spi+表型)

在P2噬菌體溶原性細(xì)胞中不能生長(zhǎng) 局限性：只能以P2噬菌體溶原細(xì)胞作為受體（2）最常用的篩選標(biāo)記：LacZ基因3、建立重組λDNA分子體外包裝系統(tǒng)體外重組DNA分子必須經(jīng)體外包裝成噬菌體顆粒后，才能轉(zhuǎn)導(dǎo)受體細(xì)胞。在試管中與λ噬菌體的頭部和尾部蛋白人工裝配成噬菌體顆粒，才能高效地感染大腸桿菌，把重組DNA注入受體菌。（四）λ噬菌體克隆載體的應(yīng)用（自學(xué)） 建立cDNA基因文庫(kù)克隆外源目的基因3.2病毒（噬菌體）克隆載體一、λ噬菌體克隆載體噬菌體載體單鏈?zhǔn)删w載體----M13雙鏈?zhǔn)删w載體----λ噬菌體cosmid克隆載體知識(shí)回顧思考題1、名詞解釋?zhuān)夯蚩寺≥d體、遷移作用、接合質(zhì)粒、親和質(zhì)粒、顯性質(zhì)粒。2、任一DNA分子都可作為克隆載體使用嗎？為什么？3、構(gòu)建質(zhì)粒載體時(shí)需考慮哪些特性？講究何策略？遵循什么設(shè)計(jì)原則？4、指出pBR322的結(jié)構(gòu)來(lái)源，并圖示pBR322的構(gòu)建。5、簡(jiǎn)述LacZ`的篩選機(jī)制。6、pUC質(zhì)粒的基本結(jié)構(gòu)組成。1、λDNA噬菌體中：線性宿主細(xì)胞：環(huán)狀(cos位點(diǎn))cos位點(diǎn)知識(shí)回顧2、λ噬菌體的生長(zhǎng)途徑有兩種，分別是：溶菌生長(zhǎng)途徑

和

溶源生長(zhǎng)途徑。3、在溶菌生長(zhǎng)途徑中，λDNA的復(fù)制有兩種模型：

復(fù)制

和

滾環(huán)式復(fù)制

。知識(shí)回顧1、λ噬菌體是一種溫和噬菌體對(duì)大腸桿菌有很高的感染性，以原噬菌體的形式長(zhǎng)期潛伏在溶原細(xì)胞里，容易保存。在一定條件下又可轉(zhuǎn)入溶菌生長(zhǎng)途徑，進(jìn)行大量繁殖。2、能承載較大的外源DNA片段 λDNA頭部可包裝約36.4～51kb(自身的75%～105%)，且約有20kbλDNA可缺失（生長(zhǎng)非必需）3、在λDNA上有多種限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)簡(jiǎn)述λ噬菌體載體的構(gòu)建依據(jù)？知識(shí)回顧

由質(zhì)粒和含cos位點(diǎn)的λDNA片段組裝成的載體，即cosmid.3.2病毒（噬菌體）克隆載體二、cosmid克隆載體（柯斯質(zhì)粒載體）λDNA質(zhì)粒含cos位點(diǎn)和控制包裝的序列復(fù)制子抗藥性基因克隆位點(diǎn)（一）構(gòu)建策略?1、環(huán)形雙鏈DNA分子,

≤36.4kb,一般＜10kb2、具有質(zhì)粒的性質(zhì)，可轉(zhuǎn)化大腸桿菌，并按質(zhì)粒方式復(fù)制（二）cosmid的特征3.2病毒（噬菌體）克隆載體3、含有一個(gè)cos位點(diǎn)A蛋白cos末端→體外包裝成為噬菌體，但不含λ噬菌體溶菌生長(zhǎng)途徑、溶原生長(zhǎng)途徑和DNA復(fù)制系統(tǒng)，不會(huì)產(chǎn)生子代噬菌體.4、cosmid較小，可承載更大的外源DNA 若cosmid為6.5kb，則可承載44.5(51-6.5)kb外源DNA，且能被包裝成具有感染能力的噬菌體顆粒。

