環(huán)丙沙星對(duì)豬鏈球菌病的緩解作用

環(huán)丙沙星對(duì)豬鏈球菌病的緩解作用

氨基丙沙星是氨基丙烯酸酯活性最強(qiáng)的品種之一。這是控制全身感染的藥。以往的研究證明了這種抗高血壓藥物具有解決方案。0.1～100mg/ml的環(huán)丙沙星可降低人白細(xì)胞粘附性;其影響人中性多核細(xì)胞趨化性的程度屬中等且取決于受試者個(gè)體差異;小鼠腹腔注射該藥,5mg/(kg·d)給藥組遲發(fā)型皮膚超敏(DTH)無反應(yīng),而10mg/(kg·d)給藥組DTH反應(yīng)被顯著抑制,皮下注射,并不影響小鼠DTH反應(yīng);5～20μg/ml的環(huán)丙沙星能增強(qiáng)體外淋巴細(xì)胞增殖,達(dá)20μg/ml時(shí),則對(duì)有絲分裂原刺激淋巴細(xì)胞分裂的S期和G2/M期有顯著抑制作用;小鼠皮下注射環(huán)丙沙星,用SRBC免疫時(shí),特異性抗體增加,但Forxgern等、Sato等卻認(rèn)為該藥抑制免疫球蛋白的產(chǎn)生,不過,當(dāng)小鼠連續(xù)3d按10mg/(kg·d)腹腔注射該藥,最后一次給藥后,接種SRBC免疫,溶血IgG形成細(xì)胞受到抑制,IgM形成細(xì)胞不變,連續(xù)7d給藥,抗體形成細(xì)胞不再發(fā)生變化,若先用SRBC免疫后24h,再連續(xù)腹腔給藥3d,IgM形成細(xì)胞顯著增加,IgG則受到抑制?？傊?由于方法和條件不同,對(duì)環(huán)丙沙星免疫調(diào)節(jié)作用研究常得到一些不同結(jié)論;且大多數(shù)研究建立在小鼠模型上和體外研究,與獸醫(yī)臨床相比,尚有差距。因此研究該藥臨床用藥狀況下的免疫調(diào)節(jié)作用,有著更實(shí)際的意義。鏈球菌病是常見的熱性傳染病,鏈球菌的某些毒力因子對(duì)影響宿主吞噬細(xì)胞功能、DTH反應(yīng)、體外淋巴細(xì)胞增殖、免疫球蛋白的產(chǎn)生、補(bǔ)體活性的影響已有報(bào)道。這些研究主要立足于人鏈球菌病及體外試驗(yàn),對(duì)抗生素治療鏈球菌病免疫學(xué)研究報(bào)道尚少見諸文獻(xiàn)。本研究旨在檢測環(huán)丙沙星治療鏈球菌病時(shí)對(duì)機(jī)體免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用,以探討藥物、機(jī)體與病原間的關(guān)系。1材料和方法1.1材料表面1.1.1動(dòng)物分組及免疫7周齡長大雜交豬24頭,體重(25.5±1.4)kg,公母各半,均去勢,購于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)種豬場。隨機(jī)均分為空白組、陰性組、陽性組和試驗(yàn)組。供試前,按生產(chǎn)要求進(jìn)行飼養(yǎng),且免疫接種豬瘟、仔豬副傷寒、豬丹毒、豬肺疫等疫苗,不接種鏈球菌疫苗,無鏈球菌病史,確保動(dòng)物沒接觸過喹諾酮類藥物。臨試前,在試驗(yàn)條件下觀察1周,臨床健康,觀察和試驗(yàn)期間,飼喂不含任何抗菌藥物全價(jià)中豬料,圈養(yǎng),自由飲水。1.1.2藥物、藥物及試劑供試菌種C55126系馬腺疫鏈球菌獸疫亞種,購于中國獸藥監(jiān)察所。使用前經(jīng)普通肉湯培養(yǎng),小白鼠傳5代,分離培養(yǎng),擴(kuò)大培養(yǎng),最后用無菌生理鹽水稀釋成150億個(gè)菌/ml。1.1.3乳酸環(huán)丙沙星注射液組環(huán)丙沙星,批號(hào)990312,中國浙江京新制藥廠產(chǎn)品,配成2.5%(W/V)乳酸環(huán)丙沙星注射劑(pH4.5～5.5)。按藥典要求過濾、分裝、滅菌、去熱原。