高脂飼料喂養(yǎng)時間及sz劑量對2型糖尿病大鼠模型的影響

高脂飼料喂養(yǎng)時間及sz劑量對2型糖尿病大鼠模型的影響

糖尿病是一種嚴(yán)重的慢性代謝性疾病，由胰島素排出少或絕對不足引起。其主要臨床表現(xiàn)為喝得多、吃得多、尿和體重減少，同時伴有血糖和高尿糖1'。過去幾年中國糖尿人群數(shù)量迅速增加,2010年已經(jīng)達(dá)到9240萬例,其中男性5020萬例,女性4220萬例［2］。目前對糖尿病的研究雖然很多,但仍不清楚糖尿病發(fā)病的具體機(jī)制及人體病理生理變化,因此,建立一種穩(wěn)定的糖尿病動物模型對研究人類糖尿病病情發(fā)展、臨床轉(zhuǎn)歸及發(fā)病機(jī)制具有重要意義。目前,用于科研的糖尿病動物模型包括自發(fā)性、轉(zhuǎn)基因型及自行建立的動物模型。前兩種模型往往僅考慮了遺傳因素而忽視飲食、肥胖及環(huán)境等因素,并且來源有限和價格昂貴等特點(diǎn)限制了應(yīng)用范圍,尤其是較大規(guī)模的動物實(shí)驗［3］。自行建立糖尿病動物模型主要借助于化學(xué)藥物,如鏈脲佐菌素(streptozo-tocin,STZ)和四氧嘧啶對胰島造成不同程度破壞,使胰島素分泌相對或絕對不足而建立糖尿病動物模型。大劑量化學(xué)藥物主要用于建立1型糖尿病模型,而在高脂飼料(highfatdiet,HFD)喂養(yǎng)的基礎(chǔ)上輔以小劑量化學(xué)藥物是建立2型糖尿病動物模型的主要方法［4］。目前制備2型糖尿病動物模型的研究所用的HFD配方、喂養(yǎng)時間、STZ注射方法和劑量并不一致,使得造模方法難以成功復(fù)制。本研究通過小梯度STZ劑量合并HFD不同喂養(yǎng)時間建立2型糖尿病大鼠模型,并進(jìn)一步評價模型大鼠血糖穩(wěn)定性及相關(guān)指標(biāo)變化。高脂養(yǎng)血糖的制備方法模41.試劑和儀器:STZ購自Sigma公司,滅菌級別?？偰懝檀荚噭┖?德國羅氏診斷有限公司)、甘油三酯試劑盒(德國羅氏診斷有限公司)、胰島素放免試劑盒(瑞典Mercodia公司)。血液生化指標(biāo)檢測采用Hitachi7600-120自動分析儀(日本日立公司)。FA2004N電子天平(上海精密儀器有限公司)、雅培安妥血糖儀及其配套試紙(美國雅培公司)。2.實(shí)驗動物:清潔級5周齡雄性SD大鼠60只,體重175~200g,購自上海西普爾-必凱實(shí)驗動物公司,生產(chǎn)許可證號:SCXK(滬)2006-0010;使用許可證號:SXK(滬)2006-0010。3.大鼠分組及飼養(yǎng):大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,稱重并按數(shù)字表法隨機(jī)分為6組(10只/組),正常對照組(NC組);模型1組(M1組)高脂喂養(yǎng)4周+STZ35mg/(kg·bw)腹腔注射;模型2組(M2組)高脂喂養(yǎng)4周+STZ38mg/(kg·bw)腹腔注射;模型3組(M3組)高脂喂養(yǎng)8周+STZ25mg/(kg·bw)腹腔注射;模型4組(M4組)高脂喂養(yǎng)8周+STZ30mg/(kg·bw)腹腔注射;模型5組(M5組)高脂喂養(yǎng)10周+STZ25mg/(kg·bw)腹腔注射。正常對照組普通飼料喂養(yǎng),模型組40%HFD喂養(yǎng)。每100gHFD中含蛋白質(zhì)22.3g(20%總熱量)、脂肪19.8g(40%總熱量)、碳水化合物44.6g(40%總熱量)、其他3.3g。所有動物自由進(jìn)食和飲水,實(shí)驗期間每日記錄進(jìn)食量,每周記錄體重,實(shí)驗室12h晝夜循環(huán)、溫度25±2℃,相對濕度50%~70%。4.STZ配置及注射方法:2.1g檸檬酸和2.94g檸檬酸鈉分別溶解于100ml雙蒸水中,按照比例混合,將pH值調(diào)為4.2~4.5即配制STZ的檸檬酸溶解液。過濾溶解液后將STZ配成1%濃度的溶液,注射前將STZ保存在冰盒中。大鼠禁食12h后,10ml/(kg·bw)的腹腔內(nèi)注射劑量,正常對照組根據(jù)空腹體重腹腔注射溶劑,模型組根據(jù)空腹體重腹腔內(nèi)注射相應(yīng)劑量STZ溶液,STZ溶液配成后需在30min內(nèi)注射完畢。