inesesenin功能結(jié)構(gòu)域的研究進(jìn)展

inesesenin功能結(jié)構(gòu)域的研究進(jìn)展

細(xì)胞的吞咽和積聚是調(diào)節(jié)細(xì)胞物質(zhì)運(yùn)輸和質(zhì)膜更新的重要生理過(guò)程。胞吞作用對(duì)于維持細(xì)胞與外界環(huán)境的協(xié)調(diào)十分重要。胞吐作用廣泛參與細(xì)胞遷移、軸突膜生長(zhǎng)、神經(jīng)傳遞以及激素釋放等生理過(guò)程。Intersectin蛋白在進(jìn)化上高度保守,是一種多功能的銜接蛋白/支架蛋白,具有多個(gè)功能結(jié)構(gòu)域,通過(guò)與多種蛋白質(zhì)結(jié)合,調(diào)節(jié)細(xì)胞的胞吞和胞吐、肌動(dòng)蛋白骨架重排、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞的生存。本文綜述近年來(lái)有關(guān)intersectin的研究進(jìn)展,闡釋intersectin的分類、亞型及其在胞吞和胞吐中的功能,并進(jìn)一步探討其與相關(guān)疾病的聯(lián)系。1分類、結(jié)構(gòu)和功能1.1intesityin-s的結(jié)構(gòu)人類有兩個(gè)intersectin基因,分別命名為intersectin1和intersectin2,二者的氨基酸序列和結(jié)構(gòu)域高度相似。在脊椎動(dòng)物中,選擇性剪接是轉(zhuǎn)錄物組和蛋白質(zhì)組變異的主要來(lái)源,受此影響每個(gè)intersectin的基因產(chǎn)物都包含長(zhǎng)亞型(intersectin-L)和短亞型(intersectin-S)。Intersectin-S從氨基端開(kāi)始依次是2個(gè)EH結(jié)構(gòu)域(Eps15homologydomain),1個(gè)卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域,5個(gè)連續(xù)的SH3結(jié)構(gòu)域(scrhomology3domain)。Intersectin-L除具有短亞型的結(jié)構(gòu)外,其羧基端還含有1個(gè)DH結(jié)構(gòu)域(Dblhomologydomain),1個(gè)PH結(jié)構(gòu)域(pleckstrinhomologydomain)和1個(gè)C2結(jié)構(gòu)域。Intersectin-S在胰臟、腎上腺、甲狀腺、星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞等多種組織和細(xì)胞中表達(dá),而intersectin-L主要在神經(jīng)元中表達(dá)。Intersectin-S參與多種細(xì)胞的胞吞作用,而intersectin-L的作用較專一,是神經(jīng)元突觸囊泡循環(huán)的必需組分。1.2卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域?qū)ν挥|囊泡含物識(shí)別活性的影響Intersectin作為支架蛋白通過(guò)其不同的結(jié)構(gòu)域結(jié)合其他蛋白發(fā)揮功能。Intersectin-S和intersectin-L共有結(jié)構(gòu)域:EH結(jié)構(gòu)域可以結(jié)合epsin1/2和stonedB,epsin1/2參與網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞,stonedB作為分選蛋白在突觸囊泡內(nèi)含物識(shí)別中發(fā)揮作用;卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域能夠結(jié)合Eps15、SNAP23/25,是參與胞吞和胞吐的關(guān)鍵組分;5個(gè)SH3結(jié)構(gòu)域與dynamin、syna-ptojanin、WASP(Wiskott-Aldrichsyndromeprotein)、Arp2/3以及Sos等多種胞吞蛋白相結(jié)合,在細(xì)胞骨架重排和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用。