產(chǎn)甲烷菌生態(tài)多樣性研究進(jìn)展

產(chǎn)甲烷菌生態(tài)多樣性研究進(jìn)展

產(chǎn)甲烷菌是一種嚴(yán)格的厭氧原核微生物。這是通過有機(jī)丙烯酸酯反應(yīng)產(chǎn)生的鏈中的最后一組。這種獨特的厭氧代謝機(jī)制在自然界物質(zhì)循環(huán)中起著重要作用。另一方面，產(chǎn)甲烷菌是產(chǎn)生溫室氣體的主要因素。世界上的甲烷排放量每年約為500噸，其中74%是由產(chǎn)甲烷菌代謝產(chǎn)生的。另一方面，產(chǎn)甲烷菌在植物厭氧生物處理中的工業(yè)應(yīng)用中發(fā)揮著重要作用，如沼氣發(fā)酵和通風(fēng)性。因此，對產(chǎn)甲烷菌的研究具有重要的理論和實踐意義。隨著厭氧菌培養(yǎng)技術(shù)和微生物分子生態(tài)技術(shù)的發(fā)展，更多的實驗室可以多地研究產(chǎn)甲烷菌。這些研究揭示了產(chǎn)甲烷菌分類的多樣性，顯示了不同生境下產(chǎn)甲烷菌的生態(tài)和生理特征之間的差異，并為有效的工業(yè)應(yīng)用提供了方向。1產(chǎn)甲烷菌新系統(tǒng)發(fā)育特性,主要代謝生理特性1776年,AlessandroVolta首次發(fā)現(xiàn)了湖底的沉積物能產(chǎn)生甲烷,之后歷經(jīng)一個多世紀(jì)的研究,利用有機(jī)物產(chǎn)甲烷的厭氧微生物才大致被分為兩類:一類是產(chǎn)氫、產(chǎn)乙酸菌,另一類就是產(chǎn)甲烷菌.W.E.Balch等在1979年報道了3個目、4個科、7個屬和13個種的產(chǎn)甲烷微生物,他們的分類是建立在形態(tài)學(xué)、生理學(xué)等傳統(tǒng)分類特征以及16SrRNA寡核苷酸序列等分子特征基礎(chǔ)上的.隨著厭氧培養(yǎng)技術(shù)和菌種鑒定技術(shù)的不斷成熟,產(chǎn)甲烷菌的系統(tǒng)分類也在不斷完善.《伯杰系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊》第9版將近年來的研究成果進(jìn)行了總結(jié)和肯定,并建立了以系統(tǒng)發(fā)育為主的產(chǎn)甲烷菌最新分類系統(tǒng).產(chǎn)甲烷菌分可為5個大目,分別是:甲烷桿菌目(Methanobacteriales)、甲烷球菌目(Methanococcales)、甲烷微菌目(Methanomicrobiales)、甲烷八疊球菌目(Methanosarcinales)和甲烷火菌目(Methanopyrales),上述5個目的產(chǎn)甲烷菌可繼續(xù)分為10個科與31個屬,它們的系統(tǒng)分類及主要代謝生理特性見表1.目前研究產(chǎn)甲烷菌各級分類單元最有效的手段是多相分類(Polyphasictaxonomy),該方法能較為客觀、全面地反映產(chǎn)甲烷菌各個分類單元在自然系統(tǒng)進(jìn)化中的地位,涉及的數(shù)據(jù)包括表型類、基因型類和系統(tǒng)發(fā)育標(biāo)記類.其中表型信息主要是指形態(tài)和生理生化性狀的分析;基因信息包括分子雜交(DNA-DNA分子雜交、DNA-rRNA分子雜交等)和分子標(biāo)記(RFLP、SSCP等);系統(tǒng)發(fā)育信息則主要是指16SrDNA的序列分析.利用全面系統(tǒng)的分類鑒定技術(shù)可以發(fā)現(xiàn)自然界中更多新的產(chǎn)甲烷菌類群,從而豐富產(chǎn)甲烷菌的分類地位.2生物環(huán)境對產(chǎn)甲烷菌的影響產(chǎn)甲烷菌屬于原核生物中的古菌域,具有其它細(xì)菌如好氧菌、厭氧菌和兼性厭氧菌所不同的代謝特征.