基因芯片技術原理與應用

基因芯片技術原理與應用美國CartesianProSys5510全自動生物芯片點樣系統(tǒng)全自動生物芯片點樣系統(tǒng)工作平臺PinArrayHeadVacuumWashStationSourcePlateSlidesVacummHold-DownSlideNest點樣針的類型SolidPinSplitPin載樣

PinshoudnotdiptoofarintosamplePinshoudtouchthebottomofwell15-20ulinaconicalwell96plate10ulinasquare-well384plate5ulinalowvolume384plate

1、連續(xù)點樣，一次取樣可點200-300個點2、可升級加裝非接觸式高速定量噴點系統(tǒng)3、片子容量：一次點片量：100片4、控制精確度：X/Y/Z位置步進電機控制，精確點樣；真空吸附固定玻片；X-Y軸移動速度：175mm/秒；一個周期速度（取樣、100張片點樣、洗針、干燥）：120秒；步進電機步進：1.3mm；點樣位置重現(xiàn)性：<±10mm5、點樣密度：不少于80,000點/片，點大?。?00-200mm6、點樣針：針型：裂縫針，實心針針容量：16根，可擴展至32根7、樣品供給：96、384、1536孔板8、片子類型：玻璃片、膜、塑料片、硅膠片主要技術指標與功能：美國PackardExpress生物芯片掃描分析系統(tǒng)

主要技術指標與功能：

1．激光器：3只：紅色633nm,綠色543nm，黃色594nm2．檢測模式：激光共聚焦檢測3．掃描方式：分次掃描4．掃描芯片規(guī)格：標準芯片，25x76mm5．掃描視野：22mmx73mm6．像素點尺寸：多種像素點尺寸掃描方式，5，10，20，30和5mm7．激發(fā)光范圍：543nm到633nm8．發(fā)射光范圍：570nm到700nm，7種檢測光（570nm,578nm,592nm,614nm,660nm,670nm,694nm）9．靈敏度：≤0.1個熒光分子/mm210．掃描速度：20線/秒，整片掃描不超過5分鐘，11．動態(tài)范圍：16bit,5個數(shù)量級12．圖形文件輸出格式：原始圖形數(shù)據(jù)（RAW）、TIFF,BMP，JPEG

基因芯片技術的原理

基因芯片技術的應用

基因芯片技術的實驗流程基因芯片技術的研究可能方向當前面臨的困難一、基因芯片技術的原理

是將生命科學研究中所涉及的不連續(xù)的分析過程(如樣品制備、化學反應和分析檢測)，利用微電子、微機械、化學、物理技術、計算機技術在固體芯片表面構建的微流體分析單元和系統(tǒng)，使之連續(xù)化、集成化、微型化。生物芯片技術有四大要點：芯片方陣的構建、樣品的制備、生物分子反應和信號的檢測。

生物芯片生物芯片的主要類型基因芯片(Genechip)又稱DNA芯片,它是在基因探針的基礎上研制出的，所謂基因探針只是一段人工合成的堿基序列，在探針上連接一些可檢測的物質(zhì)，根據(jù)堿基互補的原理，利用基因探針到基因混合物中識別特定基因。它將大量探針分子固定于支持物上，然后與標記的樣品進行雜交，通過檢測雜交信號的強度及分布來進行分析。

蛋白質(zhì)芯片與基因芯片的基本原理相同，但它利用的不是堿基配對而是抗體與抗原結合的特異性即免疫反應來檢測。蛋白質(zhì)芯片構建的簡化模型為：選擇一種固相載體能夠牢固地結合蛋白質(zhì)分子(抗原或抗體)，這樣形成蛋白質(zhì)的微陣列，即蛋白質(zhì)芯片。芯片實驗室為高度集成化的集樣品制備、基因擴增、核酸標記及檢測為一體的便攜式生物分析系統(tǒng)，它最終的目的是實現(xiàn)生化分析全過程全部集成在一片芯片上完成，從而使現(xiàn)有的許多煩瑣、費時、不連續(xù)、不精確和難以重復的生物分析過程自動化、連續(xù)化和微縮化，屬未來生物芯片的發(fā)展方向。

