人牙來源牙囊間充質(zhì)干細胞質(zhì)量規(guī)范（征求意見稿）

ICS點擊此處添加ICS號點擊此處添加中國標準文獻分類號DB51Qualitycontrolandtechnicalspecificationsofhumandental-derivedmesenchymal1DBXX/XXXXX—XXXX 32規(guī)范性引用文件 33術(shù)語和定義 34縮略語 35技術(shù)要求 46檢測方法 57檢驗規(guī)則 68廢棄物處理 72DBXX/XXXXX—XXXX本標準按照GB/T1.1-2020給出的規(guī)則起草。本標準由四川省市場監(jiān)督管理局提出。本標準由四川省XXXXXX歸口。本標準起草單位：四川省干細胞技術(shù)與細胞治療協(xié)會、成都世聯(lián)康健生物科技有限公司牽頭，中國測試技術(shù)研究院生物研究所,XXXXXXXX。本標準主要起草人：XXXXXXXX。3DBXX/XXXXX—XXXX人牙來源牙囊間充質(zhì)干細胞質(zhì)量規(guī)范本文件規(guī)定了人牙來源牙囊間充質(zhì)干細胞的原輔料要求、細胞關(guān)鍵質(zhì)量屬性、細胞制備過程控制、細胞質(zhì)量檢驗方法、檢驗規(guī)則和廢棄物處理要求。本文件適用于人牙來源牙囊間充質(zhì)干細胞的制備、檢測和質(zhì)量控制。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T40365-2021細胞無菌檢測通則3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1人牙來源牙囊間充質(zhì)干細胞humandental-derivedmesenchymalstemcells從人不同發(fā)育階段牙齒組織或其附屬組織中分離的間充質(zhì)干細胞，包括牙髓干細胞、牙周膜干細胞、牙囊干細胞、脫落乳牙干細胞、根尖牙乳頭干細胞等，貼壁生長后呈成纖維細胞樣形態(tài)，可在體外自我更新，并具有成骨分化、成脂分化能力的干細胞。3.2原材料rawandprocessedmaterial可用于分離各種人牙來源牙囊間充質(zhì)干細胞的原始材料包括牙髓組織、牙囊組織、牙周膜組織乳牙牙髓組織、根尖組織等。3.3輔助材料accessorymaterial用于人牙來源牙囊間充質(zhì)干細胞分離、培養(yǎng)、運輸、儲存等過程中的采集器械、容器、清洗液、保存液、培養(yǎng)基、生長因子等。4縮略語下列縮略語適用于本文本EBV—人類皰疹病毒（Epstein-BarrVirus）HBV—乙型肝炎病毒（HepatitisBVirus）HCMV—人巨細胞病毒（HumanCytomegalovirus）HCV—丙型肝炎病毒（HepatitisCVirus）HIV—人類免疫缺陷病毒（HumanImmunodeficiencyVirus）HTLV—人類嗜T細胞病毒（HumanT-lymphotropicVirus）4DBXX/XXXXX—XXXXSTR—短串聯(lián)重復序列（ShortTandemRepeat）TP—梅毒螺旋體（TreponemaPallidum）SOP—標準操作規(guī)程（StandardOperatingProcedure）5技術(shù)要求5.1原材料和輔助材料5.1.1原材料要求5.1.1.1用于人牙來源牙囊間充質(zhì)干細胞分離的原材料來源應符合倫理規(guī)范和法律法規(guī)。5.1.1.2用于人牙來源牙囊間充質(zhì)干細胞分離的原材料供者應簽署書面的合法有效的知情同意書；如原材料供者屬未成年人，知情同意書應由供者及其法定監(jiān)護人共同簽署；知情同意書應包括但不限于：人牙來源牙囊間充質(zhì)干細胞在合適的條件下潛在的研究及治療應用、研究成果潛在的商業(yè)應用、剩余材料的處置以及其他相關(guān)問題所適用的內(nèi)容；應有明確的供者（如供者系未成年人，應包括其法定監(jiān)護人）的個人隱私保護機制。5.1.1.3用于人牙來源牙囊間充質(zhì)干細胞分離的原材料應建立原材料獲取方式、獲取途徑及相關(guān)臨床資料，包括但不限于供者一般信息、既往病史及家族史等。既往病史和家族史應對遺傳性疾病相關(guān)信息進行詳細采集。