Intersectin-L獨(dú)有結(jié)構(gòu)域:DH結(jié)構(gòu)域是Rho蛋白家族蛋白分子Cdc42的鳥(niǎo)核苷酸交換因子(guaninenucleotideexchangefactor,GEF);PH結(jié)構(gòu)域能結(jié)合磷酸肌醇,與膜定位密切相關(guān),PH結(jié)構(gòu)域調(diào)節(jié)DH結(jié)構(gòu)域的核苷酸交換活性,因此DH-PH片段比單獨(dú)的DH結(jié)構(gòu)域的核苷酸交換活性強(qiáng);C2結(jié)構(gòu)域可以與磷脂膜結(jié)合,在鈣離子依賴性或非依賴性的條件下結(jié)合可溶性磷脂肌醇。2內(nèi)省在吞和吐之間的作用2.1突觸囊泡的分子活性突觸囊泡循環(huán)(synapticvesiclerecycling)是實(shí)現(xiàn)神經(jīng)信號(hào)跨突觸傳遞的重要途徑。Intersectin是公認(rèn)的銜接蛋白,同dynamin一樣,在突觸囊泡循環(huán)的活躍位點(diǎn)發(fā)揮重要作用。突觸囊泡胞吐過(guò)程十分復(fù)雜,大體可分為:囊泡的錨定,膜蛋白和膜脂融合,融合孔開(kāi)放,融合孔擴(kuò)大,突觸囊泡釋放神經(jīng)遞質(zhì)5個(gè)步驟。突觸囊泡的融合過(guò)程與SNARE(SNAPreceptor)有關(guān),每個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)囊泡都有特異的v-SNARE,能識(shí)別并結(jié)合靶膜上的t-SNARE,決定囊泡在靶膜上的錨定與融合。突觸小泡連接膜蛋白(synaptobrevin)是突觸囊泡膜上一種v-SNARE,而syntaxin是突觸質(zhì)膜上一種t-SNARE。SNAP-25、syntaxin和synaptobrevin形成穩(wěn)定的核心復(fù)合物,起始膜融合過(guò)程,之后融合孔開(kāi)放并逐漸擴(kuò)大,釋放出神經(jīng)遞質(zhì)。三者核心復(fù)合物的形成是突觸囊泡胞吐的關(guān)鍵環(huán)節(jié),同時(shí)也是非神經(jīng)細(xì)胞胞吐所必需的。研究顯示intersectin1的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域與SNAP-25特異性結(jié)合,介導(dǎo)該核心復(fù)合物的形成。此外,在嗜鉻細(xì)胞和PC12細(xì)胞中,Intersectin1聚集在胞吐活躍的位點(diǎn),并且與SNAP-25共定位。Intersectin1基因敲降小鼠的轉(zhuǎn)運(yùn)囊泡數(shù)量降低,嗜鉻細(xì)胞中胞吐作用減少。因此,intersectin1是突觸神經(jīng)遞質(zhì)釋放過(guò)程的功能組分。網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的胞吞是突觸囊泡回收的主要途徑。囊泡膜結(jié)合到突觸前膜上并移動(dòng)到內(nèi)吞區(qū)域,胞質(zhì)蛋白AP2識(shí)別囊泡組分,并與其他胞吞蛋白結(jié)合,起始胞吞過(guò)程。Pechstein等研究顯示,intersectin1與AP2的α和β2亞基緊密連接,并且在突觸囊泡上共定位。利用特異性抗體封閉intersectin1-AP2復(fù)合物的形成將阻礙突觸囊泡循環(huán)的早期階段,導(dǎo)致大量質(zhì)膜囊泡和凹窩的累積,intersectin1-AP2復(fù)合物形成突觸囊泡循環(huán)的起始核心,在網(wǎng)格蛋白有被小窩組裝的早期階段發(fā)揮重要作用。Intersectin1-AP2復(fù)合物形成之后,3個(gè)網(wǎng)格蛋白二聚體形成三腳蛋白復(fù)合體,隨后聚集形成網(wǎng)格蛋白有被小窩。