1.1.4完全rpmi170培養(yǎng)基硝基藍(lán)四氮唑(NBT)(前進(jìn)試劑廠生產(chǎn));噻唑藍(lán)(MTT)(Fluka生產(chǎn));豬標(biāo)準(zhǔn)IgG(Sigma生產(chǎn));植物血凝素(PHA)(上海伊華臨床醫(yī)學(xué)科技公司生產(chǎn));RPMI1640(GIBCO生產(chǎn)),臨用前在RPMI1640培養(yǎng)液中,加入10%滅活小牛血清、50μmol/L2-巰基乙醇,20～25mmol/L的Hepes、100μg/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素,即為完全RPMI1640培養(yǎng)基;淋巴細(xì)胞分離液(上海試劑工廠生產(chǎn))。1.2方法1.2.1共感染試驗(yàn)組和陰性組每頭豬按每公斤體重4.5億個(gè)菌于腹部皮下接種,復(fù)制豬鏈球菌病亞急性模型?？瞻捉M和陽性組用無菌生理鹽水接種。1.2.2給藥傷口試驗(yàn)組和陽性組接種后第7天起豬由耳靜脈5mg/kgbw注藥,2次/d,連續(xù)8d;陰性組和空白組,推注無菌生理鹽水。1.2.3血清學(xué)檢測接種第0、7、14、21、28天,前腔靜脈無菌采2份血,其一用肝素抗凝,用于血細(xì)胞計(jì)數(shù)、分離淋巴細(xì)胞及嗜中性白細(xì)胞,另一份不抗凝,用于分離血清供IgG濃度和補(bǔ)體總活性的測定。1.2.4白細(xì)胞計(jì)數(shù)和分類計(jì)數(shù)顯微鏡計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)白細(xì)胞總數(shù),姬姆薩染色法作白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)按文獻(xiàn)進(jìn)行。1.2.5還原nbt的能力按文獻(xiàn)分離嗜中性白細(xì)胞,調(diào)整為每毫升3.5×107個(gè)細(xì)胞,按文獻(xiàn)檢測其還原NBT的能力,以還原產(chǎn)物溶于二甲亞砜后在540nm處的光密度OD540代表。1.2.6細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力測定按文獻(xiàn)分離淋巴細(xì)胞,用完全RPMI1640調(diào)整為每毫升3.5×106個(gè)細(xì)胞,按文獻(xiàn)在96孔培養(yǎng)板上,設(shè)PHA刺激孔和對(duì)照孔,進(jìn)行淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。以PHA刺激指數(shù)(SI)代表淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力。其中,SI=PHA刺激孔OD570nm均值/對(duì)照孔OD570nm均值。1.2.7dh反應(yīng)臨試第0、7、14、21、28天,按文獻(xiàn)進(jìn)行PHA皮膚試驗(yàn),以紅斑長、短徑均值代表DTH反應(yīng)。1.2.8血清中igg含量的測定按文獻(xiàn)進(jìn)行。1.2.9血清中補(bǔ)體總活性的測定按50%溶血試驗(yàn)計(jì)算出每毫升未稀釋的血清中所含的50%溶血?jiǎng)┝繑?shù)(CH50),即補(bǔ)體總活性。1.2.1感染兩因素交互效應(yīng)用SAS軟件檢測注射環(huán)丙沙星和鏈球菌感染兩因素交互效應(yīng)顯著性,用t檢驗(yàn)比較試驗(yàn)組、陰性組、陽性組與空白組之間的差異,及試驗(yàn)組與陰性組之間的差異。2結(jié)果與分析2.12.2對(duì)免疫組化的影響接種后第14、21天,陰性組嗜中性白細(xì)胞百分含量極顯著低于空白組(P<0.01);試驗(yàn)組接種后第21、28天,顯著低于空白組(P<0.05),且極顯著低于陰性組(P<0.01),第21天,兩因素交互作用顯著(P<0.05)。