采用Srinivasan等［5］將一次性注射STZ3天后空腹血糖≥11.1mmol/L作為成模標(biāo)準(zhǔn)。5.血糖及生化指標(biāo)檢測:每周測量1次血糖,禁食12h后,使用雅培安妥血糖儀尾靜脈取血檢測空腹血糖(fastingbloodsugar,FBG)水平。實(shí)驗結(jié)束時,內(nèi)眥靜脈采空腹血,4℃離心分離血清(3500r/min,10min),測量血清TC及TG水平,放免法檢測空腹胰島素(fastinginsulin,FINS)水平。6.口服糖耐量實(shí)驗:造模后第1周所有動物禁食12h后,20%葡萄糖2g/(kg·bw)腹腔注射,尾靜脈取血測量0min及糖負(fù)荷后30、60、120min血糖水平。按照公式:AUC=(0min血糖值+30min血糖值)×0.5/2+(30min血糖值+60min血糖值)×0.5/2+(60min血糖值+120min血糖值)×1/2,計算葡萄糖曲線下面積。7.統(tǒng)計學(xué)方法:使用SPSS21.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ue0af±s)表示。組間比較采用One-wayANO-VA統(tǒng)計分析,兩兩比較使用SNK或LSD-t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。1.造模前后大鼠進(jìn)食及體重結(jié)果:適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后大鼠體重和進(jìn)食量之間無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。HFD喂養(yǎng)的模型組大鼠體重增長明顯快于普通飼料喂養(yǎng)的CN組,HFD喂養(yǎng)4周后M1和M2組體重顯著高于NC組(P<0.01)。隨著喂養(yǎng)時間的增加,大鼠體重增幅逐漸降低。注射STZ后模型組進(jìn)食量增加,造模后第3周M2組進(jìn)食量顯著高于NC組(P<0.05),但模型組體重卻出現(xiàn)負(fù)增長,體重下降速度隨著STZ注射劑量增加而增加,詳見表1。2.成模率及動物死亡率情況:以一次性注射STZ72h后FBG≥11.1mmol/L作為判斷2型糖尿病大鼠模型的成模標(biāo)準(zhǔn),并同時觀察大鼠是否出現(xiàn)多飲多食、尿量增多、生長遲緩、身體消瘦等糖尿病癥狀。M2組成模率高達(dá)80%,但死亡率同樣高達(dá)50%。M4組成模率較高,死亡率卻較低,分別為80%和30%。M1組成模率和死亡率分別為70%和20%。M3及M5組成模率和死亡率均較低,分別為44.4%、66.7%及11.1%、22.2%,詳見表2。3.造模后大鼠FBG穩(wěn)定性比較結(jié)果:模型組大鼠FBG整體呈先升高后下降趨勢,STZ注射3天后模型組FBG明顯升高,于造模后第7天達(dá)到峰值,隨后3周FBG出現(xiàn)逐漸降低并趨于穩(wěn)定的趨勢。隨著高脂喂養(yǎng)時間和STZ劑量的增加血糖呈上升趨勢,表現(xiàn)為模型組間FBG的差異。M2組在造模后第3周血糖才達(dá)到相對穩(wěn)定狀態(tài),即STZ注射劑量越大,血糖達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)需要的時間就越長。造模后第3、7、14及21天模型組FBG顯著高于CN組(P<0.01),M2顯著高于M3(P<0.05)。造模后第21天M1組FBG顯著高于M3組(P<0.05),詳見表3。4.造模后第3周各組胰島素和血脂結(jié)果:STZ注射后第3周模型組FINS、TC及TG水平顯著高于NC組(P<0.01)。隨著STZ劑量增加FINS水平呈增加趨勢,表現(xiàn)為M2組FINS顯著高于M3、M4、M5組(P<0.05)。隨HFD喂養(yǎng)時間增加TC和TG水平同樣呈增加趨勢,表現(xiàn)為M5組TG水平顯著高于M1和M2組(P<0.05),M5組TC水平顯著高于M1和M3組(P<0.05),詳見表4。5.OGTT及AUC結(jié)果:造模后第1周OGTT檢測中模型組在0、30、60及120min血糖水平均顯著高于NC組(P<0.01),STZ注射劑量較高模型組糖耐量顯著低于低STZ劑量模型組,表現(xiàn)為M2組0min及120min血糖顯著高于M3組(P<0.05)。