是最重要的一種生物芯片，也是目前研究最多的一種生物芯片?；蛐酒珼NA芯片的突出優(yōu)點在于：1、強大的類比性使得以往需多次處理的遺傳分析在同一時間和條件下快速完成。2、巨大的信息產(chǎn)出率

在一張芯片上不僅可以獲得組織、細胞、血液等基因表達信號的定性、定量分析，還可實現(xiàn)全局檢測靜態(tài)到動態(tài)、時間與空間上的差異及遺傳信息。3、高度敏感性和專一性

能可靠并準確檢測出10pg/μl的DNA樣品。

4、高度重復性

一張由尼龍膜制作的微陣列，可以重復雜交使用多達20次。5、微型化和自動化現(xiàn)已出現(xiàn)的芯片面積最大不過525cm２，最小僅有1cm２；每個陣列中陣點樣品DNA的用量僅為5nl(05μg/μl)左右；試劑用量和反應體積大大減少，反應效率卻成百倍提高。6、哺育新的實驗方法

此技術易與其它常規(guī)生物技術相融合交叉?；蛐酒@些獨一無二的特點也代表了后基因組時代技術的發(fā)展方向。基因芯片的發(fā)展史基因芯片研究始于20世紀90年代，1993年美國斯坦福大學M.Schena博士在研究植物轉錄因子時有了制造芯片的構思。1995年10月他和他的同事們獲得了成功，并在《自然》雜志上首次發(fā)表基因芯片的論文，這張芯片能一次性檢測45個基因表達的結果。1996年底，Schena與Affymatrix公司的S.Fodor創(chuàng)造了世界上第一塊DNA芯片。由此，1996年被譽為基因芯片的元年。基因芯片原理與經(jīng)典的核酸分子雜交方法(southern、northern)一致，均應用已知核酸序列作為靶基因與互補的探針核苷酸序列雜交，通過隨后的信號檢測進行定性與定量分析。具體講即是將許多特定的寡核苷酸片段或cDNA基因片段作為靶基因，有規(guī)律地排列固定于支持物上；樣品DNA/RNA通過PCR擴增、體外轉錄等技術摻入熒光標記分子或放射性同位素作為探針；然后按堿基配對原理將兩者進行雜交；再通過熒光或同位素檢測系統(tǒng)對芯片進行掃描，由計算機系統(tǒng)對每一探針上的信號作出比較和檢測，從而得出所需要的信息。

基因芯片原理基因芯片按照其結構基本上可分為兩種類型：

I型，將待測

DNA分子樣品固定在固相支持物上并與一系列游離的標記探針雜交，雜交探針或是單一的或是混合的；II型，按照預先設定順序將寡核苷酸固定于固相支持物上再與標記的DNA樣品進行雜交，由已知的寡核苷酸序列確定被檢測的DNA樣品。

基因芯片的分類癌癥相關基因表達譜芯片(CRGEC)

目前國內(nèi)基因芯片常見品種.(上海博星公司)6400點的基因芯片（面積12X14mm)二、基因芯片技術的應用基因表達分析

基因型、基因突變和多態(tài)性分析

疾病的診斷與治療

藥物研究中的應用基因芯片中醫(yī)學領域中的應用

其它應用

（一）基因表達分析1、分析基因表達時空特征

英國劍橋大學Whitehead研究所的FrankC.P.Holstege等人，應用含有酵母基因組的基因芯片，深入研究了真核細胞基因組的調(diào)節(jié)周期。應用基因組水平的表達分析，監(jiān)測那些表達受轉錄起始機制的關鍵成分控制的基因，發(fā)現(xiàn)RNA聚合酶II、主要的轉錄因子均在基因的表達中有自己特定的作用位點[15]。通過本試驗，研究人員揭示了：（1）基因特異性的轉錄因子對表達的調(diào)控作用。（2）細胞在缺乏營養(yǎng)的環(huán)境中，基因不同位點的協(xié)同調(diào)節(jié)作用的全新機制。（3）信號轉導通路的最終作用位點，在最初的幾步中就可以確定。以此試驗為基礎，研究人員進一步繪制出了酵母基因組控制圖，并由此分析出了各種調(diào)節(jié)因子在基因上不同的作用位點和其作用的分子機制。美國Stanford大學的V.R.Iyer等人[16]，對成纖維細胞中與細胞增生和損傷修復有關的基因進行了分析。通過基因芯片繪出基因表達的時空圖譜，有助于人類認識生命活動過程和特征。2、基因差異表達檢測