因此，cosmid克隆廣泛用于構(gòu)建基因組文庫(kù)。5、方便的選擇具有抗菌素抗性基因，以及插入失活的選擇標(biāo)記、克隆位點(diǎn)。3.2病毒（噬菌體）克隆載體3.2病毒（噬菌體）克隆載體（三）理論依據(jù)利用Cosmid載體在大腸桿菌中克隆大片段的真核基因組DNA技術(shù)，叫“柯斯克隆”。（CosmidClone）cos位點(diǎn)：包裝識(shí)別。3.2病毒（噬菌體）克隆載體（四）一般過(guò)程3.2病毒（噬菌體）克隆載體3.2病毒（噬菌體）克隆載體（五）cosmid載體克隆的缺點(diǎn)解決措施3.2病毒（噬菌體）克隆載體3.2病毒（噬菌體）克隆載體cosmid克隆載體由于只有一個(gè)cos位點(diǎn)，必須先對(duì)cos位點(diǎn)進(jìn)行處理，構(gòu)成具有兩個(gè)cos位點(diǎn)的二聯(lián)體線性的DNA分子。當(dāng)外源的DNA分子插入二聯(lián)體分子，并且兩cos位點(diǎn)的片段大小合適（40kd）就可以被A蛋白切割產(chǎn)生兩個(gè)cos末端。絲狀噬菌體，內(nèi)有一環(huán)狀單鏈DNA分子（“+”鏈DNA） 大小：6.4kb

結(jié)構(gòu)：10個(gè)區(qū)基因間隔區(qū)507bp（intergenicregion，IG區(qū)）含復(fù)制起始位點(diǎn)及可插入外源DNA的位點(diǎn)三、M13噬菌體克隆載體（一）M13DNA3.2病毒（噬菌體）克隆載體三、M13噬菌體克隆載體（一）單鏈DNA噬菌體的特征(1)+DNA（ssDNA）.(2)復(fù)制型是雙鏈DNA為中間媒介。M13噬菌體感染雄性大腸桿菌后，M13的“+”DNA進(jìn)入細(xì)胞，以此為模板復(fù)制“-”DNA,,由此產(chǎn)生的DNA為雙鏈DNA（RF-DNA）。RF-DNA一般按照環(huán)狀雙鏈DNA進(jìn)行復(fù)制，同時(shí)按照“+”DNA轉(zhuǎn)譯出一些包裝蛋白。當(dāng)RF-DNA達(dá)到一定數(shù)量時(shí)，“+”DNA被阻遏蛋白結(jié)合，阻斷“-”DNA復(fù)制合成。結(jié)果細(xì)胞只能以“-”DNA為模板合成新鏈“+”DNA，而新鏈“+”DNA被積累在細(xì)胞內(nèi)的殼蛋白包裝成噬菌體，不斷被擠出宿主細(xì)胞。3.2病毒（噬菌體）克隆載體3.2病毒（噬菌體）克隆載體（一）單鏈DNA噬菌體的特征3.2病毒（噬菌體）克隆載體（一）單鏈DNA噬菌體的特征（二）M13的生活周期3.2病毒（噬菌體）克隆載體三、M13噬菌體克隆載體+DNA轉(zhuǎn)錄mRNA翻譯形成噬菌體蛋白，-DNA合成+DNA。3.2病毒（噬菌體）克隆載體策略：在RF-DNA的IG區(qū)插入選擇標(biāo)記基因，并組裝合適MCS。1.克隆區(qū)域的選定（2）酶切位點(diǎn)（1）基因間隔區(qū)（intergenicregion，IG區(qū)）該區(qū)域只有一個(gè)BsuI酶切位點(diǎn)，其余9個(gè)在其他部位。3.2病毒（噬菌體）克隆載體（三）M13噬菌體克隆載體的構(gòu)建策略和途徑三、M13噬菌體克隆載體含復(fù)制起始位點(diǎn)及可插入外源DNA的位點(diǎn)（不影響M13噬菌體活性）。3.2病毒（噬菌體）克隆載體（三）M13噬菌體克隆載體的構(gòu)建策略和途徑三、M13噬菌體克隆載體2.加入酶切位點(diǎn)（1）在IG區(qū)加入酶切位點(diǎn)在IG區(qū)內(nèi)插入大腸桿菌的LacZ序列（a-肽序列）。利用a-肽序列的三個(gè)單一酶切位點(diǎn)（BglII、AvaII和PvuI）3.2病毒（噬菌體）克隆載體（三）M13噬菌體克隆載體的構(gòu)建策略和途徑三、M13噬菌體克隆載體3.2病毒（噬菌體）克隆載體（三）M13噬菌體克隆載體的構(gòu)建策略和途徑優(yōu)點(diǎn)：1、以雙鏈環(huán)形DNA為中間媒介復(fù)制，可與質(zhì)粒一樣體外純化操作。2、制備的M13DNA單、雙鏈都能轉(zhuǎn)染大腸桿菌受體細(xì)胞。3、單鏈DNA不受包裝限制，可包裝M13DNA分子6倍的DNA分子。4、可產(chǎn)生大量純化的含外源DNA插入的單鏈DNA分子。（四）M13克隆載體的優(yōu)點(diǎn)與應(yīng)用3.2病毒（噬菌體）克隆載體三、M13噬菌體克隆載體主要用途：

