脾胃濕熱證模型的建立

脾胃濕熱證模型的建立

采用科學(xué)合理的方法建立脾胃濕熱綜合征動(dòng)物模型是研究脾胃濕熱綜合征本質(zhì)的重要手段之一。目前關(guān)于濕熱證動(dòng)物模型的報(bào)道較多,但多限于濕阻證和溫病濕熱方面的研究,也有個(gè)別類似脾胃濕熱證動(dòng)物模型的報(bào)道,但大多由于理論依據(jù)不足,可重復(fù)性差,而未得到大家的公認(rèn)。本實(shí)驗(yàn)?zāi)M脾胃濕熱證的臨床致病因素,在借鑒以往濕熱證造模方法的基礎(chǔ)上,采用濕熱環(huán)境加高脂高糖飲食和白酒建立脾胃濕熱證動(dòng)物模型,并采用單因素與復(fù)合因素對(duì)比的方法探討該模型的發(fā)生機(jī)理,現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)材料1.1.1動(dòng)物SD雄性大鼠,體質(zhì)量(200±20)g,清潔級(jí)。由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,合格證號(hào):奧檢證字2003A010。1.1.2樣品與飲料的制備清熱化濕基本方:白蔻仁10g，川樸12g，黃芩12g，半夏12g,豬苓15g,郁金12g，臺(tái)烏10g,玄胡12g。中藥飲片購(gòu)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房。白蔻仁、川樸2藥后下,其他藥加10倍水浸泡1h后煎煮30min,藥渣加少量水后煎煮20min,將藥液與白蔻仁、川樸混合后再用文火煎煮5min,減壓濃縮至1kg/L水煎液,4℃冰箱保存?zhèn)溆谩＜t星二鍋頭酒(酒精度為55°),北京紅星股份有限公司產(chǎn)品;胃泌素(GAS)放免藥盒由解放軍總醫(yī)院科技開(kāi)發(fā)中心放免所提供;胃動(dòng)素(MTL)放免藥盒由北京北方生物技術(shù)研究所提供。1.1.3實(shí)驗(yàn)設(shè)備LRH-800-GS人工氣候箱為廣東省醫(yī)療器械廠產(chǎn)品;YC-DZOZ亞都超聲加濕器為北京亞都科技股份有限公司產(chǎn)品。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1各組不同證型的原因?qū)嵶C模型將50只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3d后,隨機(jī)分為5組:正常對(duì)照組、外因濕熱證模型組(外因濕熱證組)、內(nèi)因濕熱證模型組(內(nèi)因濕熱證組)、內(nèi)外因濕熱證模型組、內(nèi)外因濕熱證防治組,每組10只。1.2.2飼以高脂高糖飲食加白酒正常組普通喂養(yǎng)15d;外因濕熱證組前10d普通喂養(yǎng),后5d放入溫度為(32±2)^,相對(duì)濕度為95%的人工氣候箱;內(nèi)外因濕熱證模型組參考濕熱證造模文獻(xiàn)方法并加以改進(jìn),將大鼠飼以高脂高糖飲食,即在普通飼料喂養(yǎng)的基礎(chǔ)上,加用200g/L蜂蜜水自由飲用,且隔日按大鼠體質(zhì)量灌服油脂10g/kg,并與油脂隔日灌服10mL/kg白酒,共10d,然后放入溫度為(32±2)℃,相對(duì)濕度為95%的人工氣候箱中,共45d;內(nèi)因濕熱證組飼以高脂高糖飲食加白酒,其中油脂與白酒隔日交替,方法同內(nèi)外因濕熱證模型組,共15d;內(nèi)外因濕熱證防治組前10d與內(nèi)外因濕熱證模型組相同,后5d放入人工氣候箱中按10g/kg加服清熱化濕方。1.3樣品采集、樣品制備和指標(biāo)檢測(cè)1.3.1胃泌素gas、胃動(dòng)素mtl、胃動(dòng)素mtl實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,禁食12h,次日用乙醚輕度麻醉,摘取眼球取血后,頸椎脫臼處死,迅速剖腹,分離并沿大彎側(cè)剪開(kāi)鼠胃,取胃體、胃竇組織粘膜各約0.5cm×0.5cm,取空腸(近十二指腸處)、回腸(中段)、結(jié)腸(近乙狀結(jié)腸處)各約1.0cm長(zhǎng)腸組織,放入-80℃冰箱中保存,檢測(cè)胃腸粘膜胃泌素(GAS)、胃動(dòng)素(MTL)。