山羊瘤胃微生物16srdna的提取

山羊瘤胃微生物16srdna的提取

腫瘤胃的環(huán)境適合微生物的棲息地和繁殖，有許多微生物。每個絲狀腫瘤胃的內(nèi)容物含有1010101個細菌。飼料中的養(yǎng)分在腫瘤酶中蒸發(fā)和分解，最終的養(yǎng)分轉(zhuǎn)化為腫瘤胃壁細胞并進入血液循環(huán)。它們是反芻動物能量的主要來源。盡管這些瘤胃微生物在反芻動物的消化和營養(yǎng)中具有重要作用,但其中99%的微生物難以獲得純培養(yǎng),也使其不能被充分的開發(fā)和利用。因此對提取微生物總DNA進行分子生物學(xué)分析的免培養(yǎng)法能夠獲取瘤胃微生物更加全面完整的信息,篩選和挖掘新的功能基因及生物活性物質(zhì),為瘤胃微生物的研究提供新的技術(shù)和手段。建立高效、可靠的微生物總DNA提取方法是進行微生物后續(xù)研究的基礎(chǔ),目前已成為國內(nèi)外研究者關(guān)注的熱點。瘤胃成分復(fù)雜,其中棲息著復(fù)雜多樣的微生物,包括細菌、原蟲、真菌和噬菌體等幾大類。在提取的過程中含有較多的抑制成分,比如腐殖酸、酚類化合物等,因此從瘤胃中提取微生物的宏基因組有一定的難度,特別是樣品的預(yù)處理及提取過程,一般耗費的時間比較長。如果提取的DNA中含有的較多的抑制成分、不純化或者純化效果不好,將影響后續(xù)的PCR、酶切等后續(xù)工作,因此不管是瘤胃宏基因組文庫的構(gòu)建還是瘤胃微生物的分子生物學(xué)研究,獲得一種簡單,快速,純度高的DNA對后續(xù)研究尤為重要。1材料和方法1.1模型設(shè)計和合成1.1.1主要試劑λDNA/HindIIIMarker、DL2000Marker和TaqTM購于寶生物工程有限公司(大連);通用引物由寶生物(大連)有限公司合成,引物序列見表1。1.2方法1.2.1sds-pcr法山羊瘤胃內(nèi)容物總DNA的提取方法參照ZHOU等和MURRAY等方法并做了改進,具體如下:稱取5個山羊瘤胃內(nèi)容物各10g并將它們混合,用PBS緩沖液稀釋樣品,攪拌機充分攪碎,經(jīng)六層紗布過濾得瘤胃液。取10mL瘤胃液于50mL離心管,加10.0mL提取緩沖液(100mmol/LTris·HCl,pH8.0;100mmol/LEDTA;100mmol/L磷酸鈉緩沖液,pH8.0;1.5mo1/LNaCl;1%CTAB;1%PVPP),充分混勻,加入溶菌酶(50mg/mL)使其終濃度達到1mg/mL,37℃,180r/min振蕩0.5h;置液氮中冷凍5min,取出在65℃水浴中保溫至完全融化,反復(fù)凍融共3次;加入20%SDS終濃度達到2%,混勻后60℃保溫2h,每隔20min顛倒混勻;13000r/min離心10min,收集上清,加入等體積的酚/氯仿/異戊醇,輕柔混勻,13000r/min離心10min,收集上清,加入0.6倍體積的異丙醇,-20℃放置3h以上,13000r/min離心20min,棄去上清,沉淀用70%的乙醇清洗2～3次,自然干燥,加500μL無菌水溶解,-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｈ?0μLDNA電泳檢測。1.2.2純度檢測和d測量用紫外分光光度計測定DNA在280、260和230nm下的A值,根據(jù)A260/A230、A260/A280計算出DNA的濃度。1.2.3瘤胃微生物總dna的pcr擴增從瘤胃微生物總DNA中擴增細菌的16SrDNA。引物F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′,引物R:5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR反應(yīng)體系為25μL:模板0.5μL,正向引物(25mol/L)l.0μL,反向引物(25mol/L)1.0μL,TaqMix22.5μL。