工業(yè)微生物誘變育種技術(shù)的發(fā)展

工業(yè)微生物誘變育種技術(shù)的發(fā)展

現(xiàn)代生物技術(shù)，尤其是發(fā)酵技術(shù)的最終產(chǎn)品，通常由工業(yè)微生物的“工廠”生產(chǎn)，并取得了顯著的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。據(jù)統(tǒng)計(jì),1979年世界工業(yè)酶產(chǎn)量為53000噸,1985年酶制劑的總產(chǎn)量為10萬(wàn)噸,作為商品出售的酶制劑有200余種,到1990年總產(chǎn)值約為10億美。就生物技術(shù)而言,1991年美國(guó)、德國(guó)、法國(guó)和英國(guó)的總銷售額依次為400,200,150,6.4億美元。對(duì)工業(yè)微生物菌種的優(yōu)化選育是提高產(chǎn)量和質(zhì)量的一條有效途徑。以突變和篩選為中心的傳統(tǒng)育種技術(shù)在工業(yè)微生物發(fā)展到現(xiàn)在規(guī)模的過(guò)程中始終起著重要作用。70年代以來(lái),重組DNA技術(shù)和原生質(zhì)體融合技術(shù)開(kāi)始用于菌種選育。各種外源基因在原核生物、真核細(xì)胞的克隆和表達(dá)研究取得了重大成果,使工業(yè)微生物育種技術(shù)進(jìn)入了真正意義的分子水平育種時(shí)代。1工業(yè)微生物培養(yǎng)方法1.1酵母菌種的生長(zhǎng)通過(guò)自然發(fā)生的突變和篩選法,篩選那些含有所需性狀得到改良的菌種。隨著富集篩選技術(shù)的不斷完善和改進(jìn),自然育種技術(shù)的效率有所提高,如含有突變基因naE、mutD、mutT、mutM、mutH、mutI等的大腸桿菌突變率相對(duì)較高。酒精發(fā)酵是最早把微生物遺傳學(xué)原理應(yīng)用于微生物育種實(shí)踐而提高發(fā)酵產(chǎn)物水平的一個(gè)成功實(shí)例。自然選育是一種簡(jiǎn)單易行的選育方法,可以達(dá)到純化菌種,防止菌種退化,提高產(chǎn)量的目的,但發(fā)生自然突變的幾率特別低,一般為10-6~10-10/BP。這樣低的突變率導(dǎo)致自然選育耗時(shí)長(zhǎng),工作量大,影響了育種工作效率,在這種情況下,出現(xiàn)了誘變育種技術(shù)。1.2誘變育種機(jī)理1927年Miller發(fā)現(xiàn)X射線能誘發(fā)果蠅基因突變。之后人們發(fā)現(xiàn)其他一些因素也能誘發(fā)基因突變,并逐漸弄清了一些誘變發(fā)生的機(jī)理,為工業(yè)微生物誘變育種提供了前提條件。1941年Beadle和Tatum采用X射線和紫外線誘變紅色面包霉,得到了各種代謝障礙的突變株。這之后誘變育種得到了極大發(fā)展。誘變育種是以誘變劑誘發(fā)微生物基因突變,通過(guò)篩選突變體,尋找正向突變菌株的一種誘變方法。誘變劑有物理誘變劑、化學(xué)誘變劑和生物誘變劑。1.2.1低能重離子生物學(xué)在生物組成技術(shù)中的應(yīng)用物理誘變劑包括紫外線、X射線、γ射線、激光、低能離子等。DNA和RNA的嘌呤和嘧啶有很強(qiáng)的紫外光吸收能力,最大的吸收峰在260nm,紫外輻射能作用于DNA,因此在260nm的紫外輻射是最有效的致死劑。紫外輻射可以引起轉(zhuǎn)換、顛換、移碼突變或缺失等。紫外線是常用的物理誘變因子,是誘發(fā)微生物突變的一種非常有用的工具。由于紫外線的能量比X射線和γ射線低得多,在核酸中能造成比較單一的損傷,所以在DNA的損傷與修復(fù)的研究中,紫外線也具有一定的重要性。常用的電離輻射有X射線、γ射線、β射線和快中子等。