dynamin水解與其結(jié)合的GTP引起網(wǎng)格蛋白有被小窩頸部縊縮,最終脫離質(zhì)膜形成網(wǎng)格蛋白有被小泡。Evergren等研究證實(shí)intersectin1調(diào)控聚集到內(nèi)吞區(qū)域的dynamin的數(shù)量,通過(guò)微注射特異性抗體強(qiáng)烈干擾intersectin1-dynamin的連接,將抑制胞吞過(guò)程中囊泡的脫離,以七腮鰻為模式生物,用其intersectin1的SH3結(jié)構(gòu)域GST融合蛋白來(lái)親和純化腦提取物中與intersectin1結(jié)合的蛋白,證實(shí)dynamin與intersectin1的SH3A、C、E結(jié)構(gòu)域相互結(jié)合。盡管多數(shù)的研究集中在intersectin1,也有研究顯示intersectin2在網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞中發(fā)揮作用。Pucharcos等報(bào)道intersectin2與胞吞蛋白的亞細(xì)胞分布相似,過(guò)表達(dá)intersectin2的任何一個(gè)亞型都會(huì)阻礙網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的胞吞作用,這可能是由于其大量結(jié)合并封閉了參與胞吞過(guò)程的其它蛋白所致。同時(shí),Pucharcos等發(fā)現(xiàn)intersectin1和intersectin2長(zhǎng)短亞型的結(jié)構(gòu)并沒(méi)有明顯的不同,而在胞吞過(guò)程中intersectin1結(jié)合dynamin的能力強(qiáng)于intersectin2,可能是由于它們SH3A結(jié)構(gòu)域(相似度62%)的差異造成的。2.2ecren1-s抑制劑的激活和抑制細(xì)胞內(nèi)吞的作用細(xì)胞質(zhì)膜微囊的內(nèi)吞是內(nèi)皮細(xì)胞物質(zhì)運(yùn)輸?shù)囊粋€(gè)重要步驟,研究表明intersectin與該內(nèi)吞途徑密切相關(guān),intersectin的SH3結(jié)構(gòu)域與dynamin富含脯氨酸的羧基端結(jié)構(gòu)域結(jié)合,二者在細(xì)胞質(zhì)膜微囊的頸部共定位,并在細(xì)胞質(zhì)膜微囊的脫離過(guò)程中發(fā)揮作用。過(guò)表達(dá)intersectin1-S導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)膜微囊的形態(tài)異常,形成簇狀或葡萄樣結(jié)構(gòu),抑制細(xì)胞質(zhì)膜微囊介導(dǎo)的內(nèi)吞作用。Yamabhai等進(jìn)一步探討了intersectin的五個(gè)SH3結(jié)構(gòu)域中哪些結(jié)構(gòu)域影響了其與dynamin的結(jié)合,結(jié)果表明SH3A與dynamin的結(jié)合能力最強(qiáng),SH3C和SH3E的結(jié)合能力較弱,而SH3B和SH3D不與dynamin結(jié)合。Yoshida等研究顯示SH3結(jié)構(gòu)域能夠通過(guò)激活dynamin的GTP酶活化而抑制細(xì)胞質(zhì)膜微囊的內(nèi)吞。Knezevic等利用myc-SH3A瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人肺部?jī)?nèi)皮細(xì)胞以干擾intersectin1和dynamin2結(jié)合,可以導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)膜微囊形態(tài)異常和細(xì)胞質(zhì)膜微囊堆積,進(jìn)而抑制細(xì)胞質(zhì)膜微囊內(nèi)吞,該結(jié)果表明intersectin的SH3A結(jié)構(gòu)域調(diào)控dynamin2的聚合以及GTP酶活性,通過(guò)延長(zhǎng)dynamin2寡聚體的作用時(shí)間,SH3A結(jié)構(gòu)域截獲從質(zhì)膜釋放的細(xì)胞質(zhì)膜微囊并調(diào)控運(yùn)輸囊泡的形成。