基于蛋白序列的原核生物熱適應(yīng)機(jī)制研究

基于蛋白序列的原核生物熱適應(yīng)機(jī)制研究

寒熱是一種復(fù)雜的綜合效應(yīng)，其中蛋白質(zhì)分子的所有共價(jià)異質(zhì)量和非共價(jià)格之差。近年來(lái),科學(xué)家對(duì)蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定機(jī)制作了很多研究。而基于蛋白序列與熱適應(yīng)性的關(guān)系來(lái)研究熱穩(wěn)定性,不僅能幫助人們更好地了解超嗜熱、嗜熱微生物的進(jìn)化和生存機(jī)制,還可以指導(dǎo)設(shè)計(jì)和改造蛋白質(zhì)(酶)以增加它們的熱穩(wěn)定性,對(duì)工業(yè)應(yīng)用很有好處。人們通過(guò)對(duì)超嗜熱古細(xì)菌和真細(xì)菌的結(jié)構(gòu)和全基因組的高通量比對(duì)分析,發(fā)現(xiàn)這些生物有機(jī)體都在不同程度上利用了以下2種維持熱穩(wěn)定的機(jī)制,并進(jìn)化出了不同的熱適應(yīng)策略。第一種方法是基于結(jié)構(gòu)和突變的策略,即通過(guò)比較低溫和高溫蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的差異來(lái)分析和研究蛋白質(zhì)熱適應(yīng)的基礎(chǔ),然后提出假設(shè)來(lái)指導(dǎo)定向突變研究,從而可以得到與蛋白熱穩(wěn)定有關(guān)的相互作用的詳細(xì)信息。然而,目前適合用這種方法來(lái)研究的蛋白質(zhì)分子數(shù)量有限,只能從其中的某一方面了解蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定的機(jī)制,所以這些研究之間缺少共識(shí),因此無(wú)法找到促使嗜熱蛋白與常溫蛋白產(chǎn)生差異的基本因素。人們對(duì)于嗜熱細(xì)菌及超嗜熱、嗜熱微生物蛋白熱穩(wěn)定機(jī)制的研究,大多集中在一些特定的蛋白家族。該方法研究的蛋白包括噬菌體中性蛋白酶家族、T4溶菌酶和三磷酸甘油脫氫酶。第二種方法是在高溫和低溫同源蛋白之間進(jìn)行序列比對(duì)。在過(guò)去的研究中,由于可用于研究的低溫和高溫蛋白質(zhì)伴有高度的序列分化而產(chǎn)生噪音,阻礙了這種方法的應(yīng)用。直到最近一段時(shí)間,隨著極端嗜熱生物序列數(shù)據(jù)的積累,使用這一分析方法來(lái)研究蛋白質(zhì)功能性適應(yīng)機(jī)制的人逐漸增多。近年來(lái)通過(guò)對(duì)更多的基因組分析研究顯示,蛋白家族的氨基酸組成與細(xì)菌的最適生長(zhǎng)溫度存在相關(guān)性。但是蛋白質(zhì)組的熱適應(yīng)機(jī)制仍未研究透徹。因此通過(guò)研究全蛋白質(zhì)組的方法,可以幫助人們認(rèn)識(shí)蛋白質(zhì)熱適應(yīng)更深層的特征。筆者詳細(xì)研究了微生物蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)與熱穩(wěn)定的關(guān)系,運(yùn)用雙向BLAST的方法,從526個(gè)細(xì)菌蛋白組中共識(shí)別出近4.8萬(wàn)種同源蛋白,然后統(tǒng)計(jì)出每種同源蛋白的來(lái)源菌在4個(gè)溫度區(qū)間——超嗜熱(hyperthermophilic)、嗜熱(thermophilic)、常溫(mesophilic)和嗜冷(psychrophilic)的分布情況,對(duì)分布于不同溫度區(qū)間的蛋白進(jìn)行綜合分析。1材料和方法1.1全蛋白組序列信息從NCBIReferenceSequence數(shù)據(jù)庫(kù)(/genomes/Bacteria/)下載已完成測(cè)序的846個(gè)古細(xì)菌和真細(xì)菌的全蛋白組序列信息,去除冗余的亞株類的信息,共得到526個(gè)古細(xì)菌和真細(xì)菌的序列信息。1.2根據(jù)溫度分類生物,分為7類根據(jù)NCBI的基因組項(xiàng)目(GenomeProject)規(guī)定,統(tǒng)計(jì)所有微生物的最適生長(zhǎng)溫度及溫度區(qū)間。按溫度將生物分為5類:超嗜熱生物,即生長(zhǎng)溫度在75℃以上的生物體;嗜熱生物,即生物體生長(zhǎng)溫度在46～75℃;常溫生物,即生物體生長(zhǎng)溫度在11～45℃;嗜冷生物,即生長(zhǎng)溫度在-1～10℃的生物體;超嗜冷生物,即生長(zhǎng)溫度在-30～2℃的生物體。1.3同源蛋白在不同溫度區(qū)間的分布情況對(duì)526個(gè)細(xì)菌蛋白序列進(jìn)行雙序列比對(duì),E值設(shè)定為10-10,通過(guò)最佳匹配結(jié)合細(xì)菌信息獲得全部的同源蛋白。計(jì)算統(tǒng)計(jì)各種同源蛋白在4個(gè)溫度區(qū)間的分布情況,將同源蛋白根據(jù)溫度區(qū)間的劃分共分成3組:HT-only、M-only和Top-90組。HT-only組是僅分布于超嗜熱和嗜熱溫區(qū)的同源蛋白;M-only組是僅分布于常溫溫區(qū)的同源蛋白;Top-90組是指同源蛋白所屬的細(xì)菌在各溫區(qū)的分布數(shù)占該溫區(qū)古細(xì)菌和真細(xì)菌數(shù)90%以上的同源蛋白。