淋巴細(xì)胞百分含量則相反,陰性組接種后第14、21天極顯著高于空白組(P<0.01);試驗(yàn)組接種后第21天極顯著高于空白組(P<0.01),第28天顯著高于空白組(P<0.05),且均顯著高于陰性組(P<0.05);第21天兩因素交互作用顯著(P<0.05)。2.32.42.52.62.73開皮爾斯克氏體對(duì)抗體作用的影響成功復(fù)制出典型的豬鏈球菌病亞急性模型是本研究的前提。與文獻(xiàn)相比,本研究動(dòng)物感染后體溫升高的程度稍低,可能是菌株和動(dòng)物不同所致,其它如臨床癥狀、血液學(xué)變化、病理特征、病原檢查(結(jié)果未全顯示)與文獻(xiàn)一致。試驗(yàn)組和陰性組白細(xì)胞總數(shù)升高,與文獻(xiàn)一致。試驗(yàn)組接種后第21天,白細(xì)胞總數(shù)回落,第28天,藥物作用和兩因素交互作用才表現(xiàn)出來,且陽性組白細(xì)胞總數(shù)沒有變化,說明試驗(yàn)組白細(xì)胞變化主要是鏈球菌作用導(dǎo)致,環(huán)丙沙星本身對(duì)機(jī)體白細(xì)胞總數(shù)不影響,而是通過給藥后,機(jī)體本身損傷得以恢復(fù)后,使試驗(yàn)組白細(xì)胞數(shù)在第21、28天回落,與Jimenez-valera等報(bào)道的環(huán)丙沙星能降低外周血中白細(xì)胞數(shù)不一致,可能是試驗(yàn)對(duì)象和給藥途徑不同所致。試驗(yàn)組,因環(huán)丙沙星治療作用以及環(huán)丙沙星促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖使其于接種后第21天,淋巴細(xì)胞百分含量升高,嗜中性白細(xì)胞百分含量相對(duì)較低。鏈球菌感染和環(huán)丙沙星均使嗜中性白細(xì)胞吞噬功能增強(qiáng),即還原NBT能力增強(qiáng)。因細(xì)菌感染,嗜中性白細(xì)胞吞噬功能增強(qiáng),己糖旁路途徑糖代謝增強(qiáng),葡萄糖酵解中間產(chǎn)物6-磷酸葡萄糖在這個(gè)途徑氧化脫氫加強(qiáng),所脫的氫被細(xì)胞吞噬的NBT染料接受,從而還原NBT的能力增強(qiáng);環(huán)丙沙星加強(qiáng)己糖旁路途徑糖代謝已為文獻(xiàn)證實(shí)。感染后,鏈球菌產(chǎn)生某些毒力因子使淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力下降,但環(huán)丙沙星具有促進(jìn)淋巴細(xì)胞DNA復(fù)制的能力,因此,陽性組在第14、28天淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力增強(qiáng),試驗(yàn)組第28天在環(huán)丙沙星作用下,鏈球菌毒力因子的產(chǎn)生和作用降低,環(huán)丙沙星促進(jìn)淋巴細(xì)胞DNA復(fù)制的能力得以表現(xiàn),故淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化增強(qiáng)。陰性組于接種第21天,DTH降低,可能與鏈球菌膜蛋白和溶血素有關(guān),因這兩者均能抑制白細(xì)胞移行,而白細(xì)胞移行抑制試驗(yàn)是體外檢測DTH的試驗(yàn);陽性組接種后第14天,事實(shí)這一天還在用藥,在藥物刺激下,淋巴細(xì)胞增殖大大加強(qiáng),此時(shí)藥物促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖作用比抑制其生長更強(qiáng),所以DTH反應(yīng)比較強(qiáng),但因環(huán)丙沙星在促進(jìn)細(xì)胞DNA復(fù)制的同時(shí),還能導(dǎo)致細(xì)胞DNA鏈斷裂,且在低濃度時(shí),這種作用更為敏感,所以在第21、28天DTH反應(yīng)降低;在試驗(yàn)組,環(huán)丙沙星殺滅鏈球菌,阻止其釋放毒力因子的同時(shí),自身也喪失了生物活性,因此,淋巴細(xì)胞在受到藥物刺激后,增殖能力增強(qiáng),因體內(nèi)細(xì)菌及其毒力因子少,環(huán)丙沙星本身也不使其DNA斷裂,所以有活力的淋巴細(xì)胞數(shù)增多,DTH反應(yīng)增強(qiáng),即在第21天極顯著增高。