星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化杉木葉雙黃酮和金松雙黃酮的提取工藝

星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化杉木葉雙黃酮和金松雙黃酮的提取工藝

紅杉是紅杉科的一種獨(dú)特植物。廣泛栽培于我國長江流域及秦嶺以南地區(qū),是我國南方的重要經(jīng)濟(jì)樹種,具有栽培廣泛、生長快、材質(zhì)好、用途廣、產(chǎn)量高等特點(diǎn)。其心材、葉、種子、果實(shí)、根等均可入藥。杉葉味辛,性微溫,有祛風(fēng)、化痰、活血、解毒的功用,主治半身不遂初起,風(fēng)疹,咳嗽等。目前國內(nèi)對杉木的研究大多側(cè)重于種植、生理生態(tài)等農(nóng)林方面,而對藥用方面的研究較少,對其化學(xué)成分及藥理藥效方面的研究更少。杉木在國內(nèi)主要被用作木材,而其枝葉被當(dāng)作廢棄物。據(jù)報(bào)道,其葉中含有大量的雙黃酮,如穗花杉雙黃酮,紅杉雙黃酮,異柳杉素,扁柏雙黃酮,榧雙黃酮,南方貝殼杉雙黃酮,金松雙黃酮等。藥理研究表明,杉葉的熱甲醇提取物有抗炎作用。穗花杉雙黃酮有抗炎活性,并對BGC-823(人胃腺癌細(xì)胞株)有抑制作用,金松雙黃酮有抗瘧原蟲、殺利什曼原蟲、錐體蟲活性,對成骨細(xì)胞的分化有促進(jìn)作用。本實(shí)驗(yàn)以穗花杉雙黃酮和金松雙黃酮收率的歸一化值為指標(biāo),采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化杉葉的提取工藝,確定最佳提取工藝,對于充分利用杉木資源,擴(kuò)大其利用價(jià)值及其廢物利用有重要的意義。1儀器、試劑與試劑Waters2695高效液相色譜儀,Waters2996二極管陣列檢測器(PAD);Varian1200L三重四極桿電噴霧質(zhì)譜檢測器和Varian1200L色譜-質(zhì)譜工作站;UPLCAcquity/QTOFMSPremier;智能超聲波清洗器DL-720B(上海之信儀器有限公司);超純水機(jī)UltraPureUVF(上海和泰儀器有限公司);TDL-5-A低速臺式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);水浴鍋LOOYEZX98-1(上海魯伊工貿(mào)有限公司)。金松雙黃酮、穗花杉雙黃酮(均為上海交通大學(xué)植物生物技術(shù)中心自制,純度≥98%);杉木藥材采集于浙江金華百草園,并由第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室張漢明教授鑒定為杉科植物杉木(C.Lanceolata)的枝葉;色譜純甲醇(FisherScientific);丙酮、甲醇、無水乙醇均為AR級(上海凌峰化學(xué)試劑有限公司);磷酸為AR級(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。2方法和結(jié)果2.1黃酮綏化山和金松黃酮的純度、質(zhì)量分析2.1.1流動相、質(zhì)譜條件溶液的制備:取5mg穗花杉雙黃酮,甲醇溶解,定容到50mL,進(jìn)樣10μL。色譜條件:色譜柱:AmethystC18色譜柱(4.6×250mm,5μm);流動相:甲醇-0.2%磷酸水溶液(65%∶35%)等度洗脫;柱溫:35℃;流速:1mL/min;檢測波長:335nm。采用面積歸一法進(jìn)行計(jì)算,其純度為98.11%(tR=9.017min)。質(zhì)譜條件:電噴霧離子源,正離子或負(fù)離子掃描模式;掃描范圍:300～800amu;噴針電壓:3500V;毛細(xì)管電壓:-20V;干燥氣(N2)壓力:21psi;霧化溫度:300℃。質(zhì)譜分析:ESI-MSm/z:537.19[M-H]-,539.19[M+H]+,與文獻(xiàn)報(bào)道一致,為穗花杉雙黃酮。2.1.2流動相、流速和質(zhì)譜條件溶液的制備:取2mg金松雙黃酮,甲醇溶解,定容到50mL,進(jìn)樣10μL。色譜條件:色譜柱:AmethystC18色譜柱(4.6×250mm,5μm);流動相:甲醇-0.2%磷酸水溶液(80%∶20%)等度洗脫;柱溫:35℃;流速:1mL·min-1;檢測波長:335nm。采用面積歸一法進(jìn)行計(jì)算,其純度為98.02%(tR=12.436min)。質(zhì)譜條件:ESI電離源,正離子方式檢測時(shí)噴霧電壓為3.2kV,霧化氣流量600L/h,去溶劑溫度350℃,離子源溫度100℃,碰撞能量2.0eV。質(zhì)譜分析:ESI-Q-TOFm/z:581.15[M+H]+,與文獻(xiàn)報(bào)道一致,為金松雙黃酮。