反應(yīng)條件:預(yù)變性95℃5min;變性94℃30s,54℃30s,72℃10min,30個循環(huán):最后72℃延伸10min。從瘤胃微生物總DNA中擴增古細菌的16SrDNA。引物F為5′-ACKGCTCAGTAACACGT-3′,引物R為5′-GTGCTCCCCCGCCAATTCCT-3′,PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件同上。2結(jié)果2.1總dna片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示,提取的山羊瘤胃微生物總DNA條帶較亮,但電泳膠孔中含有不明的大分子物質(zhì),并存在拖尾現(xiàn)象,獲得的DNA片段大于23kb,屬于大片段DNA。2.2定了顯著性檢驗,即測定一個結(jié)論,結(jié)果如下經(jīng)紫外分光光度計對提取的瘤胃微生物總DNA的純度進行測定,結(jié)果見表2。瘤胃微生物總DNA的260/280的A值平均在1.260～1.464,260/230的A值平均在1.000～1.214,表明此方法提取的DNA純度較高。2.3pcr擴增微生物總dna的電泳結(jié)果進一步利用細菌和古細菌16SrDNA通用引物對提取瘤胃微生物總DNA的質(zhì)量進行檢測。PCR擴增微生物總DNA的電泳結(jié)果見圖2。通過PCR直接從粗提總DNA中擴增出長度分別為1500bp、1000bp左右的瘤胃細菌和古細菌的16SrDNA序列,而且獲得的目的條帶單一,沒有雜帶,說明提取的瘤胃微生物總DNA質(zhì)量較好,可以直接用于PCR擴增。3關(guān)于瘤胃微生物的提取方法更容易為反芻動物(牛羊等)能夠利用青粗飼料并將其轉(zhuǎn)化成營養(yǎng)豐富的肉、奶等產(chǎn)品。這是因為瘤胃微生物即細菌、原蟲和真菌等在飼料的消化過程中進行的厭氧發(fā)酵起了主要的作用。山羊?qū)α淤|(zhì)粗飼料的利用率遠高于其他家畜,因此,開展山羊瘤胃微生物的研究,對于調(diào)控瘤胃微生物的活動,增強反芻動物的消化功能,提高其生產(chǎn)性能及瘤胃微生物資源開發(fā)和利用都具有重要意義。但是瘤胃是一個特殊的厭氧環(huán)境,采用傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)不但耗時耗力,而目99%的微生物難以獲得純培養(yǎng)。國內(nèi)外研究者紛紛避開了傳統(tǒng)培養(yǎng)而直接從瘤胃內(nèi)容物中提取微生物DNA,利用免培養(yǎng)技術(shù)研究瘤胃微生物,如隋昶生等采用未培養(yǎng)技術(shù)優(yōu)化嶗山奶山羊瘤胃細菌總DNA提取方法。BEKELE等通過未培養(yǎng)技術(shù)分析瘤胃密螺旋體的系統(tǒng)發(fā)育多樣性。通過分子生物學(xué)方法,直接提取樣品中微生物總DNA進行分析的方法,在一定程度上克服了傳統(tǒng)方法的弊端,避開了純培養(yǎng)的步驟。提取到高質(zhì)量的瘤胃微生物總DNA是采用免培養(yǎng)技術(shù)研究瘤胃微生物的基礎(chǔ)。呂莉華等探討了綿羊瘤胃微生物基因組DNA提取方法,獲得了高質(zhì)量的微生物基因組DNA。王遠亮等采用未培養(yǎng)技術(shù)直接從荷斯坦奶牛瘤胃液中提取瘤胃細菌微生物混合DNA,對瘤胃細菌多樣性進行了初步分析研究。在山羊瘤胃微生物的研究中,作者所采用的DNA提取法獲得了足夠大的DNA片段,進一