生命活動中基因表達的改變是生物學研究的核心問題。人類基因組編碼大約10萬個不同的基因，僅掌握基因序列信息資料，要理解其基因功能是遠遠不夠的.利用基因芯片對表達進行分析，在一次試驗中可以獲取相當于在60余萬次傳統(tǒng)的Northern雜交中所獲得的關于基因表達的信息。通過這種實驗方法，可以建立一種全新的腫瘤分類學方法，即依據(jù)每個腫瘤細胞中的基因表達情況對腫瘤細胞進行分類?；蛐酒夹g在分析基因的表達中具有不可比擬的優(yōu)勢。

3、發(fā)現(xiàn)新基因有關實驗表明在缺乏任何序列信息的條件下，基因芯片也可用于基因發(fā)現(xiàn)，如黑色素瘤生長刺激因子就是通過基因芯片技術發(fā)現(xiàn)的。4、大規(guī)模DNA測序人類基因組計劃的實施促進了高效的、自動化操作的測序方法的發(fā)展。DNA測序原理基因芯片的測序原理是雜交測序方法，即通過與一組已知序列的核酸探針雜交進行核酸序列測定的方法。在一塊基片表面固定了序列已知的八核苷酸的探針。當溶液中帶有熒光標記的核酸序列TATGCAATCTAG，與基因芯片上對應位置的核酸探針產(chǎn)生互補匹配時，通過確定熒光強度最強的探針位置，獲得一組序列完全互補的探針序列。據(jù)此可重組出靶核酸的序列?；蛐酒臏y序原理圖（二）基因型、基因突變和多態(tài)性分析

在同一物種不同種群和個體之間，有著多種不同的基因型，而這種不同，往往與個體的不同性狀和多種遺傳性疾病有著密切的關系。通過對大量具有不同性狀的個體的基因型進行比較，就可以得出基因與性狀的關系。但是，由于大多數(shù)性狀和遺傳性疾病是由多個基因同時決定的，因此分析起來就十分困難，然而基因芯片技術恰恰解決了這一問題，利用其可以同時反應數(shù)千甚至更多個基因的特性，我們就可以分析基因組中不同基因與性狀或疾病的關系。

（三)疾病的診斷與治療

人類的疾病與遺傳基因密切相關，基因芯片可以對遺傳信息進行快速準確的分析，因此它在疾病的分子診斷中的優(yōu)勢是不言而喻的，是臨床一種新的、強有力的分子工具。基因芯片技術已經(jīng)被應用于感染性疾病、腫瘤和藥物代謝等方面的研究。

1、遺傳病相關基因的定位

90年代以來,隨著人類基因組計劃的發(fā)展,各種方法被相繼創(chuàng)立并應用到基因定位中。DNA芯片充分結合并靈活運用了大規(guī)模集成電路制造技術、自動化技術、計算機及網(wǎng)絡技術、激光共聚焦掃描、DNA合成、熒光標記探針、分子雜交及分子生物學的其它技術,在這一領域的研究中有著巨大的潛力。這一技術已成為基因定位研究的高效工具。隨著遺傳病與癌癥相關基因發(fā)現(xiàn)數(shù)量的增加，變異與多態(tài)性分析將越來越重要。HGP使許多遺傳疾病基因得以定位,配合使用多位PCR(multiplex-PCR)/DNA芯片可一次篩查多種遺傳病,既經(jīng)濟快速又敏感可靠。

2、腫瘤診斷已用基因芯片檢測人鼻咽癌、肺癌基因表達譜、腫瘤原癌基因和抑癌基因的發(fā)現(xiàn)和定位。

人類惡性腫瘤中，約有60%與人類p53抑癌基因的突變有關，目前研究人員已經(jīng)研制成功了可以檢測p53基因所有編碼區(qū)（外顯子2～外顯子11）錯意突變和單堿基缺失突變的基因芯片。根據(jù)雜交后的熒光顯色圖，就可以分析出該位點為何種突變。