5.1.2輔助材料要求5.1.2.1用于人牙來源牙囊間充質(zhì)干細胞分離的采集器械、容器、清洗液、保存液、培養(yǎng)基、生長因子等輔料應符合相關(guān)的質(zhì)量要求，應包括但不限于供應商進行資質(zhì)審核認證、產(chǎn)品質(zhì)量報告和批次檢驗報告、質(zhì)量抽檢報告等。5.1.2.2用于人牙來源牙囊間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基，應采用無動物源成分的培養(yǎng)基。5.1.2.3用于人牙來源牙囊間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基中如含有人源血液成分，應明確其來源、批號及質(zhì)量檢定合格報告，原則上采用國家批準的相關(guān)產(chǎn)品，如使用未經(jīng)批準的人源血液相關(guān)制劑，則應提供相應的檢驗檢測合格報告。5.1.3供者應篩查HIV、HBV、HCV、HTLV、EBV、HCMV、TP，并記錄保存結(jié)果。5.2關(guān)鍵質(zhì)量指標5.2.1細胞形態(tài)人牙來源牙囊間充質(zhì)干細胞在二維培養(yǎng)條件下，細胞貼壁生長，細胞形態(tài)以梭形或紡錘形為主，細胞形態(tài)隨細胞密度可略有改變。5.2.2細胞標志蛋白人牙來源牙囊間充質(zhì)干細胞CD105、CD73、CD90陽性率≥95%；CD11b、CD19、CD31、CD34、CD45、HLA-DR陽性率≤2%。5.2.3細胞存活率未經(jīng)凍存的細胞活率≥90%，凍存后復蘇的細胞活率≥80%。5.2.4免疫調(diào)節(jié)人牙來源牙囊間充質(zhì)干細胞經(jīng)炎癥因子（IFN-γ或者TNF-α)誘導后可表達吲哚胺2,3-雙加氧酶（IDO）；與T淋巴細胞共培養(yǎng)，能抑制T淋巴細胞增殖及IFN-γ、TNF-α分泌。5.2.5多向分化人牙來源牙囊間充質(zhì)干細胞具有成骨、成脂分化能力。5.2.6成瘤性人牙來源牙囊間充質(zhì)干細胞在免疫缺陷小鼠體內(nèi)成瘤試驗結(jié)果應為陰性。5.2.7微生物5DBXX/XXXXX—XXXX真菌、細菌、支原體、HIV、HBV、HCV、HTLV、EBV、HCMV、TP應為陰性。5.3質(zhì)量控制5.3.1原材料采集原材料相關(guān)的牙體組織、牙胚組織應由具有口腔執(zhí)業(yè)醫(yī)師資格的醫(yī)師在醫(yī)療機構(gòu)采集完成；供者應無牙體和牙髓病變。樣品采集后，應置于無菌采集容器中密閉保存，并賦予唯一識別碼。5.3.2原材料運輸原材料運輸應制定完整的SOP及應急預案，運輸人員應是經(jīng)過培訓合格的人員；樣本運輸全程應有詳細的記錄，內(nèi)容包括但不限于運輸?shù)姆绞?、條件、路徑、時間、人員、地址及樣本信息，相關(guān)記錄入檔保留至少20年；運輸溫度為2℃~10℃,運輸時間不得超過12小時。5.3.3原材料接收原材料接收應制定完整的接收SOP，原材料樣本接收人員應是經(jīng)過培訓合格的人員；應制定原材料接收信息記錄表及明確的原材料樣品接收標準，遵從安全與準確的原則對樣本接收制定規(guī)范及應急預案，并填寫相關(guān)記錄，相關(guān)記錄入檔保留至少20年；原材料樣本接收后應及時處理，對不能及時處理的樣本，應保存在2℃~10℃條件下，最長時間不得超過12小時。5.3.4細胞分離與培養(yǎng)5.3.4.1細胞分離與培養(yǎng)應制定完整的操作SOP；細胞分離與培養(yǎng)過程中應避免不同供體之間的交叉污染；同一供體牙體或牙胚組織分離多種細胞的，應有完整的操作SOP，避免同一供體不同類型細胞之間的混淆或交叉污染。5.3.4.2細胞分離后擴增培養(yǎng)過程中應明確細胞的名稱、培養(yǎng)代次、操作時間、培養(yǎng)條件等詳細的操作記錄，相關(guān)記錄入檔保留至少20年。5.3.4.3細胞凍存應制定完整的操作SOP，凍存的細胞應標明細胞名稱、培養(yǎng)代次、操作時間等信息；凍存細胞應具有唯一識別碼，且可與供體、采集、分離、擴增培養(yǎng)等信息相對應；細胞凍存液應采用國家已批準的臨床級產(chǎn)品或藥品輔料，凍存應使用符合要求的液氮容器氣相凍存；細胞凍存庫由專人負責，保證液氮充足，溫度恒定，并定期巡檢并記錄。5.3.4.4細胞復蘇應制定完整的操作SOP，復蘇的細胞應標明細胞名稱、代次、批次、培養(yǎng)條件、操作人員、復蘇時間等信息。