如γ射線具有很高的能量,能產(chǎn)生電離作用,因而直接或間接地改變DNA結(jié)構(gòu);電離輻射還能引起染色體畸變,發(fā)生染色體斷裂,形成染色體結(jié)構(gòu)的缺失、易位和倒位等。低能離子注入育種技術(shù)是近些年發(fā)展起來(lái)的物理誘變技術(shù)。該技術(shù)既以較小的生理?yè)p傷而得到較高的突變率、較廣的突變譜,而且具有設(shè)備簡(jiǎn)單、成本低廉、應(yīng)運(yùn)行和維修、對(duì)人體和環(huán)境無(wú)害等優(yōu)點(diǎn)。最近幾年,低能離子用于微生物誘變育種研究也取得可喜成績(jī)。目前利用離子注入進(jìn)行微生物菌種選育時(shí)所選用的離子大多為氣體單質(zhì)離子,并且均為正離子,其中以N+為最多,也有報(bào)道使用其他離子的,如H+、Ar+、O6+以及C6+。輻射能量大多集中在低能量輻射區(qū)。阮麗娟等(1993年)用低能離子注入糖化酶生產(chǎn)菌,僅僅經(jīng)過(guò)l~2年時(shí)間,糖化酶生產(chǎn)菌活力已從平均發(fā)酵1.5萬(wàn)單位提高到2萬(wàn)單位,最高一株達(dá)2.6萬(wàn)單位。除此之外,還有微波、雙向復(fù)合磁場(chǎng)、紅外射線和高能電子流等新誘變技術(shù),它們與其他誘變?cè)匆黄疬M(jìn)行復(fù)合誘變,能起到很好的誘變效果,因此從某種意義上稱這些誘變?cè)礊椤霸鲎儎薄?.2.2學(xué)誘變劑的使用化學(xué)誘變劑是一類能與DNA起作用而改變其結(jié)構(gòu),并引起DNA變異的物質(zhì)。其作用機(jī)制都是與DNA起化學(xué)作用,從而引起遺傳物質(zhì)的改變?；瘜W(xué)誘變劑包括烷化劑如甲基磺酸乙酯、硫酸二乙酯、亞硝基胍、亞硝基乙基脲、乙烯亞胺及氮芥等、天然堿基類似物、脫氨劑如亞硝酸、移碼誘變劑、羥化劑和金屬鹽類如氯化鋰及硫酸錳等。烷化劑是最有效,也是用得最廣泛的化學(xué)誘變劑之一,依靠其誘發(fā)的突變主要是GC~AT轉(zhuǎn)換,另外還有小范圍切除、移碼突變及GC對(duì)的缺失?；瘜W(xué)誘變劑的突變率通常要比電離輻射的高,并且十分經(jīng)濟(jì),但這些物質(zhì)大多是致癌劑,使用時(shí)必須十分謹(jǐn)慎。1.2.3生物因素的誘導(dǎo)生物誘變劑應(yīng)用面比較窄,因此應(yīng)用受到了限制。1.2.4組合誘變劑誘變某一菌株長(zhǎng)期使用誘變劑之后,除產(chǎn)生誘變劑“疲勞效應(yīng)”外,還會(huì)引起菌種生長(zhǎng)周期延長(zhǎng)、孢子量減少、代謝減慢等,這對(duì)生產(chǎn)不利,在實(shí)際生產(chǎn)中多采用幾種誘變劑復(fù)合處理、交叉使用的方法進(jìn)行菌株誘變。復(fù)合誘變是指兩種或多種誘變劑的先后使用、同一種誘變劑的重復(fù)作用、兩種或多種誘變荊的同時(shí)使用等誘變方法。普遍認(rèn)為,復(fù)合誘變具有協(xié)同效應(yīng)。如果兩種或兩種以上誘變劑合理搭配使用,復(fù)合誘變較單一誘變效果好。近年來(lái),一些新型誘變劑被開(kāi)發(fā)出來(lái),并被證明有良好的效果。1996年,離子束誘變用于右旋糖酐產(chǎn)生菌,得到產(chǎn)量提高36.5%的突變株;1999年N2激光輻照谷氨酸產(chǎn)生菌—鈍齒棒狀桿菌,谷氨酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率比對(duì)照提高31%;此外,用紅外射線誘變果膠酶產(chǎn)生菌、雙向磁場(chǎng)應(yīng)用于產(chǎn)腈水合酶的諾卡氏菌種的誘變育種都得到了較好效果。