2型糖尿病動物模型普遍存在血糖峰值延遲現(xiàn)象,峰值出現(xiàn)在糖負(fù)荷后60min點(diǎn)。根據(jù)AUC公式計算血糖曲線下面積結(jié)果與OGTT相似。見表5。型糖尿病大鼠造模方法的選擇高脂、高熱量飲食是誘發(fā)胰島素抵抗的主要危險因素,胰島素抵抗(insulinresistance,IR)指機(jī)體對胰島素敏感度降低,使得肌肉、脂肪等重要外周組織對葡萄糖利用率降低。IR早期胰島β細(xì)胞能夠代償性分泌高水平的胰島素以維持血糖的穩(wěn)定性,當(dāng)胰島β細(xì)胞功能受損而不足以發(fā)揮代償作用時,就會導(dǎo)致糖耐量降低和2型糖尿病的發(fā)生［6］。制備實(shí)驗性動物模型對2型糖尿病發(fā)病機(jī)制和轉(zhuǎn)歸的研究具有重要意義,使用高脂飲食能夠誘導(dǎo)胰島素抵抗,在此基礎(chǔ)之上,一次性注射小劑量STZ對胰島功能造成損傷,導(dǎo)致胰島素分泌量不足以維持正常血糖水平而制備2型糖尿病動物模型［7，8］。目前制備2型糖尿病動物模型的研究對HFD喂養(yǎng)時間以及STZ使用劑量并無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。既往研究發(fā)現(xiàn)［9～11］,隨著高脂喂養(yǎng)時間延長,動物肥胖和胰島素抵抗更加明顯,胰島的負(fù)荷就越重,制備2型糖尿病動物模型所要使用STZ劑量就越少。因此,本研究擬通過探索HFD不同飼養(yǎng)時間和STZ劑量對制備2型糖尿病大鼠模型成功率和血糖穩(wěn)定性的影響,以尋求一種更加有效的造模方法。本研究結(jié)果顯示,HFD飼養(yǎng)的模型組體重增長明顯比CN組快,而且均出現(xiàn)高脂血癥,表現(xiàn)為血TG和TC顯著升高。STZ注射后模型組均出現(xiàn)不同程度的高血糖、高胰島素、高血脂、多飲多食、體重減輕及糖耐量受損等典型的2型糖尿病特征。造模后第3天模型組FBG顯著高于CN組(P<0.01),模型組之間血糖水平、成模率和死亡率差別較大。HFD飼養(yǎng)4周的M1和M2組均能成功制備2型糖尿病大鼠模型,且成模率較高,FBG平均水平高于其他模型組,由于選用的STZ劑量較高,對動物造成打擊和傷害較大,大鼠出現(xiàn)不耐受死亡現(xiàn)象較明顯,尤其是在造模后第1周,類似現(xiàn)象其他相關(guān)研究也有報道［12，13］。造模后第1周大鼠進(jìn)食量明顯減少,觀察發(fā)現(xiàn)死亡動物中出現(xiàn)低血糖的比例高于高血糖,分析死亡原因可能為STZ對動物造成的傷害較大,嚴(yán)重影響正常進(jìn)食和飲水,最終出現(xiàn)低血糖和酮癥酸中毒而死亡。HFD喂養(yǎng)8周聯(lián)合小劑量STZ造模方案的M3和M4組同樣可以制備2型糖尿病大鼠模型,但平均FBG和成模率低于M2組,尤其是M3組成模率只有44.4%,但其死亡率均低于前者。M4組成模率高達(dá)80%且死亡率較低,是一種值得推薦的造模方法。觀察未成模大鼠出現(xiàn)不同程度的糖耐量受損特征,如進(jìn)食量增多、飲水增多、尿量增多、生長遲緩、身體消瘦、大便稀軟、臀部毛色枯等癥狀,與吳晏等［14］報道的結(jié)果相似,動物之間個體差異可能是不成模的主要原因。HFD喂養(yǎng)10周后注射25mg/(kg·bw)STZ成模率雖然高于M3組,但由于高脂喂養(yǎng)時間長,從對造模后續(xù)相關(guān)研究及經(jīng)濟(jì)學(xué)角度評價,有其不可取之處。造模后第3天模型組FBG顯著升高,1周后達(dá)峰,2周后血糖基本穩(wěn)定。STZ對胰島的破壞主要在注射后72h內(nèi),這也是相關(guān)研究［5］選擇造模后第3天FBG判斷造模是否成功的原因。造模后1周FBG才達(dá)到峰值水平可能與STZ通過誘導(dǎo)慢性炎癥、自身免疫等繼續(xù)攻擊破壞β細(xì)胞有關(guān)［15，16］。隨后血糖水平逐漸降低的機(jī)制可能為早期β細(xì)胞遭受STZ破壞后出現(xiàn)代償性迅速增生修復(fù),恢復(fù)部分胰島功能,這也可能是本研究中部分動物血糖出現(xiàn)“自我恢復(fù)現(xiàn)象”的原因。本