3、感染性疾病的診斷HIV-1基因組中rt與pro在疾病過程中易于發(fā)生多種變異，這些變異將導致病毒對多種抗病毒藥物出現(xiàn)明顯抗性，因此檢測和分析rt與pro的變異與多態(tài)性具有重要的臨床意義。

4、耐藥菌株和藥敏檢測

據(jù)WHO報告，全球每年約有800萬結核病患者，有300萬人死亡，死亡人數(shù)超過了艾滋病和瘧疾的總和。主要原因是菌株對不同的藥物產(chǎn)生了抗藥性（俄國80%TB對一種藥物產(chǎn)生抗性；美國50%為多重耐藥）。對每例患者進行菌株和藥敏鑒定是控制TB的關鍵。最近，俄美兩國科學家開發(fā)了具此功能的基因芯片，可使醫(yī)生及早使用敏感藥物。該芯片（TBBiochips）將抗性菌株的單鏈DNA標記后固定在玻片上，與待檢TB株雜交，臨床使用未見假陽性，該芯片可清洗后重復使用50次。

2023/10/18355、基因診斷基因芯片目前最主要的應用之一就是疾病診斷。從正常人的細胞中分離出mRNA后與DNA芯片雜交就可以得出標準圖譜。從病人的細胞中分離出mRNA后與DNA芯片雜交就可以得出病變圖譜。通過分析比較這兩種圖譜，就可以得出病變的mRNA表達的信息，即DNA突變發(fā)生在何部位，屬于什么樣的序列突變。文獻報道了DNA芯片用于檢測遺傳性乳腺和卵巢癌基因BRCAl第11個外顯子的突變。檢測了15例病人樣品，發(fā)現(xiàn)其中14例有基因突變。在20個對照樣品中沒有假陽性結果出現(xiàn)。研究者所用高密度DNA芯片包含96600種20mer寡核苷酸探針。探針以綠色熒光標記，目的基因轉錄產(chǎn)物即靶分子標記紅色熒光，完全雜交的分子產(chǎn)生黃色熒光信號。2023/10/1837BIOINFORMATICS

結果顯示攜帶BRCAl突變基因的雜合子來源的靶分子能與兩種探針雜交，說明雜合子中包含了野生型及突變型兩種基因。Affymetrix公司把P53基因全長序列和已知突變的探針集成在芯片上，制成P53基因芯片，將在癌癥早期診斷中發(fā)揮作用。2023/10/1838

又如，Heller等構建了96個基因的cDNA微陣列，用于檢測分析風濕性關節(jié)炎（RA）相關基因，以探討DNA芯片在感染性疾病診斷方面的應用。目前，多種診斷芯片包括結核桿菌耐藥性檢測芯片、肝炎病毒檢測芯片已逐步進入市場，基因診斷是基因芯片中最具有商業(yè)化價值的應用。（四）藥物研究中的應用從經(jīng)濟效益來說，最大的應用領域可能是制藥廠用來開發(fā)新藥。所以已經(jīng)有多家制藥企業(yè)介入芯片的開發(fā)。對于尋找新藥來說，目標之一是應用芯片可以在基因水平上尋找藥物靶標。采用所謂“譯碼器”策略（Decoderstrategy）來確定藥物靶標。從而找到“導向藥物”?；蛐酒脖挥糜趯ふ业鞍准っ敢种莆铩＜毦蚰[瘤組織的耐藥性也涉及基因改變可以用DNA芯片鑒定。1、新藥開發(fā)