1.3獲得優(yōu)良性狀的菌種,包括具有優(yōu)良性狀的菌株,可提高接枝重基因重組是遺傳的基本現(xiàn)象之一,菌株能夠經(jīng)過(guò)基因重組獲得新的遺傳型,從而獲得具有優(yōu)良性狀的菌種?；蛑亟M是雜交育種的理論基礎(chǔ),由于雜交育種選用了已知性狀的供體菌和受體菌作為親本,所以不論是方向性還是自覺(jué)性,都比誘變育種前進(jìn)了一大步。1.3.1產(chǎn)量上升緩慢的現(xiàn)象雜交育種往往可以消除某一菌株在誘變處理后所出現(xiàn)的產(chǎn)量上升緩慢的現(xiàn)象,因而是一種重要的育種手段。但雜交育種方法較復(fù)雜,許多工業(yè)微生物有性世代不十分清楚,故沒(méi)有像誘變育種那樣得到普遍推廣和使用。1.3.2重組育種技術(shù)的進(jìn)展在工業(yè)微生物育種中,應(yīng)用轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)或接合等重組技術(shù)來(lái)培育應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐中的高產(chǎn)菌株的例子還不多見(jiàn),只是在1978年第二屆國(guó)際工業(yè)微生物遺傳學(xué)討論會(huì)上提出了原生質(zhì)體融合后,重組育種技術(shù)才獲得了飛速的發(fā)展。原生質(zhì)體融合技術(shù)由于可在種內(nèi)、種間甚至屬間進(jìn)行,不受親緣關(guān)系的影響,遺傳信息傳遞量大,不需了解雙親詳細(xì)的遺傳背景,因而便于操作。該技術(shù)起源于1960年,當(dāng)時(shí)法國(guó)Barski研究小組在培養(yǎng)兩種不同動(dòng)物細(xì)胞混合時(shí)發(fā)現(xiàn)自發(fā)融合現(xiàn)象;1978年國(guó)際工業(yè)微生物遺傳學(xué)討論會(huì)提出了原生質(zhì)體的融合問(wèn)題,使這一技術(shù)擴(kuò)展到了育種領(lǐng)域。近年來(lái),滅活原生質(zhì)體融合、離子束細(xì)胞融合、非對(duì)稱細(xì)胞融合以及基因重排分子育種等新方法相繼提出并且應(yīng)用于微生物育種,這是原生質(zhì)體融合技術(shù)的新發(fā)展。1.4誘變育種、代謝育種及教育代謝控制育種興起于20世紀(jì)50年代末,以1957年谷氨酸代謝控制發(fā)酵成功為標(biāo)志,并促使發(fā)酵工業(yè)進(jìn)入代謝控制發(fā)酵時(shí)期。近年來(lái)代謝工程取得了迅猛發(fā)展,尤其是基因組學(xué)、應(yīng)用分子生物學(xué)和分析技術(shù)的發(fā)展,使得導(dǎo)入定向改造的基因及隨后的在細(xì)胞水平上分析導(dǎo)入外源基因后的結(jié)果成為可能。快速代謝控制育種的活力在于以誘變育種為基礎(chǔ),獲得各種解除或繞過(guò)微生物正常代謝途徑的突變株,從而人為地使有用產(chǎn)物選擇性地大量生成積累,打破了微生物調(diào)節(jié)這一障礙。從微生物育種史中可以看出,經(jīng)典的誘變育種是最主要的育種手段,也是最基礎(chǔ)的手段,但它具有一定盲目性,代謝控制育種的崛起標(biāo)志著育種發(fā)展到理性階段,作為微生物育種最為活躍的領(lǐng)域而得到廣泛的應(yīng)用,它與雜交育種結(jié)合在一起,反映了當(dāng)代微生物育種的主要趨勢(shì)。代謝育種在工業(yè)上應(yīng)用非常廣泛。Tsuchida等采用亞硝基胍誘變等方法處理乳糖發(fā)酵短桿菌2256,最終選出一株L-亮氨酸高產(chǎn)菌,可在13%葡萄糖培養(yǎng)基中積累L-亮氨酸至34g/L。