2.2黃酮綏化山和金松綏化山的測定2.2.1流動相及洗脫條件色譜柱:AmethystC18色譜柱(4.6×250mm,5μm);流動相:以甲醇為流動相A,0.2%的磷酸水溶液為流動相B,采用系統(tǒng)梯度洗脫:0～25min,65%A,25～30min,65%～80%A;柱溫:35℃;流速:1mL/min;檢測波長:335nm。2.2.2混合對照品溶液對照品溶液:分別精密稱取穗花杉雙黃酮、金松雙黃酮對照品適量,加甲醇制成每1mL含穗花杉雙黃酮50μg和金松雙黃酮20μg的混合對照品溶液(見圖1)。供試品溶液:取杉木枝葉粉末(過20目篩)約0.5g,精密稱定,加50%乙醇6.5mL,超聲提取(600W,60℃,60KHz)60min,離心(5000×g)5min,依上述方法提取3次,合并上清液至50mL容量瓶,殘?jiān)?0%乙醇清洗三次,合并濾液,加50%乙醇稀釋至刻度,搖勻,即得(見圖2)。2.2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線方程精密吸取上述混合對照品溶液2、4、6、8、10μL按2.2.1項(xiàng)下的色譜條件自動進(jìn)樣,以對照品質(zhì)量濃度X對色譜峰面積Y進(jìn)行線性回歸,得穗花杉雙黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:Y=-135300.1+3878422X(r=0.9996,n=5),金松雙黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:Y=-12711.4+1045457X(r=0.9994,n=5)。2.2.4精密度測試取供試品溶液,連續(xù)進(jìn)樣6次,結(jié)果穗花杉雙黃酮、金松雙黃酮含量的RSD分別為0.41%和2.04%,表明儀器精密度良好。2.2.5穗花杉、金松雙黃酮、穗花杉、雙黃酮含量的穩(wěn)定性取供試品溶液,分別于0、1、3、6、9、12、15、18、21、24h進(jìn)行測定,結(jié)果穗花杉雙黃酮、金松雙黃酮含量的RSD分別為1.46%和2.79%,表明樣品在24h內(nèi)穩(wěn)定。2.2.6重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果取杉木枝葉樣品6份,按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液,平行測定,結(jié)果穗花杉雙黃酮、金松雙黃酮含量的RSD分別為0.98%和2.28%,表明方法重復(fù)性良好。2.2.7穗花杉雙黃酮回收率和rsd取樣品粉末約0.25g,共9份,分別按照樣品中穗花杉雙黃酮和金松雙黃酮含量的80%、100%和120%加入兩種對照品,按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液,結(jié)果穗花杉雙黃酮平均回收率為99.4%,RSD為1.54%;金松雙黃酮的平均回收率為101.9%,RSD為2.79%,表明方法準(zhǔn)確度良好。2.3試驗(yàn)選擇的提取要素和相關(guān)水平2.3.1提取率的確定本試驗(yàn)對丙酮,甲醇,75%乙醇的提取效果進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)75%乙醇的提取率最高,因此選擇乙醇溶液進(jìn)行提取。為確定最佳乙醇體積分?jǐn)?shù),將乙醇體積分?jǐn)?shù)范圍確定為30%～90%,并按星點(diǎn)設(shè)計(jì)方法將梯度設(shè)定為:30.0%、42.7%、60.0%、77.3%、90.0%。2.3.2確定梯度設(shè)置本試驗(yàn)采用超聲提取的方法,將提取時(shí)間范圍確定為30～60min,按星點(diǎn)設(shè)計(jì)方法將各梯度設(shè)定為:30.0、36.3、45.0、53.7、60.0min。2.3.3料液比對提取率的影響在中藥提取工藝中,料液比通常為15倍左右。提取溶劑太少,不僅提取不完全,而且會因?yàn)樗幉奈杖軇?而導(dǎo)致無法過濾。料液比過大,則溶劑消耗過多,需要更大的經(jīng)濟(jì)投入。為了完全地考察料液比對提取率的影響,本實(shí)驗(yàn)將料液比的考察范圍確定為10～50倍。按星點(diǎn)設(shè)計(jì)方法將各梯度設(shè)定為:10.0、18.5、30.0、41.5、50.0。2.4最佳提取工藝的確定及回歸模型的繪制各因素水平設(shè)計(jì)見表1,按星點(diǎn)設(shè)計(jì)方法安排試驗(yàn),共20組(見表2),分別標(biāo)號為S1-S20。取干燥的浙江金華百草園的杉木枝葉樣品粉末約0.5g,精密稱定,每組平行3份,按表2進(jìn)行處理,提取3次,定容至50mL,溶液過0.45μm濾膜,取續(xù)濾液,備用。為精確考察乙醇體積分?jǐn)?shù)(X1),料液比(X2),提取時(shí)間(X3)對穗花杉雙黃酮和金松雙黃酮提取效率的影響,并確定其最佳提取工藝,本研究以X1,X2,X3為自變量,引入歸一化值(OD)為指標(biāo)進(jìn)行評價(jià)?！