克隆、分離單鏈外源DNA片段,獲得的“+”鏈可直接用于DNA測(cè)序3.2病毒（噬菌體）克隆載體（四）M13克隆載體的優(yōu)點(diǎn)與應(yīng)用花椰菜花葉病病毒（CaMV）

環(huán)狀雙鏈DNA分子（一）CaMV

DNA分子 大?。?kb

結(jié)構(gòu)：在病毒顆粒中呈開(kāi)環(huán)形式，負(fù)鏈有一缺口，正鏈有兩缺口。進(jìn)入植物細(xì)胞后單鏈部分被酶解，缺口自行閉合，成為環(huán)狀DNA分子。3.2病毒（噬菌體）克隆載體四、CaMV克隆載體G1G2G3（二）CaMV基因區(qū)8個(gè)閱讀框（ORF）和3個(gè)間隔區(qū)（IR1～3）

IR1－ORFVI與ORFVII之間

IR2－ORFVII與ORFI之間

IR3－ORFV與ORFVI之間

IR1和IR3區(qū)各有一個(gè)啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)，分別啟動(dòng)同方向轉(zhuǎn)錄35SRNA和19SRNA，而兩者的終止子都在IR1區(qū)。

35S啟動(dòng)子——組成型強(qiáng)啟動(dòng)子。組裝了35S啟動(dòng)子的外源基因可在植物細(xì)胞高效表達(dá)，在藍(lán)藻細(xì)胞內(nèi)也有效表達(dá)。（三）CaMV的增殖和感染

1、增殖途徑：

CaMV顆?！料x(chóng)→病毒DNA進(jìn)入植物細(xì)胞核→ 轉(zhuǎn)錄19SRNA→翻譯

35SRNA→翻譯反轉(zhuǎn)錄“-”鏈DNA→復(fù)制出“+”鏈2、CaMV-DNA可轉(zhuǎn)染植物細(xì)胞 在ORFII和ORFVII區(qū)插入外源DNA后仍能轉(zhuǎn)染植物細(xì)胞包裝成新的CaMV顆粒（四）構(gòu)建CaMV克隆載體的基本策略和途徑策略：

CaMV-DNA能侵入植物細(xì)胞而將目的基因?qū)耄⑶仪宄鼵aMV對(duì)植物的致病性基因.途徑1、構(gòu)建互補(bǔ)克隆載體。組裝(目的基因+標(biāo)記基因)而無(wú)感染能力+兩種基因和感染能力都無(wú)→彼此獲得對(duì)方產(chǎn)物→感染能力。很少被采用。2、構(gòu)建置換型克隆載體。置換的外源基因較小3、構(gòu)建混合型克隆載體。

CaMV-DNA→合適的限制性酶切→組入Ti的T-DNA區(qū)→完成構(gòu)建4、構(gòu)建CaMV-融合基因克隆載體系統(tǒng)。 將35S啟動(dòng)子與目的基因融合，高效表達(dá)目的基因。