2.3iii型假性醛固酮減少癥pseud人類WNK1和WNK4突變影響腎臟內(nèi)鈉鉀運(yùn)輸,導(dǎo)致高血壓和高鉀血癥的發(fā)生。WNK1和WNK4募集胞吞支架蛋白intersectin,募集反應(yīng)需要WNK特殊的富含脯氨酸的PXXP基序參與,但不依賴其激酶活性,PXXP基序能與intersectin的SH3結(jié)構(gòu)域結(jié)合,把dynamin和synaptojanin募集到胞吞區(qū)域,激活網(wǎng)格蛋白有被小泡介導(dǎo)的腎鉀離子通道(renaloutermedullarpotassium1,ROMK1)的胞吞過(guò)程。研究顯示intersectin1基因敲降會(huì)導(dǎo)致WNK依賴性的腎鉀離子通道的內(nèi)陷效率下降。此外,WNK1或WNK4的基因突變導(dǎo)致PXXP基序構(gòu)象改變,提高其與intersectin的作用強(qiáng)度,胞吞作用隨之增強(qiáng),最終產(chǎn)生II型假性醛固酮減少癥(pseudohypoaldosteronismtype2,PHA2)。因此,WNK1和WNK4與intersectin1的SH3結(jié)構(gòu)域相互作用對(duì)于激活WNK依賴性的腎鉀離子通道的內(nèi)吞過(guò)程是至關(guān)重要的。2.4聯(lián)合用藥對(duì)鉀離子誘導(dǎo)的胞吐過(guò)程中特殊功能的影響胞吐作用是基本的細(xì)胞分泌途徑,在神經(jīng)元和內(nèi)分泌細(xì)胞中,肌動(dòng)蛋白骨架重排過(guò)程是調(diào)節(jié)型胞吐的關(guān)鍵步驟,調(diào)控分泌顆粒募集到質(zhì)膜的停泊位點(diǎn)上。Malacombe等的研究顯示,intersectin1-L存在于PC12細(xì)胞的胞吐位點(diǎn)上,并作為鳥(niǎo)苷酸交換因子,通過(guò)激活Cdc42參與肌動(dòng)蛋白骨架重排介導(dǎo)胞吐過(guò)程,沉默intersectin1-L基因的表達(dá)導(dǎo)致胞吐作用減弱。為了驗(yàn)證胞吐過(guò)程中intersectin1發(fā)揮鳥(niǎo)苷酸交換活性的結(jié)構(gòu)域,Malacombe等分別用編碼DH結(jié)構(gòu)域、DH-PH片段和DH-PH-C2片段的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞,驗(yàn)證這些結(jié)構(gòu)對(duì)鉀離子誘導(dǎo)的生長(zhǎng)激素分泌過(guò)程的影響,結(jié)果顯示DH-PH片段和DH-PH-C2片段都能促進(jìn)鉀離子誘導(dǎo)的生長(zhǎng)激素的釋放,而單獨(dú)的DH結(jié)構(gòu)域不能增強(qiáng)胞吐作用。Momboisse等也發(fā)現(xiàn),外源表達(dá)DH-PH-C2片段能夠提高鉀離子誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞生長(zhǎng)激素的分泌,而intersectin1-S對(duì)這一過(guò)程并沒(méi)有影響。利用包含DH-PH-C2區(qū)和編碼Cdc42小干擾RNA的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞邊緣F-肌動(dòng)蛋白的數(shù)量并沒(méi)有改變,說(shuō)明intersectin1-L介導(dǎo)的Cdc42活化是神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞胞吐過(guò)程中肌動(dòng)蛋白聚合的關(guān)鍵步驟。3沒(méi)有調(diào)節(jié)神經(jīng)/因子束活性Intersectin1基因位于人類第21號(hào)染色體上,即唐氏綜合癥(Downsyndrome,DS)的關(guān)鍵區(qū)域,在唐氏綜合癥病人中intersectin1的表達(dá)上調(diào),從而影響內(nèi)吞作用和囊泡運(yùn)輸。