高通量的DNA芯片可發(fā)現(xiàn)眾多的新基因和新的靶分子用于新藥的設計。噬菌體展示技術可創(chuàng)造大量蛋白質(zhì)，目前多用于抗體庫的建立和篩選，進而可用于受體-配體相互作用的研究。除腫瘤外，用分子生物工程設計的藥物可用于治療遺傳病及代謝疾病、抗衰老、設計新的抗生素和工業(yè)用酶等。同時，有時一種藥物的作用是多方面的，基因芯片有助于發(fā)現(xiàn)一種藥物的新的功能。原先設想的作用是針對某一靶標的，但在全基因或廣范圍篩選中卻發(fā)現(xiàn)該藥在另一方面有很強的抑制作用，從而開發(fā)成另一種新藥。２、調(diào)查藥物處理細胞后基因的表達情況

基因芯片在用來研究藥物的作用機理時十分有用。這類研究既有助于闡明藥物的作用機制，也有助于確定藥物作用的靶基因，為新藥研究提供線索。

３、對藥物進行毒性評價

應用芯片查找藥物的毒性或副作用，進行毒理學研究。尤其是慢性毒性和副作用，往往涉及基因或基因表達的改變。如果藥物能抑制重要基因的表達，則對它的深入研究就值得考慮。用芯片作大規(guī)模的表達研究往往可省略大量的動物試驗。最近,一些科學家從人和小鼠文庫中選擇約600個與毒理學相關基因的cDNA克隆，制備了種屬特異的毒理基因組學芯片，可研究肝臟毒性、內(nèi)分泌干擾、致癌作用等毒性終點的作用機制，也可用于確定以基因表達模式為基礎的化合物的毒性。2023/10/18434、藥物篩選

如何分離和鑒定藥的有效成分是目前中藥產(chǎn)業(yè)和傳統(tǒng)的西藥開發(fā)遇到的重大問題，基因芯片是解決這一問題的有效手段，它能夠大規(guī)模地篩選、通用性強，能夠從基因水平解釋藥物的作用機理，即可以利用基因芯片分析用藥前后機體的不同組織、器官基因表達的差異。如果再以cDNA表達文庫得到的肽庫來制作肽芯片，則可以從眾多的藥物成分中篩選到起作用的部分物質(zhì)。2023/10/1844BIOINFORMATICS

利用RNA、單鏈DNA有很大的柔性，能形成復雜的空間結構，更有利于與靶分子相結合的特點，可將核酸庫中的RNA或單鏈DNA固定在芯片上，然后與靶蛋白結合，形成蛋白質(zhì)-RNA或蛋白質(zhì)-DNA復合物，可以篩選特異的藥物蛋白或核酸，因此，芯片技術和RNA庫的結合在藥物篩選中有廣泛應用。（五）基因芯片中醫(yī)學領域中的應用

1、中藥的研究，具體的方法，同上述藥物篩選方法類似

2、中醫(yī)“證”本質(zhì)的研究

3、針灸原理研究

基因芯片可以幫助中醫(yī)藥走向世界研究天然藥物對人體的作用機制篩選對人體有生物效應的單味天然藥物篩選對人體有生物效應的有效成分篩選對人體有生物效應的天然藥物配方中藥的研究。尤其中藥中眾多成分中有效成分的篩選、有效藥物的篩選、中藥毒理學過程均被大大簡化，將推動中藥的迅猛發(fā)展。中藥學引入基因芯片技術，將大大推動中藥研究的國際化進程，為闡明中藥作用機理，具有無可估量的重要意義。

（六）其它應用

1、環(huán)境化學毒物的篩選

2、體質(zhì)醫(yī)學的研究

三、基因芯片技術的實驗流程基因芯片的微陣列制備基因芯片樣品制備

基因芯片雜交

基因芯片檢測

GeneChip的操作流程總RNA的提取----AAAA反轉錄互補DNA體外轉錄LLLLLLL生物素標記的cRNA片斷化處理帶標記的cRNA片斷LL標記的cRNA片斷L雜交液雜交混合液的制備Genechip雜交洗脫掃描數(shù)據(jù)分析2023/10/1852

