血漿中丁丙諾啡液相色譜質(zhì)譜lcms分析

血漿中丁丙諾啡液相色譜質(zhì)譜lcms分析

氨基乙酰氯，也被稱為“波諾酸”和“漢諾酸”，是由托吡咯引起的。這是一種抗凝劑。丁丙諾啡在藥用中對(duì)急慢性、中強(qiáng)度痛疼有良好的療效,是強(qiáng)效鎮(zhèn)痛藥物。除臨床用藥外,人體對(duì)丁丙喏啡具有依賴性和成癮性,一些吸毒者將丁丙諾啡含片作為海洛因的替代品,因此近年來(lái)丁丙諾啡已成為司法鑒定中較常見(jiàn)的分析目標(biāo)物之一。由于丁丙諾啡對(duì)人體作用較大,人食用或注射丁丙諾啡的劑量一般比較小,檢驗(yàn)時(shí)所用檢材往往局限于人體的尿、血等體液檢材。本實(shí)驗(yàn)建立了血漿中丁丙諾啡LC/MS分析方法,該方法靈敏度高,可用于血漿中丁丙諾啡的分析。1材料和方法1.1lc-10advp系統(tǒng)LCMS-2010液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(日本島津公司),包括LC-10ADVP低壓四元梯度泵,CTO-10AVP柱溫箱,SCL-10ADVP系統(tǒng)控制器,LCMSsolution工作站。1.2標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液的配制鹽酸丁丙諾啡(購(gòu)自公安部物證鑒定中心);401有機(jī)擔(dān)體(購(gòu)自沈陽(yáng)市化學(xué)試劑五廠)。丁丙諾啡標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液稱取鹽酸丁丙諾啡1.08mg(折算成丁丙諾啡1.00mg),用10mL甲醇溶解,并定容至100mL,配制成10μg/mL的丁丙諾啡標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。奮乃靜標(biāo)準(zhǔn)品溶液稱取奮乃靜1.00mg,用10mL甲醇溶解,并定容至100mL,配制成10μg/mL的奮乃靜標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。1.3電噴霧分析ds色譜柱:ThermoHypersil-HyPURITYC18(150×2.1mm,5μm),柱溫:40℃,流動(dòng)相:10mMNH4AC(pH3.4)∶甲醇∶乙腈=36∶52∶12,流速:0.22mL/min,電噴霧電離源(ESI),選擇性正離子監(jiān)測(cè)(SIM),質(zhì)荷比(m/z)為468(丁丙諾啡,M+H),404(奮乃靜,M+H)帶正電荷的分子離子峰,電離源電壓:4.5kV,檢測(cè)器電壓:1.6kV,CDL溫度:250℃,Block溫度200℃,噴霧氣(N2)流速1.5L/min,干燥氣(N2)流速10L/min。1.4裝3-甲基-5-脂棉取待檢血漿1mL,加內(nèi)標(biāo)奮乃靜10ng,加pH10.8緩沖液1mL,渦旋5min;取細(xì)長(zhǎng)玻璃管一支(長(zhǎng)17cm,內(nèi)徑7mm),底部塞少許脫脂棉,裝401有機(jī)擔(dān)體3cm3,用6mL甲醇活化,用6mL蒸餾水洗去甲醇;將待檢血漿過(guò)柱,用6mL蒸餾水洗去水溶性雜質(zhì),再用6mL三氯甲烷洗脫,收集洗脫液于試管中,3000rpm離心6min(離心半徑5cm),分出有機(jī)相,于50℃水浴中氮?dú)饬飨聯(lián)]干,用50μL流動(dòng)相溶解殘余物,取5μL進(jìn)行LC/MS分析。