產(chǎn)甲烷菌的甲烷生物合成途徑主要是以乙酸、H2/CO2、甲基化合物為原料.產(chǎn)甲烷菌在自然界中分布極為廣泛,在與氧氣隔絕的環(huán)境幾乎都有甲烷細(xì)菌生長,如海底沉積物、河湖淤泥、水稻田以及動物的消化道等.在不同的生態(tài)環(huán)境下,產(chǎn)甲烷菌的群落組成有較大的差異性,并且其代謝方式也隨著不同的微環(huán)境而體現(xiàn)出多樣性.2.1主要優(yōu)勢生物由于存在缺氧、高鹽等極端條件,所以在海底環(huán)境中有大量產(chǎn)甲烷菌的富集.在已知的產(chǎn)甲烷菌中,大約有1/3的類群來源于海洋這個特殊的生態(tài)區(qū)域.一般在海洋沉積物中,利用H2/CO2的產(chǎn)甲烷菌的主要類群是甲烷球菌目(Methanococcales)和甲烷微菌目(Methanomicrobiales),它們利用氫氣或甲酸進(jìn)行產(chǎn)能代謝.在海底沉積物的不同深度里都能發(fā)現(xiàn)這兩類氫營養(yǎng)產(chǎn)甲烷菌,此類產(chǎn)甲烷菌能從產(chǎn)氫微生物那里獲得必需的能量.StrapocD等對Illinois海峽里產(chǎn)甲烷菌類群的分析顯示出Methanocorpusculum是其中的優(yōu)勢類群,同時研究還發(fā)現(xiàn)該海域里還存在有大量未培養(yǎng)產(chǎn)甲烷菌類群,其分類地位并未明確指出.研究者通過進(jìn)一步建立產(chǎn)甲烷微生物群落對大分子的海底沉積物煤進(jìn)行生物降解的模型,得出氫營養(yǎng)產(chǎn)甲烷菌的甲烷合成代謝是該海峽里大分子有機(jī)質(zhì)的生物降解產(chǎn)甲烷的主要生化過程.另一些研究發(fā)現(xiàn),甲基營養(yǎng)產(chǎn)甲烷菌也是海底沉積物中甲烷產(chǎn)生的主要貢獻(xiàn)者,其主要類群有Methanococcoides和Methanosarcina,它們所利用的甲基化合物一般來自于海底沉積物中的海洋細(xì)菌、藻類和浮游植物的代謝產(chǎn)物.硫酸鹽在海水中的濃度大約為20~30mmol/L,這種濃度對產(chǎn)甲烷微生物來說是一種較適宜的底物濃度.但是海洋底部還存在大量的硫酸鹽還原菌,它們和產(chǎn)甲烷菌相互競爭核心代謝底物,如氫氣和醋酸鹽等.在美國南卡羅納州的Cape海底沉積物中,氫氣主要是被硫酸鹽還原菌所利用,氫氣的濃度分壓大約維持在0.1~0.3Pa,而這樣的濃度已經(jīng)低于海底沉積物中氫營養(yǎng)產(chǎn)甲烷菌的最低可用濃度.因此,在硫酸鹽還原菌落聚集的沉積物上層,產(chǎn)甲烷菌的種類和菌落數(shù)量是相對有限的.在一些富含有機(jī)物的沉積物中,由于隨著深度的增加硫酸鹽濃度降低,因此在沉積物底部硫酸鹽還原菌生長受限,從而使得產(chǎn)甲烷菌成為優(yōu)勢菌.Kendall等研究發(fā)現(xiàn)二甲硫醚和三甲胺分別來源于二甲基亞砜丙酸鹽和甜菜堿,這些化合物并不能直接有效地被硫酸鹽還原菌所利用,相反卻是這類菌的“非競爭性”代謝底物.正是由于此類硫酸鹽還原菌的“非競爭性”底物的存在,使得專性的甲基營養(yǎng)產(chǎn)甲烷菌才得以出現(xiàn)在不同深度的沉積物中.2.2淡水沉積物中3種常見產(chǎn)甲烷菌的生長與分布相對于海洋的高滲環(huán)境,淡水里的各類鹽離子濃度明顯要低很多,其硫酸鹽的濃度只有100~200μmol/L.因此在淡水沉積物中,硫酸鹽還原菌將不會和產(chǎn)甲烷菌競爭代謝底物,這樣產(chǎn)甲烷菌就能大量生長繁殖.