1.3.2n-fmo-1活性體系的制備摘眼球取血4mL,其中2mL放入空塑料管中,離心,取血清密封后,置于-80℃冰箱保存;2mL放入含有100g/LEDTA二鈉(乙二胺四乙酸二鈉)30μL和抑肽酶30μL的塑料管中混勻,4℃離心,取血漿置于-80℃冰箱保存待測(cè)。胃腸組織未融化前,稱取組織塊0.2～0.4g,放于盛有1mL生理鹽水的試管中,然后在90℃水浴箱中水浴5min,冷卻后移入玻璃勻漿器中研磨,制成勻漿,傾回同一試管中,另取1mL生理鹽水沖洗研磨器,也并入同一試管中,4℃高速離心(3500r/min)10min,分離上清液,放入-80X℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?.3.3檢測(cè)方法及儀器血清胃泌素、血漿胃動(dòng)素及胃腸組織胃泌素、胃動(dòng)素檢測(cè)均采用放射免疫測(cè)定方法,檢測(cè)儀器為上海日環(huán)廠SN-695B型放免丫測(cè)量?jī)x。根據(jù)組織樣品濃度,計(jì)算每0.2g組織粘膜中各種胃腸激素的含量。1.4觀察指標(biāo)的確定根據(jù)脾胃濕熱證的臨床特點(diǎn)及動(dòng)物癥狀辨別的可行性,確定以大鼠外觀、精神狀態(tài)及食量、體重、肛溫、糞便性狀為觀察指標(biāo)。檢測(cè)大鼠血液及胃腸組織中胃泌素及胃動(dòng)素含量,以了解大鼠胃腸消化、吸收及運(yùn)動(dòng)功能。2結(jié)果與分析2.1不同模型大鼠前體及內(nèi)體的變化,大鼠幼血壓、干、軟、充外因濕熱證組前10d大鼠體質(zhì)量逐日增加,活動(dòng)正常,食欲良好,大便正常,后5d放入氣候箱中以后,食量及飲水量減少,體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢,煩躁不安,呼吸粗重,毛發(fā)疏松粗糙,陰囊松馳下垂,大便不成形或稀便,肛溫變化不明顯;內(nèi)因濕熱證組大鼠前期體質(zhì)量增長(zhǎng)較快,后期逐漸變緩,精神正常,納呆少飲,嗜睡懶動(dòng),大便或干或軟,肛溫波動(dòng)較大;內(nèi)外因濕熱證模型組大鼠前10d體質(zhì)量增加,糞便時(shí)干時(shí)軟,后5d放入氣候箱中以后,食量減少,體質(zhì)量減輕,精神萎靡,嗜臥懶動(dòng),毛發(fā)疏松粗糙,晦暗無(wú)光澤,大便時(shí)干時(shí)溏,肛溫稍有增加,與其他組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;內(nèi)外因濕熱證防治組大鼠在放入氣候箱中以后與模型組相比,食量增加,體質(zhì)量緩慢增長(zhǎng),精神似有所好轉(zhuǎn),大便稀溏減少,肛溫?zé)o變化。2.2中藥對(duì)gas水平的影響表1結(jié)果顯示,內(nèi)外濕熱因素不同程度地使大鼠血清GAS水平上升,清熱化濕中藥可使血清GAS水平呈一定程度的下降。外部濕熱環(huán)境可使大鼠血漿MTL水平上升,給予高糖高脂飲食后大鼠血漿MTL水平下降,同時(shí)施加兩種因素的模型組大鼠MTL水平下降明顯,而服用清熱化濕方可一定程度地促進(jìn)MTL分泌。2.3對(duì)結(jié)腸gas表達(dá)的影響表2結(jié)果顯示,外部濕熱環(huán)境和內(nèi)部濕熱飲食對(duì)胃腸組織各部分GAS水平的影響與正常組相比差異無(wú)顯著性,而內(nèi)外因濕熱證模型組大鼠綜合施加兩種因素后,結(jié)腸組織GAS水平下降,應(yīng)用清熱化濕方可以良性調(diào)節(jié)胃腸組織GAS水平,其中對(duì)結(jié)腸的調(diào)節(jié)效果最好,與內(nèi)外因濕熱證模型組相比具有顯著性意義(P<0.05)。