代謝控制育種提供了大量工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)菌種,使得了氨基酸、核苷酸、抗生素等次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)量成倍地提高,大大促進(jìn)了相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。1.5基因缺失藥物的產(chǎn)生過(guò)程基因工程育種是指利用基因工程方法對(duì)生產(chǎn)菌株進(jìn)行改造而獲得高產(chǎn)工程菌,或者是通過(guò)微生物間的轉(zhuǎn)基因而獲得新菌種的育種方法甚因工程育種是真正意義上的理性選育,按照人們事先設(shè)計(jì)和控制的方法進(jìn)行育種,是當(dāng)前最先進(jìn)的育種技術(shù)?；蚬こ逃N技術(shù)在許多方面都有突破性的進(jìn)展,主要體現(xiàn)以下幾方面:(1)目的基因的獲得,一般通過(guò)化學(xué)合成法、物理化學(xué)法、鳥(niǎo)槍無(wú)性繁殖法、酶促合成法、Norther雜交分析法、cDNA文庫(kù)篩選法、雜交篩選法等方法獲得目的基因;(2)載體的選擇,基因工程載體主要是質(zhì)粒和病毒。載體一般為環(huán)狀DNA;(3)重組子體外構(gòu)建;(4)重組載體導(dǎo)人受體細(xì)胞;(5)重組體篩選和鑒定,以合適的篩選方法選擇具有最佳性能的突變重組子。通過(guò)基因工程方法生產(chǎn)的藥物、疫苗、單克隆抗體及診斷試劑等已有幾十種產(chǎn)品批準(zhǔn)上市;通過(guò)基因工程方法已獲得包括氨基酸類(蘇氨酸、精氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、組氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、纈氨酸等)、工業(yè)用酶制劑(脂肪酶、纖維素酶、乙酰乳酸脫羧酶及淀粉酶等)以及頭孢菌素C等的工程菌,大幅度提高了生產(chǎn)能力;通過(guò)基因工程方法改造傳統(tǒng)發(fā)酵工藝也獲得了巨大進(jìn)展,如氧傳遞有關(guān)的血紅蛋白基因克隆到遠(yuǎn)青鏈霉菌,降低了對(duì)氧的敏感性,在通氣不足時(shí),其目的產(chǎn)物放線紅菌素產(chǎn)量可提高4倍。2工業(yè)微生物育種的意義隨著分子生物學(xué)等各項(xiàng)新技術(shù)的快速發(fā)展,微生物分子育種領(lǐng)域已經(jīng)得到了快速進(jìn)展,人類已經(jīng)可以按照自己意愿對(duì)微生物進(jìn)行改造,使其能更好地為人類造福。工業(yè)微生物遺傳育種在基因工程、細(xì)胞工程、蛋白質(zhì)工程和酶工程等現(xiàn)代生物技術(shù)的基礎(chǔ)上,創(chuàng)造出了許多設(shè)計(jì)巧妙、科技含量高、目的性強(qiáng)、勞動(dòng)強(qiáng)度低、效果顯著的育種方法,為人類獲得穩(wěn)定性好、高產(chǎn)、新種類的工程菌株,開(kāi)發(fā)新藥和工業(yè)產(chǎn)品,提高產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量都提供了有力的保障。相信微生物遺傳育種學(xué)將得到更加全面發(fā)展,將為生產(chǎn)實(shí)踐提供更多的優(yōu)良菌株,在各領(lǐng)域發(fā)揮更加重要的作用。3注重回復(fù)突變和重組菌株的選育,提高產(chǎn)品質(zhì)量隨著生物技術(shù)的不