由于在淡水環(huán)境中乙酸鹽的含量是相對較高的,因而其中的乙酸鹽營養(yǎng)產(chǎn)甲烷菌占了產(chǎn)甲烷菌菌種的70%,而氫營養(yǎng)產(chǎn)甲烷菌只占不到30%.一般在淡水沉積物中,產(chǎn)甲烷菌的主要類群是乙酸營養(yǎng)的甲烷絲狀菌科(Methanosaetaceae),同時還有一些氫營養(yǎng)的甲烷微菌科(Methanomicrobiaceae)和甲烷桿菌科(Methanobacteriaceae)的存在.在淡水沉積物中,不同代謝類型產(chǎn)甲烷菌的生態(tài)分布具有一些獨特規(guī)律:第一,氫營養(yǎng)產(chǎn)甲烷菌在低pH淡水環(huán)境中不易生長繁殖.例如,研究發(fā)現(xiàn),在德國東北部的GrosseFuchskuhle湖底環(huán)境的pH小于5,在沉積物中并沒有發(fā)現(xiàn)氫營養(yǎng)產(chǎn)甲烷菌的存在,而只有乙酸營養(yǎng)產(chǎn)甲烷菌的分布.因為這樣偏酸的pH環(huán)境適宜耗氫產(chǎn)乙酸菌(Homoacetogens)的生長,從而使得大部分CO2轉(zhuǎn)化為乙酸而非甲烷.第二,隨著淡水環(huán)境里溫度的降低,氫營養(yǎng)產(chǎn)甲烷菌和乙酸營養(yǎng)產(chǎn)甲烷菌的生長繁殖均受到抑制,這主要是由兩方面的因素造成:首先,耗氫產(chǎn)乙酸菌的最適生長溫度較低;其次,絕大多數(shù)產(chǎn)氫細(xì)菌在低溫環(huán)境里生長受限,從而使得氫營養(yǎng)產(chǎn)甲烷菌的關(guān)鍵代謝底物——H2供應(yīng)不足.第三,在一些研究中還發(fā)現(xiàn),氫營養(yǎng)產(chǎn)甲烷菌的豐度和活性會隨著淡水沉積物的不同深度而發(fā)生改變.例如在德國的Dagow湖底沉積物中,由氫營養(yǎng)產(chǎn)甲烷菌產(chǎn)生的甲烷量在沉積物的表面是22%,而在18cm深處則是38%.第四,淡水環(huán)境中產(chǎn)甲烷菌類群的分布也隨著季節(jié)的變化而變化.JulieEarl等用PCR-TGGE技術(shù)對已經(jīng)富營養(yǎng)化的Priest湖泊底部的沉積物和水樣進(jìn)行不同季節(jié)產(chǎn)甲烷菌群落變化的研究,結(jié)果顯示,在冬季沉積物中產(chǎn)甲烷菌的類型要比夏季的多,其優(yōu)勢菌是甲烷微菌目(Methanomicrobiales).2.3稻田里產(chǎn)甲烷菌的群落結(jié)構(gòu)稻田土壤是生物合成甲烷的另一個主要場所.在稻田中,O2、NO3-、Fe3+和SO42-被迅速消耗掉,并產(chǎn)生大量的CO2,為產(chǎn)甲烷菌的生長和繁殖創(chuàng)造了有利條件.甲烷的生成是其微環(huán)境主要的生化過程,光合作用固定的碳素大約有3%~6%被轉(zhuǎn)化為甲烷.由于稻田的氧氣分壓較大,并且相對干燥,所以稻田的產(chǎn)甲烷菌相對其它生境的產(chǎn)甲烷菌有較強(qiáng)的氧氣耐受性和抗旱能力.稻田中的產(chǎn)甲烷菌類群主要有Methanomicrobiaceae、Methanobacteriaceae和Methanosarcinaceae,它們利用的底物一般是H2/CO2和乙酸.研究發(fā)現(xiàn)稻田里產(chǎn)甲烷菌的生長和代謝具有一定的特殊規(guī)律性.第一,產(chǎn)甲烷菌的群落組成能保持相對恒定.當(dāng)然也有一些例外,如氫營養(yǎng)產(chǎn)甲烷菌在發(fā)生洪水后就會占主要優(yōu)勢.