在進行探針設計和布局時必需考慮以下幾個方面：①互補性：探針與待檢測的目標序列片段互補；②敏感性和特異性：要求探針僅僅對特定目標序列片段敏感，而對其他序列不產(chǎn)生雜交信號；③容錯性：通過探針設計，提高基因芯片檢測的容錯性，常用的方法是使用冗余探針；2023/10/1853④可靠性：通過探針設計，提高基因芯片檢測的可靠性；⑤可控性：在基因芯片上設置質(zhì)量監(jiān)控探針，以便于監(jiān)控基因芯片產(chǎn)品的質(zhì)量；⑥可讀性：通過探針布局，使得最終的雜交檢測圖像便于觀察理解，如將檢測相關基因的探針放在芯片上相鄰的區(qū)域；⑦高信號量的探針不要影響到其他探針的信號。2023/10/1854

在探針設計方面，最重要的是所有探針的雜交溫度要盡量接近。為了提高芯片對雜交錯配的辨別能力，人們提出了一種優(yōu)化設計方法。該方法的基本思想是通過動態(tài)調(diào)節(jié)各個探針的長度及探針之間的覆蓋長度，使所設計的各個探針的解鏈溫度Tm最大程度地保持一致，從而有效地提高對堿基雜交錯配的辨別能力，提高基因芯片檢測結果的可靠性。2023/10/1855BIOINFORMATICS

采用生物信息學中常用的動態(tài)規(guī)劃算法進行優(yōu)化，以使得各個探針具有相近解鏈溫度作為優(yōu)化目標，篩選并優(yōu)化組合各候選探針。在優(yōu)化組合時要求各探針的長度和相鄰探針之間的交疊長度滿足給定的約束條件，經(jīng)過優(yōu)化組合以后得到一組覆蓋目標序列的探針。2023/10/1856基因芯片的制作。要成功的制作芯片，需要準備三大材料：準備固定在芯片上的生物分子樣品（即探針）、芯片片基和制作芯片的儀器。（一）基因芯片的微陣列制備

片基的處理微陣列構建1、片基的處理APS-PDC修飾片基：APS指3-氨丙基三甲氧基硅烷，

PDC指1，4-苯二異硫氰酸鹽。此法被廣泛應用。

多聚賴氨酸修飾片基：多聚賴氨酸與玻璃表面的負電荷結合吸附在玻璃表面上，DNA鏈帶正電荷可與玻片表面上的多聚賴氨酸結合，從而固定在玻片上。由于離子間相互作用比較弱，DNA固定率比較低。沒有被廣泛采用。巰基修飾片基：此方法中所用到的巰基和二硫基團分別具有較強的氧化性和還原性，成品玻片的穩(wěn)定性較差，應用不多。

原位合成直接點樣原位光蝕刻合成原位噴印合成2、微陣列構建1、原位光蝕刻合成

寡聚核苷酸原位光蝕刻合成技術是由Affymetrix公司開發(fā)的，采用的技術原理是在合成堿基單體的3‘羥基末端連上一個光敏保護基。合成的第一步是利用光照射使羥基端脫保護，然后一個3'端保護的核苷酸單體連接上去，這個過程反復進行直至合成完畢。使用多種掩蓋物能以更少的合成步驟生產(chǎn)出高密度的陣列，在合成循環(huán)中探針數(shù)目呈指數(shù)增長。2、原位噴印合成芯片原位噴印合成原理與噴墨打印類似，不過芯片噴印頭和墨盒有多個，墨盒中裝的是四種堿基等液體而不是碳粉。噴印頭可在整個芯片上移動并根據(jù)芯片上不同位點探針的序列需要將特定的堿基噴印在芯片上特定位置。該技術采用的化學原理與傳統(tǒng)的DNA固相合成一致，因此不特殊制備的化學試劑。直接點樣法將合成好的探針、cNDA或基因組DNA通過特定的高速點樣機器人直接點在芯片上。點樣分子可以是核酸也可以是寡核酸。一些研究者采用人工點樣的方法將寡核苷酸分子點樣于化學處理后的載玻片上，經(jīng)一定的化學方法處理非干燥后，寡核苷酸分子即固定于載玻片上，制備好的DNA芯片可置于緩沖液中保存。由于方法費時費力，不適于大規(guī)模DNA芯片制作，因而實現(xiàn)自動化點樣就顯得尤為重要。