2結(jié)果2.1斷裂率及色譜圖空白血漿、空白血漿添加丁丙諾啡及服藥者血漿(添加內(nèi)標(biāo)奮乃靜)按1.4方法進(jìn)行,丁丙諾啡和奮乃靜的質(zhì)譜掃描圖見(jiàn)圖1,空白血漿、空白血漿添加丁丙諾啡及服藥者血漿總離子圖見(jiàn)圖2～4。從圖可見(jiàn),該色譜條件下分析物和內(nèi)標(biāo)物都得到了完全分離,丁丙諾啡出峰時(shí)間在2.5min左右,內(nèi)標(biāo)奮乃靜出峰時(shí)間在4.5min左右,峰形良好,檢材中內(nèi)源性雜質(zhì)對(duì)分析無(wú)干擾。2.2線性范圍與檢出限取空白血漿6份,每份1mL,分別加入丁丙諾啡0.05,0.1,0.2,0.5,1.0,2.0,5.0ng,并加入內(nèi)標(biāo)奮乃靜10ng,按1.4方法進(jìn)行提取、進(jìn)樣分析,以丁丙諾啡與內(nèi)標(biāo)峰面積比(Y)對(duì)分析物濃度為X(μg/L)進(jìn)行線性回歸,丁丙諾啡的回歸方程:Y=2.7382X+0.1034,r=0.9998,線性范圍為0.05～5.0μg/L。分析物峰面積相當(dāng)于基線噪音3倍的濃度確定為檢出限,檢出限為0.01μg/L;分析物在0.05μg/L以上具有良好的線性關(guān)系,確定定量限為0.05μg/L。2.3內(nèi)標(biāo)勇設(shè)計(jì)內(nèi)標(biāo)超出分別取空白血漿15份,每份1mL,分為三組,每組分別添加丁丙諾啡0.1,0.5,2.0ng,并加入內(nèi)標(biāo)奮乃靜10ng,按1.4方法進(jìn)行提取、進(jìn)樣分析。另分別取丁丙諾啡0.1,0.5,2.0ng和內(nèi)標(biāo)奮乃靜10ng的混合液,揮干,用50μL流動(dòng)相溶解、取5μL進(jìn)樣分析。經(jīng)提取與未經(jīng)提取分析物與內(nèi)標(biāo)物的色譜峰面積比計(jì)算其回收率及精密度,結(jié)果見(jiàn)表1。2.4血漿中丁丙諾啡的提取、進(jìn)樣測(cè)定2名健康、近期未服任何藥物志愿者各口服丁丙諾啡含片0.8mg(服藥后1,2,4,8,12,24,36,48h取血漿,按1.4方法進(jìn)行提取、進(jìn)樣分析,由2.2線性回歸方程求得血漿中丁丙諾啡的濃度,結(jié)果見(jiàn)表2。3丁丙諾啡液液萃取萃取分離在LC/MS分析中,定量重復(fù)性相對(duì)較差,并且在檢材的前處理過(guò)程中,涉及的步驟多,也影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性,本文采用添加內(nèi)標(biāo)的方法消除這些影響。內(nèi)標(biāo)物的選擇要考慮其結(jié)構(gòu)及其提取行為與丁丙諾啡相似,本文考查了長(zhǎng)春西汀、氯氮平及奮乃靜作內(nèi)標(biāo)物的色譜行為,結(jié)果表明:長(zhǎng)春西汀、氯氮平對(duì)分析物有干擾,本文選擇奮乃靜為內(nèi)標(biāo)物。本實(shí)驗(yàn)考查了血漿中丁丙諾啡液液萃取方法,取待檢血漿1mL,加1.0mL無(wú)水乙醇沉淀蛋白,加pH7緩沖液1mL,加三氯甲烷5mL,渦旋5min,3000r/min離心6min,分取有機(jī)相,重復(fù)一次,合并提取液,于50℃水浴中氮?dú)饬飨麓蹈?用50μL流動(dòng)相溶解殘余物,取5μL進(jìn)行LC/MS分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:液液萃取因受血漿中蛋白影響提取率稍低于固相萃取。對(duì)于丁丙諾啡的檢驗(yàn),目前國(guó)內(nèi)外已有一些報(bào)導(dǎo),多為GC/