第二,稻田里的產(chǎn)甲烷菌的群落結(jié)構(gòu)和散土里的產(chǎn)甲烷菌群落結(jié)構(gòu)是不一樣的.不可培養(yǎng)的水稻叢產(chǎn)甲烷菌群(RiceClusterⅠ)作為主要的稻田產(chǎn)甲烷菌類群,其甲烷產(chǎn)生主要原料主要是H2/CO2.而在其他的散土中,乙酸營養(yǎng)產(chǎn)甲烷菌是主要的類群,甲烷主要來源于乙酸.造成這種差別可能是由于稻田里氧氣的濃度要比散土中高,而在稻田里的氫營養(yǎng)產(chǎn)甲烷菌具有更強(qiáng)的氧氣耐受性.第三,氫營養(yǎng)產(chǎn)甲烷菌的種群數(shù)量隨著溫度的升高而增大.第四,生境中相對高的磷酸鹽濃度對乙酸營養(yǎng)產(chǎn)甲烷菌有抑制效應(yīng).這些特有的規(guī)律有助于人們清楚地了解稻田里甲烷的產(chǎn)生機(jī)制,從而采取相關(guān)的措施防止水稻田里碳素的流失.2.4氫營養(yǎng)產(chǎn)甲烷菌在動物的消化道中,由于營養(yǎng)物質(zhì)較豐富并且具備厭氧環(huán)境,故存在類群較豐富的產(chǎn)甲烷菌.如在人類的腸道中,產(chǎn)甲烷菌的類群主要是氫營養(yǎng)產(chǎn)甲烷菌,它們利用的底物主要是H2/CO2.從人類的糞便中分離到兩種產(chǎn)甲烷菌Methanobrevibactersmithii和Methanosphaerastadtmanae.其中M.smithii是人類腸道中的優(yōu)勢菌種,其總數(shù)在腸道厭氧菌總數(shù)中占了大約10%.而M.stadtmanae的菌群則相對較少,它們既能以H2/CO2為代謝底物,同時也能利用乙酸和甲醇作為碳源.以上兩種產(chǎn)甲烷菌都在其代謝的過程里都能編碼一種膜黏附蛋白,這種蛋白使其能適應(yīng)腸道這種較特殊的生態(tài)環(huán)境.食草動物利用其瘤胃中的各種微生物來分解纖維素和木質(zhì)素等難分解的有機(jī)質(zhì),產(chǎn)生氫氣、短鏈脂肪酸、甲烷等小分子產(chǎn)物.研究發(fā)現(xiàn)不同的反芻動物每天的甲烷產(chǎn)量是不同的,如成年母牛每天能產(chǎn)生大約200L甲烷,而成年綿羊每日的甲烷氣產(chǎn)生量大約是50L.在反芻動物的瘤胃中,氫營養(yǎng)產(chǎn)甲烷菌是產(chǎn)甲烷菌群的優(yōu)勢菌,其數(shù)量的變化主要受到動物飲食結(jié)構(gòu)的影響.雖然有些文獻(xiàn)報道稱Methanobrevibacter一般是瘤胃中的優(yōu)勢菌,但是一些研究者也發(fā)現(xiàn)其他種屬的產(chǎn)甲烷菌在瘤胃中也會占有一定的比例.裴彩霞等對晉南牛瘤胃古菌的多樣性進(jìn)行16SrRNA序列分析發(fā)現(xiàn),在瘤胃中存在25類屬于廣域古菌的未知序列,顯示出瘤胃中存在大量的未知產(chǎn)甲烷菌.PaulNE等用PCR-TTGE技術(shù)對瘤胃中產(chǎn)甲烷菌進(jìn)行了研究,結(jié)果顯示有36個菌株分屬于M.ruminantium、M.smithii等已知產(chǎn)甲烷菌種,其它的30個菌株則未判定分類地位.TajimaK等利用古菌引物Ar1000f/Ar1500進(jìn)行克隆測序后發(fā)現(xiàn),綿羊瘤胃中有Methanobrevibacter和Methanomicrobium兩個屬的產(chǎn)甲烷菌,進(jìn)一步證實了反芻動物瘤胃中的產(chǎn)甲烷菌具有類群多樣性.2.5過渡時期巖中甲烷菌的分布在地?zé)峒暗氐V生態(tài)環(huán)境中均存在著大量能適應(yīng)極端高溫、高壓的產(chǎn)甲烷菌類群.