適用于寡核苷酸；直接點樣多用于大片段DNA，有時也用于寡核苷酸，甚至mRNA較簡單，只需將預先制備好的寡核苷酸或cDNA等樣品通過自動點樣裝置點于經(jīng)特殊處理的玻璃片或其它材料上即可。原位合成點樣法（二）基因芯片樣品制備分離純化、擴增、獲取其中的DNA、RNA并用熒光標記；或將樣品先抽提mRNA，然后

反轉錄成cDNA。同時摻入帶熒光標記的dCTP或dUTP。1、探針DNA（ProbeDNA)的合成

TheprobeDNAistheDNAwhichisappliedtotheDNAmicroarryandhybridizeswithcomplementaryDNAattachedtothesurfaceoftheslide.2、目標DNA(TargetDNA)

TargetDNAisdefinedastheDNAtobeattachedtheglassslideandprobedbytheprobeDNA.分離純化、擴增、獲取其中的DNA、RNA;或將樣品先抽提mRNA，然后

反轉錄成cDNA。全自動核酸蛋白純化站全自動核酸蛋白純化站工作平臺

一般所需mRNA的量是以一張表達譜芯片需要3μgmRNA計算的樣本采集過程關鍵點．

氰代磷酸二乙酯(DEPC)離體新鮮組織，切成多個1cm3小塊，剔除結締組織和脂肪組織。胃、腸組織應剪除外膜；肝、腎、脾應剪除門部血管神經(jīng)，腫瘤組織應將周圍的正常組織切除干凈（正常組織也應將周圍的腫瘤組織切除干凈）。在RNase-Free0.9％生理鹽水中漂洗樣品，以去除血漬和污物。

用鋁箔包裹組織，或用5ml凍存管裝載組織(但最好統(tǒng)一采用鋁箔)。用記號筆在鋁箔或凍存管外表寫明樣品編號，并貼上標簽，迅速投入液氮冷卻。填寫樣品登記表，寫明樣品名稱、種類、編號、取樣日期、樣品處理情況等將液氮冷卻的組織放入樣品袋（每個樣品袋只保存同樣的組織），袋口留一根編號繩，繩上粘一張標簽紙（標簽上注明：樣品名稱、編號、日期），迅速轉入便攜式液氮罐保留1-2張取材部位的病理切片。（三）基因芯片雜交該反應是指標記的樣品與芯片上的靶基因進行雜交，產(chǎn)生檢測信號的過程。

1、不依賴于酶反應的雜交2、依賴于酶反應的雜交3、二硫鍵修飾芯片兩步法延伸反應雜交2023/10/1874適合于在玻璃片的雜交液有多種，比較典型的配方，如雜交溶液配方A（雜交溫度42℃）：50％甲酰胺，6×SCC，0.5％SDS，5×Denhardt試劑；

配方B（雜交溫度65℃）：6×SCC，0.5％SDS，5×Denhardt試劑；配方C（雜交溫度65℃）：10％SDS，7％的PEG－8000。用于檢測的基因芯片先進行封閉預雜交30min，然后用含有靶基因的雜交液在雜交溫度下孵育8－24h，用清洗液清洗后離心干燥。2023/10/1875

雜交條件的選擇與研究目的有關，多態(tài)性分析或者基因測序時，每個核苷酸或突變部位都必須檢測出來，通常設計出一套4種寡核苷酸，在靶序列上跨越每個位點，只在中央位點堿基有所不同，根據(jù)每套探針在某一特定位點的雜交嚴謹程度，即可測定出該堿基的種類。2023/10/1876如果芯片僅用于檢測基因表達，只需設計出針對基因中的特定區(qū)域的幾套寡核苷酸即可，表達檢測需要長的雜交時間，較低的嚴謹性，更高的樣品濃度和低溫度，這有利于增加檢測的特異性和低拷貝基因檢測的靈敏度。突變檢測，要鑒別出單堿基錯配，需要更高的雜交嚴謹性和更短的時間。