皻w一化”法是將每個(gè)指標(biāo)均標(biāo)準(zhǔn)化為0～1間的“歸一值”,各指標(biāo)得“歸一值”求算幾何平均數(shù)即為總評“歸一值”(overalldesirability)。OD=(d1d2…dn)1/n,n為指標(biāo)數(shù)。對取值越小越好的因素和取值越大越好的因素采用Hassan方法分別進(jìn)行數(shù)學(xué)轉(zhuǎn)換求“歸一值”dmin和dmax,dmin=(ymax-y1)/(ymax-ymin),dmax=(y1-ymin)/(ymax-ymin)。本試驗(yàn)歸一化值(OD)按dmax公式進(jìn)行計(jì)算。用spss11.5軟件包對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元線性回歸和二次多項(xiàng)式擬合。對所擬合的模型進(jìn)行適合性檢驗(yàn),以通過檢驗(yàn)的數(shù)學(xué)模型為基礎(chǔ)用Origin8.0繪制三維效應(yīng)面圖。由圖中的指標(biāo)值選取最佳自變量值,最后用效應(yīng)面法得出的工藝條件提取藥材,依據(jù)模型進(jìn)行預(yù)測分析,進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),最終得倒優(yōu)化的提取工藝。2.5次多項(xiàng)式擬合應(yīng)用spss11.5軟件包對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元線性回歸和二次多項(xiàng)式擬合,得到的回歸模型分別為:多元線性回歸方程擬合結(jié)果:OD=-0.156+0.013X1-0.001X2+0.003X3其中,復(fù)相關(guān)系數(shù)R=0.654,P=0.027<0.05,擬合模型通過,但其復(fù)相關(guān)系數(shù)較低,所以拒絕。二次多項(xiàng)式擬合結(jié)果:OD=-1.823+0.043X1+0.044X2+0.017X3-0.001X2112+0.000X1·X2+0.001X1·X3+0.000X2222-0.001X2·X3+0.000X2332R=0.950,P=0.000<0.05。但其X3項(xiàng)系數(shù)t檢驗(yàn)為0.360,P=0.726,遠(yuǎn)大于0.05,所以刪除后再進(jìn)行二項(xiàng)式回歸。簡化后(各系數(shù)見表3),回歸方程為:歸一化值OD=-1.334+0.040X1+0.041X2-0.001X2112+0.001X1·X3-0.001X2·X3R=0.949,P=0.000<0.05,擬合模型通過,復(fù)相關(guān)系數(shù)也較高,說明二次多項(xiàng)式模型較優(yōu)。2.6最優(yōu)提取工藝確定與驗(yàn)證試驗(yàn)根據(jù)擬合的二次回歸方程,用Origin8.0繪制三維效應(yīng)面(responsesurface)圖和等高線。由圖3～5可以看出每個(gè)效應(yīng)面都具有一個(gè)較優(yōu)勢區(qū)域,將各較優(yōu)區(qū)域重疊,選取穗花杉雙黃酮和金松雙黃酮提取的最佳工藝范圍:乙醇體積分?jǐn)?shù)為40.6%～59.7%,料液比為10.0～15.3倍,提取時(shí)間為57.5～60.0min?？紤]到節(jié)約成本、簡化試驗(yàn)等因素,最終確定試驗(yàn)優(yōu)化工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)(X1)50%,料液比(X2)為1∶13,提取時(shí)間(X3)為60min。依據(jù)最優(yōu)提取工藝條件再提取杉木枝葉樣品3份,進(jìn)行最優(yōu)提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn),并將測定的平均結(jié)果與擬合方程的預(yù)測值進(jìn)行比較,計(jì)算其相對偏差[相對偏差=(預(yù)測值-實(shí)測值)/預(yù)測值×100%],歸一化值(OD)的相對偏差為-2.55%。實(shí)測值與預(yù)測值之間偏差率較小,說明驗(yàn)證試驗(yàn)的預(yù)測值和實(shí)測值基本相吻合,星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法具有較好的預(yù)測效果。3超聲提取溫度和提取次數(shù)對提取效果的影響本研究對杉木枝葉中穗花杉雙黃酮和金松雙黃酮的提取方法進(jìn)行了考察,分別采用熱回流,溫浸(60℃),超聲(600W,60KHz,60℃)進(jìn)行提取,每次60min,提取3次,結(jié)果發(fā)現(xiàn),超聲提取效果略優(yōu)于熱回流,溫浸效果最差,所以本研究擬采用超聲提取。本試驗(yàn)對超聲提取溫度60、70、80