以往的研究發(fā)現(xiàn)大部分嗜熱產(chǎn)甲烷菌是從溫泉中分離到的.Stetter等從冰島溫泉中分離出來的甲烷棲熱菌(Methanothermussp.)可在溫度高達(dá)97℃的條件下生成甲烷.Deuser等對非洲基伍湖底層中甲烷的碳同位素組成進(jìn)行研究后指出,這里產(chǎn)生的甲烷至少有80%是來自于氫營養(yǎng)產(chǎn)甲烷菌的CO2還原作用.多項研究顯示出,溫泉中地?zé)醽碓吹腍2和CO2可作為產(chǎn)甲烷菌進(jìn)行甲烷生成的底物.除陸地溫泉中存在有嗜熱產(chǎn)甲烷菌外,在深海底熱泉環(huán)境近年來也發(fā)現(xiàn)多種微噴口環(huán)境的產(chǎn)甲烷菌類群,它們不但能耐高溫,而且能耐高壓.例如,一種超高溫甲烷菌(Methanopyrussp.)是從加利福尼亞灣Guaymas盆地?zé)嵋簢娍诃h(huán)境的沉積物中分離出來的,其生存環(huán)境的水深約2000m(相當(dāng)于20.265MPa),水溫高達(dá)110℃.甲烷嗜熱菌(Methanopyruskandleri)也是在海底火山口分離到的,它是以氫為電子供體進(jìn)行化能自養(yǎng)生活的嗜高溫菌,其生長溫度可達(dá)110℃.而在地礦環(huán)境中,由于存在有大量的有機(jī)質(zhì),其微生物資源也很豐富并極具特點.甲烷菌在地殼層的分布比較廣泛,在地殼不同深度、不同微環(huán)境中,其種屬及形成甲烷氣的途徑各異.周翥虹等報道,在柴達(dá)木盆地第四系1701m的巖心中仍有產(chǎn)甲烷菌存在,并存在產(chǎn)甲烷的活性.張輝等指出近年來從油藏環(huán)境中分離得到的產(chǎn)甲烷菌主要有3類,包括氧化H2還原CO2產(chǎn)生甲烷的氫營養(yǎng)產(chǎn)甲烷菌、利用甲基化合物(依賴或不依賴H2作為外源電子供體)產(chǎn)生甲烷的甲基營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌和利用乙酸產(chǎn)甲烷的乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌.3工業(yè)應(yīng)用生產(chǎn)甲烷細(xì)菌的工業(yè)應(yīng)用3.1厭氧消化反應(yīng)器產(chǎn)甲烷菌的篩選產(chǎn)甲烷菌具有獨特的代謝機(jī)制,能使農(nóng)業(yè)有機(jī)廢物、污水等環(huán)境中其它微生物降解有機(jī)物降解后產(chǎn)生的乙酸、甲酸、H2和CO2等轉(zhuǎn)換為甲烷,既可生產(chǎn)清潔能源,又可實現(xiàn)污水中污染物減量化;同時,其代謝產(chǎn)物對病原菌和病蟲卵具有抑制和殺傷作用,可實現(xiàn)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、生活污水無害化.因此,產(chǎn)甲烷菌及其厭氧生物處理工藝技術(shù)在工農(nóng)業(yè)有機(jī)廢水和城鎮(zhèn)生活污水處理方面具有廣闊的應(yīng)用前景.厭氧生物處理生成甲烷一般需要3類微生物的共同作用,而最后一步由產(chǎn)甲烷菌微生物完成的甲烷生成則是限速步驟.高活性的產(chǎn)甲烷菌是高效率的厭氧消化反應(yīng)的保證,同時也可以避免積累氫氣和短鏈脂肪酸.當(dāng)然,這一限速步驟也容易受到菌體活性、pH和化學(xué)抑制劑等多種因素的影響.