5.3.5細胞運輸5.3.5.1細胞運輸應制定完整的操作SOP及應急預案，運輸人員應是經(jīng)過培訓合格的人員；根據(jù)干細胞的使用要求，選擇合適的承載細胞的容器、運輸方式、運輸條件、運輸設(shè)備和運輸路線，保證細胞的穩(wěn)定性和有效性。5.3.5.2運輸條件的控制應包括但不限于溫度控制、運輸時間、無污染、運輸設(shè)備性能和外包裝等。5.3.5.3細胞的運輸應全程記錄，包括但不限于細胞運輸?shù)姆绞?、條件、路徑、時間、人員、地址及干細胞信息等，記錄入檔保存至少20年。5.3.5.4凍存細胞應采用不高于-130℃的條件下運輸，復蘇細胞或新鮮制劑應在2℃~10℃條件下運輸。6檢測方法6.1病原微生物檢測6.1.1無菌檢測參照《中華人民共和國藥典》無菌檢測法執(zhí)行，對樣本采集、運輸、分離、培養(yǎng)、凍存、復蘇等制備環(huán)節(jié)進行留樣（至少包括保存液、清洗液、培養(yǎng)基上清、細胞懸液、凍存液等）檢測。細菌和真菌檢測結(jié)果都應為陰性。6DBXX/XXXXX—XXXX6.1.2支原體檢測參照《中華人民共和國藥典》支原體檢測法執(zhí)行，對樣本采集、運輸、分離、培養(yǎng)、凍存、復蘇等生產(chǎn)制備環(huán)節(jié)進行留樣（至少包括保存液、清洗液、培養(yǎng)基上清、細胞懸液、凍存液等）檢測。支原體檢測結(jié)果都應為陰性。6.1.3細胞內(nèi)外源致病因子檢測采用核酸檢測法，對樣本采集、運輸、分離、培養(yǎng)、凍存、復蘇等制備環(huán)節(jié)進行留樣（至少包括保存液、清洗液、培養(yǎng)基上清、細胞懸液、凍存液等）檢測,HIV、HBV、HCV、HTLV、EBV、HCMV、TP檢測應為陰性。6.2內(nèi)毒素檢測參照中國藥品檢驗標準操作規(guī)程中細菌內(nèi)毒素檢查法執(zhí)行，對樣本采集、運輸、分離、培養(yǎng)、凍存、復蘇等生產(chǎn)制備環(huán)節(jié)進行留樣（至少包括保存液、清洗液、培養(yǎng)基上清、細胞懸液、凍存液等）檢測。各類樣本中的內(nèi)毒素檢測值應≤0.5EU/mL。6.3異常免疫學反應檢測采用流式細胞術(shù)或ELISA技術(shù)測定牙源性間充質(zhì)干細胞對于活化的人總淋巴細胞的增殖和對不同淋巴細胞亞群增殖能力的影響，以及對淋巴細胞相關(guān)細胞因子分泌的影響。淋巴細胞亞群應無異常增殖，細胞因子表達水平應無異常增加。6.4致瘤性檢測采用免疫缺陷動物（裸鼠或SCID鼠通過局部皮下接種人牙來源牙囊間充質(zhì)干細胞，評價人牙來源牙囊間充質(zhì)干細胞致瘤性。體內(nèi)致瘤試驗嚴格遵照動物倫理要求執(zhí)行，單只小鼠接種人牙來源牙囊間充質(zhì)干細胞數(shù)量≥106個細胞，觀察期≥12周。人牙來源牙囊間充質(zhì)干細胞應無致瘤性。6.5細胞活率檢測采用臺盼藍拒染法進行細胞存活率測定，各代數(shù)及批次人牙來源牙囊間充質(zhì)干細胞活細胞比例6.6細胞純度檢測采用流式細胞術(shù)檢測人牙來源牙囊間充質(zhì)干細胞表面標志物以及人基因組DNA短片段重復序列（STR）測序進行檢定。各代數(shù)及批次人牙來源牙囊間充質(zhì)干細胞表面標志物陽性/陰性比率應符合要求，單一供者來源的細胞各代次及批次細胞STR檢測結(jié)果應保持一致。6.7干細胞分化能力檢測體外定向誘導培養(yǎng)條件，人牙來源牙囊間充質(zhì)干細胞應能夠分化為成脂肪、成骨細胞。成脂分化鑒定采用油紅O染色法鑒定，成骨分化鑒定采用茜素紅染色法鑒定。6.8染色體核型檢測采用G帶分析法進行測定，人牙來源牙囊間充質(zhì)干細胞染色體數(shù)量為46XX或46XY，染色體結(jié)構(gòu)無缺失、重復、斷裂、倒位、異位。7檢驗規(guī)則7.1抽樣方法和數(shù)量在一個細胞制備周期中，同一生產(chǎn)線、同一來源、同一工藝、同一代次制備的細胞規(guī)定為一批；在同一批次制備的細胞中，隨機抽取3個最小包裝單元用于相關(guān)檢測檢驗。7.2出庫檢驗每批次細胞進行出庫檢驗，檢驗項目包括5.2中規(guī)定的所以項目，并附簽字蓋章的檢驗報告。7.3復核檢驗7DBXX/XXXXX—XXXX根據(jù)實際使用情況需要，細胞由具有相關(guān)資質(zhì)的細胞質(zhì)量復核檢驗機構(gòu)/實驗室進行獨立復核檢驗。8廢棄物處理