所有的DS患者都會(huì)產(chǎn)生神經(jīng)系統(tǒng)損傷,且患者35歲以后大都出現(xiàn)阿爾茨海默病(Alzheimerdisease,AD)的典型病理特征,如β淀粉樣肽斑塊和神經(jīng)結(jié)節(jié)。Yu等的研究顯示,在intersectin1基因敲除的裸鼠中,神經(jīng)元的胞吞作用減弱,神經(jīng)元中胞內(nèi)體增大,腦部神經(jīng)生長(zhǎng)因子水平降低,而胞內(nèi)體擴(kuò)大是阿爾茨海默病的早期神經(jīng)病理學(xué)特征。此外,神經(jīng)和非神經(jīng)內(nèi)分泌組織的腫瘤發(fā)生多數(shù)都與激素、神經(jīng)遞質(zhì)和代謝物的分泌功能異常有關(guān)。例如,嗜鉻細(xì)胞瘤是由于患者腎上腺嗜鉻細(xì)胞中兒茶酚胺類分泌過(guò)多導(dǎo)致的。研究顯示,Cdc42與鈣調(diào)節(jié)型胞吐的信號(hào)通路相關(guān),這個(gè)信號(hào)通路中的多數(shù)功能組分(β-Pix、N-WASP)都涉及腫瘤的發(fā)生,胞吐過(guò)程中Cdc42的活化依賴于intersectin1-L的鳥(niǎo)甘酸交換活性,而超活化Cdc42引發(fā)PC12細(xì)胞分泌物過(guò)多。Cdc42與細(xì)胞侵襲相關(guān),intersectin激活Cdc42是Ras誘導(dǎo)的細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化所必需的。研究顯示,表達(dá)全長(zhǎng)的intersectin或EH結(jié)構(gòu)域能夠抑制膜結(jié)合受體的內(nèi)吞(如EGFR),產(chǎn)生持續(xù)地刺激信號(hào),活化有絲分裂信號(hào)途徑,進(jìn)而提高Elk-1的活性。因此,intersectin可能在有絲分裂途徑的活化中發(fā)揮作用,這與腫瘤的形成有關(guān),但是詳細(xì)機(jī)制還有待進(jìn)一步論證。Specht等最近的研究表明intersectin2降表達(dá)與通過(guò)環(huán)磷酰胺、氨甲喋呤和5-氟尿嘧啶輔助化學(xué)療法治療的乳腺癌病人預(yù)后不良有關(guān)。因此,intersectin2的表達(dá)水平就可能作為乳腺癌早期診斷的參考指標(biāo)。4聯(lián)合蛋白網(wǎng)絡(luò)分子機(jī)制的研究Intersectin作為進(jìn)化上高度保守的支架蛋白或銜接蛋白,其多功能結(jié)構(gòu)域通過(guò)與多種蛋白結(jié)合在胞吞胞吐及其信號(hào)通路、細(xì)胞質(zhì)膜微囊轉(zhuǎn)運(yùn)及其信號(hào)通路、細(xì)胞有絲分裂信號(hào)通路和細(xì)胞骨架重排等細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮重要作用。Intersectin基因及其產(chǎn)物的異常表達(dá)或改變將直接影響到細(xì)胞正常的物質(zhì)分泌和攝取過(guò)程,進(jìn)而影響人體的正常生理機(jī)能。因此,了解intersectin所結(jié)合的這些中間蛋白的種類和特點(diǎn),闡明intersectin與其結(jié)合蛋白的相互作用方式,將有助于進(jìn)一步揭示細(xì)胞信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中各種細(xì)胞過(guò)程的信號(hào)傳遞和整合的分子機(jī)制。Intersectin與人類唐氏綜合癥、阿爾茨海默病和腫瘤等多種疾病密切相關(guān),intersectin定位于人類唐氏綜合征關(guān)鍵區(qū)的21號(hào)染色體上,且其mRNA在唐氏綜合癥患者大腦中表達(dá)升高,說(shuō)明這種蛋白可能是唐氏綜合癥的潛在病因,唐氏綜合癥患者的細(xì)胞intersectin表達(dá)升高可能會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育紊亂或功能失常。此外,inte