在厭氧消化反應(yīng)器中目前研究較多的是Methanosaeta和Methanosarcina這兩種乙酸營養(yǎng)產(chǎn)甲烷菌.Methanosaeta具有較低的生長速率和較高的乙酸轉(zhuǎn)化率;而Methanosarcina具有相對高的生長速率和低的乙酸轉(zhuǎn)化率.這兩種類群數(shù)量不僅受控于作為底物的乙酸的濃度,也受控于其他營養(yǎng)物的濃度.在工業(yè)應(yīng)用中,Methanosaeta在高進(jìn)液量、快流動性的反應(yīng)器(如UASB)中使用廣泛,可能與它們具有較高的吸附能力和顆?；芰τ嘘P(guān).而Methanosarcina對于液體流動則很敏感,所以主要用于固定和攪動的罐反應(yīng)器.溫度和pH是影響厭氧反應(yīng)器效率的兩個重要參數(shù).對于溫度而言,一般的中溫條件有助于厭氧反應(yīng)的進(jìn)行并同時減少滯留時間.在高溫厭氧消化器中常見的氫營養(yǎng)產(chǎn)甲烷菌主要是甲烷微菌目(Methanomicrobiales)和甲烷桿菌目(Methanobacteriales),它們的厭氧消化能力一般是隨著溫度的升高而增強(qiáng),但過高的溫度會使其受到抑制.因此為保證厭氧消化的順利進(jìn)行,一般需要選擇合適的溫度.對于pH來說,大多數(shù)產(chǎn)甲烷菌的最適生長pH是中性略偏堿性,但一般增大進(jìn)料速率會導(dǎo)致脂肪酸濃度的增大,從而導(dǎo)致pH降低,因此耐酸的產(chǎn)甲烷菌可以提高厭氧反應(yīng)器的穩(wěn)定性.Savant等從酸性厭氧消化反應(yīng)器中分離到一株產(chǎn)甲烷菌(Methanobrevibacteracididurans),其最適pH略偏酸性,向厭氧消化反應(yīng)器加入該產(chǎn)甲烷菌可以有效增加甲烷的產(chǎn)生量,減少脂肪酸的積累.3.2含煤地層煤層煤系中產(chǎn)甲烷菌群的研究生物成因煤層氣是在較低的溫度條件下,有機(jī)質(zhì)通過各種不同類群細(xì)菌的參與或作用,在煤層中生成的以甲烷為主的氣體.產(chǎn)甲烷菌對煤層氣的形成起著重要的作用,目前已發(fā)現(xiàn)產(chǎn)甲烷菌有低溫型、中溫型和嗜熱型.生物成因煤層的形成方式主要有兩種:一種是由CO2還原而成;另一種由甲基類發(fā)酵而成,這兩種作用一般都是在近地表環(huán)境的淺層煤層中進(jìn)行的.地表深處煤層中生成大量生物成因氣的有利條件是:大量有機(jī)質(zhì)的快速沉積、充裕的孔隙空間、低溫,以及高pH值的缺氧環(huán)境.近年的煤層氣勘探開發(fā)研究中,主要從熱成氣角度考慮煤層甲烷的形成,而煤被產(chǎn)甲烷菌等厭氧菌降解生成次生生物氣一直是人們所關(guān)心的問題.SmithJW等測定了澳大利亞悉尼盆地二疊系煙煤中煤層氣的組成和同位素組成,提出了這兩個盆地煤層氣的生成機(jī)理主要是生物成因.AhmedM等從有機(jī)地球化學(xué)角度研究了上述兩盆地二疊系煤巖中有機(jī)物質(zhì)的生物降解作用,進(jìn)一步論證了產(chǎn)甲烷菌在煤層甲烷形成過程的重要作用.KotarbaMJ用地球化學(xué)方法研究了波蘭Silesian和Lublin盆地晚石炭世含煤地層煤層氣的組分和同位素組成,經(jīng)綜合測試分析得出這兩個含煤地層煤層氣主要為產(chǎn)甲烷菌經(jīng)CO2還原途徑生成的次生生物成因氣.美國地質(zhì)研究中心的ElizabethJP等對煤層甲烷產(chǎn)生的過程中產(chǎn)甲烷菌群的生理活性和煤降解的過程作了相關(guān)分析,研究得出在產(chǎn)甲烷菌混合菌群的作用下煤樣會發(fā)