2.4對(duì)大鼠腸組織mtl表達(dá)的影響表3結(jié)果顯示,外部濕熱環(huán)境對(duì)大鼠的胃腸組織MTL水平影響較大,內(nèi)部濕熱飲食對(duì)大鼠胃腸組織MTL水平的影響與外部濕熱環(huán)境一致,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,很可能是胃腸運(yùn)動(dòng)的紊亂所致。內(nèi)外因濕熱證模型組大鼠胃組織MTL水平變化不大,腸組織MTL水平呈上升的趨勢(shì)(與正常組相比P<0.01)。應(yīng)用清熱化濕中藥可降低結(jié)腸組織MTL水平(P<0.05)。3對(duì)傳統(tǒng)的對(duì)證模型的表達(dá)脾胃濕熱證屬于濕熱證的一個(gè)特殊類型,在動(dòng)物模型研制思路方面可以互相借鑒。采用“氣候因素+肥甘飲食+生物因子”的濕熱證造模方法是一個(gè)較成熟的造模方案,但該造模方法有些方面還有待進(jìn)一步完善和提高。如在施加因素上應(yīng)盡可能地模擬中醫(yī)傳統(tǒng)病因,病理改變上盡可能地體現(xiàn)脾胃功能的失調(diào)等;在模型制作過(guò)程中,應(yīng)合理地控制施加因素的作用時(shí)間和作用強(qiáng)度,如過(guò)強(qiáng)雖有表現(xiàn)但并不一定是病因相關(guān)之癥,過(guò)弱則或無(wú)表現(xiàn),或撤除施加因素后自然恢復(fù)過(guò)快;在癥狀上要制定符合動(dòng)物特征的統(tǒng)一的脾胃濕熱證診斷標(biāo)準(zhǔn),且應(yīng)有別于脾虛證和其他濕熱證動(dòng)物模型;在客觀指標(biāo)的確立上應(yīng)根據(jù)中醫(yī)理論選擇與脾胃濕熱相關(guān)性更高、特異性更強(qiáng)的實(shí)驗(yàn)指標(biāo),在反證藥物的選擇上要力求標(biāo)準(zhǔn)化,根據(jù)藥證相關(guān)理論,篩選出最能體現(xiàn)脾胃濕熱的中藥或組方。本研究借鑒其他濕熱模型的造模方法,立足于脾胃濕熱證的病因與發(fā)病學(xué),制定出濕熱環(huán)境+高脂高糖飲食+白酒的造模方法。3.1關(guān)于脾胃濕熱綜合征的模型研究3.1.1外濕或溫濕度外部濕熱可以造成脾胃功能的失調(diào),脾為濕臟,喜燥惡濕,胃為燥腑,喜濕惡燥,決定了脾胃對(duì)濕熱之邪的易感性。張六通等模擬自然發(fā)病環(huán)境,通過(guò)控制氣候箱的溫度及濕度研究外濕致病機(jī)理,結(jié)果濕熱組出現(xiàn)納呆少飲,消瘦,大便不成形或稀便,胃腸粘膜糜爛,小腸絨毛上皮變性、壞死、脫落以及炎細(xì)胞浸潤(rùn)等消化系統(tǒng)癥狀。所以通過(guò)人工氣候箱模擬濕熱環(huán)境是脾胃濕熱證動(dòng)物模型的一個(gè)關(guān)鍵因素,參考有關(guān)外濕或濕熱動(dòng)物模型的文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo),其中關(guān)于溫度和濕度的設(shè)定不盡相同。我們通過(guò)設(shè)定不同溫度和濕度對(duì)大鼠死亡率、外觀表現(xiàn)及胃腸組織病理變化觀察,認(rèn)為將人工氣候箱溫度控制在(32±2)℃,相對(duì)濕度為95%比較符合脾胃濕熱證動(dòng)物模型的要求。3.1.2飲食中內(nèi)蘊(yùn)發(fā)熱《素問(wèn)·奇病論》說(shuō):“肥者令人內(nèi)熱”,脾胃濕熱病人多屬膏粱之體,飲食停聚居多,膏粱厚味的食物容易內(nèi)蘊(yùn)發(fā)熱。《脾胃論》云:“飲食失節(jié),甘肥過(guò)度,脾胃乃傷”,而脾胃虛弱是濕熱發(fā)病的前提條件。對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠給予高脂高糖飲食,一方面可以使大鼠在短期內(nèi)體質(zhì)量增加,另一方面長(zhǎng)時(shí)間給予高脂高糖飲食,可造成大鼠脾胃功能損傷,為脾胃濕熱的形成提供了前提條件。3.1.3酒與現(xiàn)實(shí)關(guān)聯(lián),酒以和酒為中心的熱價(jià)研究中醫(yī)認(rèn)為,酒味辛甘,其性溫?zé)?