鏈球菌侵襲機(jī)體,機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)抗體,最初主要是IgM,因此,陰性組和試驗(yàn)組接種后第7天,IgG含量低,但第2周時(shí)達(dá)到抗體高峰,此時(shí)為IgG,所以陰性組第14天IgG含量極顯著升高。陽性組于第14、21天,IgG水平低,試驗(yàn)組于第14天,IgG也很低,且低于陰性組,這與環(huán)丙沙星對(duì)IgG的合成具有抑制作用的報(bào)道一致。鏈球菌感染,體內(nèi)產(chǎn)生抗原抗體復(fù)合物,可固定補(bǔ)體,使陰性組和試驗(yàn)組接種后第7天,補(bǔ)體活性下降,當(dāng)然,也可能是鏈球菌莢膜抑制了補(bǔ)體激活途徑所致。陽性組接種后第14天,因環(huán)丙沙星作用血清中IgG水平較低,而補(bǔ)體活化需要IgG參與,因此此時(shí)陽性組補(bǔ)體活性極顯著降低;試驗(yàn)組IgG水平相對(duì)較高,補(bǔ)體活性與空白組無差異;第21天,雖然陽性組IgG仍然很低,但因環(huán)丙沙星使淋巴細(xì)胞DNA斷裂形成DNA片段,而雙鏈DNA片段是補(bǔ)體經(jīng)典途徑激活劑,故此時(shí)陽性組補(bǔ)體活性顯著升高;正因如此,試驗(yàn)組第28天顯著高于陰性組?？傊?環(huán)丙沙星在作用于病原的同時(shí),也增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞免疫功能和補(bǔ)體總活性,卻對(duì)IgG合成有抑制作用。從而進(jìn)一步揭示了鏈球菌、機(jī)體和環(huán)丙沙星三者之間的關(guān)系提供試驗(yàn)依據(jù),并為制訂環(huán)丙沙星的用藥方案提供參考。陰性組和試驗(yàn)組豬出現(xiàn)了典型亞急性鏈球菌病癥狀。接種后1d,體溫平均升高1℃,3d后,體溫升高一直維持在0.5℃左右,發(fā)病動(dòng)物精神萎糜,食欲不振,接種后第5天,大多數(shù)豬大便偏干,個(gè)別嚴(yán)重便秘或后期嚴(yán)重腹瀉,咳嗽,喘息,有膿性或漿液性分泌物,角膜潮紅,后期個(gè)別豬眼角有膿性分泌物,病豬關(guān)節(jié)腫脹、跛行,甚至站立不穩(wěn),后肢拖地。病原檢查為鏈球菌。試驗(yàn)組給藥后好轉(zhuǎn),陰性組于接種后第28天1頭豬死亡。陽性組和空白組臨床表現(xiàn)健康。接種后,陰性組白細(xì)胞總數(shù)于第7天顯著高于空白組(P<0.05),其后極顯著升高(P<0.01),試驗(yàn)組豬于接種后第7、14天,白細(xì)胞總數(shù)顯著高于空白組(P<0.01),第21天恢復(fù)正常(P>0.05),雖然第28天仍高于空白組(P<0.01),但顯著低于陰性組(P<0.05),此時(shí),給藥和感染兩因素的交互作用顯著(P<0.05)。陽性組的白細(xì)胞數(shù)與空白組無顯著差異(P>0.05)。感染和給藥兩因素均使嗜中性白細(xì)胞還原NBT的能力增強(qiáng)(表1),接種后第14、21、28天兩因素交互作用極顯著(P<0.01)。鏈球菌感染導(dǎo)致淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力降低,注射環(huán)丙沙星卻增強(qiáng)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化(表2),陽性組第21天PHA刺激的SI極顯著增加(P<0.01),試驗(yàn)組的SI第28天卻恢復(fù)正常(P>0.05),接種后第14天兩因素的交互作