運(yùn)用EMBOSS工具包中的pepstats應(yīng)用程序,計(jì)算每組同源蛋白的蛋白質(zhì)特性參數(shù),如消光系數(shù)、分子量、帶電量、殘基數(shù)等。2結(jié)果與分析2.1同源蛋白的功能分類與功能分類通過(guò)雙向BLAST比對(duì),共得到48315種同源蛋白。其中,包含10個(gè)以上蛋白序列的同源蛋白有18042種。其中,Top-90組有115種,HT-only組有95種,M-only組有1659種。HT-only組95種同源蛋白根據(jù)同源蛋白簇(clusteroforthologousgroup,COG)的功能分類,得到屬于信息存儲(chǔ)與處理的同源蛋白共有19種,屬于細(xì)胞過(guò)程與信號(hào)傳導(dǎo)的共11種,參與代謝的8種,其中有57種同源蛋白屬于未知功能。另外還發(fā)現(xiàn),在19種參與信息存儲(chǔ)與處理的同源蛋白中有6種與核糖體相關(guān),7種屬于轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白。2.2各組cog的動(dòng)力學(xué)情況由圖1可知,Top-90組中50%以上的同源蛋白以及HT-only組中48%的同源蛋白參與了信息存儲(chǔ)與處理,而這一比例在M-only組中僅占28%;參與代謝的比例在3組中較為接近,都占各組COG的30%以上;參與細(xì)胞過(guò)程與信號(hào)傳導(dǎo)的比例在3組中略有差別,在M-only組中占的比例最大,為35%,其次是HT-only組中占20%,Top-90組中占16%。通過(guò)對(duì)3組同源蛋白的COG組成分析可知,微生物為了在高溫的極端環(huán)境下維持生存,嗜熱、超嗜熱古細(xì)菌和真細(xì)菌的基因組進(jìn)化出更多的用于信息存儲(chǔ)與處理的功能蛋白。2.3同源蛋白的序列及分析由表1可知,HT-only和M-only2組同源蛋白某些氨基酸的組成有著顯著差異。與M-only組的同源蛋白相比,HT-only組中的同源蛋白傾向于使用帶電荷的(B+D+E+H+K+R+Z,28.56%對(duì)應(yīng)24.05%,P<0.001)、酸性的(B+D+E+Z,13.28%對(duì)應(yīng)11.28%,P<0.001)和基本的(H+K+R,15.28%對(duì)應(yīng)12.77%,P<0.001)氨基酸殘基。而M-only組的同源蛋白對(duì)極小(A+C+G+S+T,29.44%對(duì)應(yīng)24.51%,P<0.001)和小氨基酸殘基(A+B+C+D+G+N+P+S+T+V,49.49%對(duì)應(yīng)44.80%,P<0.001)的使用比例明顯升高。2組同源蛋白在脂肪族、芳香族、極性和非極性氨基酸殘基的使用比例上差異不明顯。HT-only組同源蛋白的序列長(zhǎng)度大體上比M-only組的短,2組的平均值分別為235.66和273.58(P<0.05)。以上的性質(zhì)差異都有利于嗜熱、超嗜熱微生物的蛋白組在高溫環(huán)境下維持其熱穩(wěn)定性。2.4在不同溫度間分布的蛋白包括蛋白平均長(zhǎng)度、平均殘基重量、各種氨基酸組成和等電點(diǎn)的統(tǒng)計(jì)。除等電點(diǎn)之外,所有的參數(shù)在超嗜熱、嗜熱和常溫3個(gè)區(qū)間中的分布均差異顯著(P<0.05),在嗜冷和常溫2個(gè)區(qū)間的差異不顯著。蛋白質(zhì)序列中帶電荷的、基本的和酸性的氨基酸殘基的比例,在常溫和嗜冷2個(gè)溫度區(qū)間的蛋白顯著地(P<0.05)低于超嗜熱和嗜熱2個(gè)溫區(qū)分布的蛋白,這與HT-only組中的同源蛋白類似;而極小和小氨基酸殘基的比例高于超嗜熱和嗜熱2個(gè)溫度區(qū)間的蛋白。在不同溫度區(qū)間中分布的同源蛋白的序列長(zhǎng)度往往也有差別,生存在高溫環(huán)境中的古細(xì)菌和真細(xì)菌的蛋白質(zhì)序列長(zhǎng)度一般來(lái)說(shuō)較短。3高溫對(duì)蛋白質(zhì)氨基酸的影響蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ),維持著新陳代謝,在生物體內(nèi)占有極其重要的地位。因此,嗜熱微生物體內(nèi)蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性非常值得研究。通過(guò)對(duì)526個(gè)真細(xì)菌和古細(xì)菌的全蛋白質(zhì)組研究,從原核生物全蛋白序列的角度出發(fā),證實(shí)了熱穩(wěn)定與氨基酸組成存在的顯著相關(guān)性。超嗜熱和嗜熱菌中的蛋白為了適應(yīng)高溫的生存環(huán)境,常會(huì)使用更多帶電荷的氨基酸殘基,并且它們蛋白鏈的平均長(zhǎng)度也遠(yuǎn)短于常溫環(huán)境下的蛋白質(zhì)。推測(cè)超嗜熱、嗜熱微生物與常溫微生物蛋白質(zhì)氨基酸組成的差異,可能有利于維持蛋白質(zhì)在高溫環(huán)境中功能的穩(wěn)定性。通過(guò)對(duì)COG組成間的差異分析,發(fā)現(xiàn)嗜熱微生物中特有的一些蛋白質(zhì)在功