2023/10/1877此外，雜交反應還必須考慮雜交反應體系中鹽濃度、探針GC含量和所帶電荷、探針與芯片之間連接臂的長度及種類、檢測基因的二級結構的影響。有資料顯示探針和芯片之間適當長度的連接臂可以使雜交效率提高150倍。連接臂上的正或負電荷都將減少雜交效率。由于探針和檢測基因均帶負電荷，因此影響它們之間的雜交結合，為此有人提出用不帶電荷的肽核酸（PNA）做探針。2023/10/1878雖然PNA的制備比較復雜，但與DNA探針比較有許多特點，如不需要鹽離子，因此可防止檢測基因二級結構的形成及自身復性。由于PNA－DNA結合更加穩(wěn)定和特異，因此更有利于單堿基錯配基因的檢測。（四）基因芯片檢測芯片經(jīng)雜交反應后，各反應點形成強弱不同的光信號圖像，用芯片掃描儀和相關軟件加以分析，即可獲得有關的生物信息。

通常檢測芯片上的雜交信號需要高靈敏度的檢測系統(tǒng)——閱讀儀（scannerorreader）。閱讀儀的成像原理分為激光共焦掃描和CCD成像兩種。激光共焦掃描與CCD相比，分辨率和靈敏度較高，但是掃描速度較慢且價格昂貴。經(jīng)熒光樣品雜交后的芯片，熒光信號可以經(jīng)過熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡或激光掃描儀進行信號的收集，收集后的信號經(jīng)過計算機處理，并與探針陣列位點進行比較，可得出雜交的檢測結果。基因芯片生物信息學分析流程圖芯片原始數(shù)據(jù)圖像提取原始數(shù)據(jù)入庫NormalizationRation分析Cluster顯著性表達差異基因相似表達譜基因2023/10/1882檢測結果分析基因芯片檢測結果的分析主要包括三個方面：

1）熒光檢測圖像分析。基因芯片與熒光樣品雜交后，用圖像掃描儀器捕獲芯片上的熒光圖像。許多基因芯片研究機構已開發(fā)出一些基因芯片圖像處理軟件，例如GenePix、ImageGene、BioDiscovery、ScanAlyze等。2023/10/1883基因芯片圖像處理最基本的目標是確定每個芯片單元的熒光強度或熒光強度對比值（多色熒光標記的情況下）。目標看上去雖然簡單，但是目前還沒有通用的處理方法。掃描和處理基因芯片圖像仍需要人工干預，以對齊網(wǎng)格線，保證正確標定每個芯片單元的位置，同時還要能夠去除圖像上的污點以及其他形式的圖像噪聲。2023/10/18842）檢測結果分析。如果芯片檢測的目的是測定序列，則要根據(jù)芯片上每個探針的雜交結果判斷樣本中是否含有對應的互補序列，并利用生物信息學中的片段組裝算法連接各個片段，形成更長的目標序列；如果檢測的目的是進行序列變異的分析，則要根據(jù)正確匹配探針以及錯配探針（錯配探針是指探針中有一個或幾個與靶基因核苷酸序列不同的探針）在基因芯片對應位置上的熒光強度，給出序列變化的位點，并指明發(fā)生什么變化；2023/10/1885如果芯片檢測的目的是進行基因表達分析，則需要給出芯片上各個基因的表達譜，定量描述基因的表達水平，進一步分析還包括基因表達模式進行聚類，尋找基因之間的相關性，發(fā)現(xiàn)協(xié)同工作的基因。2023/10/18863）檢測結果可靠性分析?；蛐酒且粋€非常復雜的系統(tǒng)，包括許多環(huán)節(jié)，由于目前技術上的限制，在基因芯片制備、雜交及檢測等方面都可能出現(xiàn)誤差，芯片檢測結果并非100％可靠。2023/10/1887因此，必須對芯片檢測結果作出可靠性的評價?？煽啃苑治鲋饕獜膬蓚€方面進行：一是根據(jù)實驗統(tǒng)計誤差（如探針合成的錯誤率、全匹配探針與錯誤探針的誤識率等），計算出基因芯片最終結果的可靠性；二是對基因芯片與樣品序列雜交過程進行分子動力學研究，建立芯片雜交過程的計算機仿真實驗模型，以便在制作芯片之前分析所設計芯片的性能，預測芯片實驗結果的可靠性。1、樣品制備上，當前多數(shù)公司在