具有通血脈、祛寒氣、行藥勢(shì)之功。過(guò)量及長(zhǎng)期飲酒對(duì)人體的損傷很大,《證治準(zhǔn)繩》云“夫酒者,氣味俱能生濕熱”?！督饏T翼》記載“有飲食之濕,酒水乳酪之類也”。臨床研究表明,嗜煙酒者與濕熱證關(guān)系密切。古代文獻(xiàn)關(guān)于酒與濕熱發(fā)病的記載和現(xiàn)代醫(yī)家關(guān)于濕熱證發(fā)病的流行病學(xué)調(diào)查表明,酒與脾胃濕熱證的發(fā)病關(guān)系密切。在脾胃濕熱證動(dòng)物模型中,將白酒作為濕熱邪氣,既符合脾胃濕熱證臨床發(fā)病規(guī)律,也與脾胃濕熱證中脾胃功能失調(diào)表現(xiàn)突出而外感發(fā)熱的證候較輕的特點(diǎn)相一致。3.1.4對(duì)臨床表現(xiàn)的表現(xiàn)脾胃濕熱證的臨床表現(xiàn)較為復(fù)雜,廣州中醫(yī)藥大學(xué)脾胃研究所制定了自己的標(biāo)準(zhǔn),其主癥為:(1)舌苔黃膩;(2)胸悶;(3)胃脘痞滿或脹;(4)食欲不振。次癥為:(1)口苦而粘;(2)口渴少飲或喜熱飲;(3)大便溏,或有粘液;(4)惡心;(5)身困乏力;(6)脈濡緩。因其中大部分為主觀癥狀,無(wú)法轉(zhuǎn)換為可供觀察的體征,動(dòng)物模型丟失了許多信息。作為證的重要體征——舌象和脈象也很難觀察,不得不加以割舍。這樣一來(lái),在脾胃濕熱證動(dòng)物模型中表現(xiàn)出來(lái)的可供利用的癥狀和體征實(shí)在太少。我們根據(jù)脾胃濕熱證的診斷標(biāo)準(zhǔn)和臨床特征性變化,選擇以大鼠食量、肛溫、體質(zhì)量及外觀表現(xiàn)作為觀察指標(biāo),并嘗試選擇了胃腸激素(胃泌素、胃動(dòng)素)來(lái)體現(xiàn)脾胃濕熱證胃腸功能紊亂導(dǎo)致胃脘痞滿、腹脹、惡心等一些主觀癥狀。3.2對(duì)脾胃濕熱綜合征的動(dòng)物模型的評(píng)價(jià)3.2.1體質(zhì)量變化的觀察本研究在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,實(shí)驗(yàn)大鼠的食量逐漸下降,放入氣候箱中以后食量下降更為明顯,為了動(dòng)態(tài)觀察其體質(zhì)量變化,將5d作為1個(gè)時(shí)段,其體質(zhì)量在實(shí)驗(yàn)前2個(gè)時(shí)段增加,第3時(shí)段下降,符合肥胖之人易發(fā)生脾胃濕熱證的發(fā)病規(guī)律,模擬了臨床實(shí)際中脾胃濕熱證患者嗜食肥甘,形體肥胖的發(fā)病條件。外觀表現(xiàn)為造模后期體質(zhì)量下降,精神萎靡,嗜臥懶動(dòng),毛發(fā)疏松粗糙,晦暗無(wú)光澤,大便時(shí)干時(shí)溏。3.2.2不同模型組胃腸激素水平上升和下降的趨勢(shì)血清及胃竇部組織GAS水平上升,各段腸組織GAS水平有下降的趨勢(shì)。血漿MTL下降,而各段腸組織MTL水平有上升的趨勢(shì)。與外因濕熱證組和內(nèi)因濕熱證組相比,內(nèi)外因濕熱證模型組胃腸激素水平上升與下降趨勢(shì)不盡相同甚至相反,并不是兩種因素造成結(jié)果的簡(jiǎn)單疊加或相互抵消。胃泌素及胃動(dòng)素水平的升高或降低,在一定程度上反映了胃腸消化、吸收、排泄功能障礙和蠕動(dòng)節(jié)律的紊亂,與臨床脾胃濕熱證患者多表現(xiàn)為胃脘部痞滿或脹痛,泛酸、納呆等胃腸癥狀相一致。3.2.3治瀉熱證的制備清熱化濕基本方是勞紹賢教授在長(zhǎng)期臨床診療過(guò)程中總結(jié)出的治療脾胃濕熱證的經(jīng)驗(yàn)方。清熱化濕方藥物組成為白蔻仁、黃芩、厚樸、半夏、豬苓、郁金、烏藥等。勞教授認(rèn)為,脾胃濕熱證系脾失健運(yùn),濕濁內(nèi)生,蘊(yùn)而化熱而成,其治療宜用芳香化濕之品以通達(dá)氣機(jī),清熱化濕中宜重祛濕。清熱化濕方由多種清熱化濕中藥組成,應(yīng)用于臨床脾胃濕熱證患者取得了良好的效果