豬鏈球菌2型的流行特點及其流行規(guī)律

豬鏈球菌2型的流行特點及其流行規(guī)律

豬鏈霉菌2型可導(dǎo)致豬急性呼吸困難、腦膜炎、炎炎癥體和急性死亡，也可引起豬及其員工感染和死亡。這是一種重要的人類疾病。該病已成為嚴(yán)重影響各國養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的一種重要疫病,尤其在高密度的養(yǎng)豬場危害更大,同時在公共衛(wèi)生上亦顯得十分重要。近年來,隨著我國養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展,豬鏈球菌病在許多地區(qū)呈現(xiàn)上升的趨勢,在局部地區(qū)甚至造成較大規(guī)模的流行。1998~1999年連續(xù)兩年的夏季在江蘇省南通地區(qū),豬群大面積暴發(fā)流行2型豬鏈球菌病,豬群的發(fā)病率和死亡率均在50%左右,并導(dǎo)致特定人群感染致死。Vecht等在比較不同的豬鏈球菌2型菌株的蛋白圖譜時發(fā)現(xiàn),從病豬體內(nèi)分離的菌株有兩種蛋白組份在大多數(shù)從健康豬體內(nèi)分離的菌株是沒有的。分別為溶菌酶釋放蛋白(MRP)和細(xì)胞外蛋白因子(EF)。用不同的表現(xiàn)型菌株感染小豬時發(fā)現(xiàn),2.江蘇省獸醫(yī)總站3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院mrp+epf+的表現(xiàn)型菌株可以引起典型的腦炎、多發(fā)性漿液炎及多發(fā)性關(guān)節(jié)炎,而mrp-epf-的表現(xiàn)型菌株對豬沒有致病力。因此認(rèn)為MRP和EF是豬鏈球菌的兩種重要的毒力因子,并可作為判定菌株毒力的指標(biāo)。1998年和1999年從江蘇省南通地區(qū)暴發(fā)流行2型豬鏈球菌病的病豬體內(nèi)分離的豬鏈球菌2型菌株的檢測結(jié)果亦證實了這一點。為了了解豬鏈球菌2型高發(fā)地區(qū)(疫區(qū))與少發(fā)地區(qū)(非疫區(qū))豬群的帶菌率及其毒力因子mrp與epf的分布情況,本文分別從不同地區(qū)(疫區(qū)與非疫區(qū))采集正常屠宰豬或活體采集成年豬扁桃體,經(jīng)接種馬丁湯培養(yǎng)基增菌培養(yǎng)后,用PCR方法進(jìn)行豬鏈球菌2型菌株的檢測,同時檢測了各2型菌株的主要毒力因子mrp與epf,以探討豬鏈球菌2型的發(fā)生與流行規(guī)律。1材料和方法1.1馬腺疫球獸疫種c群豬鏈球菌2型SS2-1株,分離自發(fā)病豬內(nèi)臟,毒力因子基因表現(xiàn)型為mrp+epf+。馬腺疫鏈球菌獸疫亞種(C群)標(biāo)準(zhǔn)株ATCC35246株,由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)微生物學(xué)教研室從美國菌種保藏中心購進(jìn)與保存。以上兩菌培養(yǎng)物所提取的DNA作為PCR檢測的陽陰性對照。1.2正常豬和桃子的收獲對來源明確的生豬在屠宰后,迅速采取其扁桃體或活體采集成年豬扁桃體,進(jìn)行增菌培養(yǎng)。1.3細(xì)菌培養(yǎng)扁桃體樣品或分離獲得的單個菌落,接種于含0.2%葡萄糖、1%小牛血清的馬丁肉湯中,37.5℃培養(yǎng)18~20h。1.4小鼠sds-ctab法根據(jù)文獻(xiàn)稍加改進(jìn),步驟如下:取1.5ml細(xì)菌培養(yǎng)物,10000r/min離心1min。沉淀用567μlTE緩沖液重懸,加入30μl10%SDS和3μl20mg/mL蛋白酶K,37℃水浴60min后,再加入100μl5MNaCl和80μlCTAB/NaCl溶液,65℃水浴10min。先用氯仿:異戊醇(24∶1)抽提一次,然后再用酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提一次,最后用等體積異丙醇沉淀核酸。沉淀用70%的乙醇洗兩次后,用20μl的雙蒸水溶解備用。1.5ph、cps2j基因?qū)?-gapt-35的影響按倪艷秀等的方法進(jìn)行。PCR引物為:上游引物(P1):5′-CAAACGCAAGGAATTACGGTATC-3′;下游引物(P2):5′-GAGTATCTAAAGAATGCCTATTG-3′。其中P1與豬鏈球菌2型的莢膜多糖抗原cps2J基因的第13791-13813位核苷酸相同,P2與cps2J基因的第14465-14443位核苷酸互補(bǔ)。擴(kuò)增的目的基因片段的預(yù)期長度為675bp。1.6p2p與epf基因的擴(kuò)增對經(jīng)檢測確定為豬鏈球菌2型的樣品,再用PCR方法檢測其毒力因子MRP與EF基因mrp與epf。PCR的兩對引物分別為:mrp的上游引物(P3):5′-ATCAGAATCACCACTTTTGG-3′,下游引物(P4):5′-TCATACCCAGTAAATACACG-3′;epf的上游引物(P5):5′-GCTACGACGGCCTCAGAAATC-3′,下游引物(P6):5′-TGGATCAACCACTGGTGTTAC-3′。其中P3與mrp基因的第467-486位核苷酸相同,P4與mrp基因的第1332-1351位核苷酸互補(bǔ),P5與epf的第2407-2427位核苷酸相同,P6與epf基因的第3032-3012。擴(kuò)增的目的基因片段長度分別為885bp(mrp)和626bp(epf)。2結(jié)果2.1豬鏈球菌2型的檢測結(jié)果先后采集了來自非疫區(qū)的正常屠宰豬47頭份扁桃體樣品,其中江蘇六合13頭份、江蘇眙盱10頭份、江蘇射陽4頭份、江蘇泰興10頭份(該豬群扁桃體為活體采集)及河南夏邑10頭份;從疫區(qū)(1998、1999年連續(xù)兩年暴發(fā)2型豬鏈球菌病)采集豬扁桃體樣品41頭份,其中江蘇如皋19份、江蘇如東22份。分別用分型PCR進(jìn)行2型菌的檢測鑒定,結(jié)果見表1。從表1中可以看出,正常豬群中豬鏈球菌2型的帶菌率除少數(shù)豬群(江蘇泰興)外,普遍較高,為10%~77%,平均為40.9%(36/88),其中來自非疫區(qū)的6個豬群的2型菌帶菌率從0%~77%,平均為42.6%;而來自疫區(qū)的2個豬群的2型菌帶菌率為31.6%和45.2%,平均為39.0%,疫區(qū)與非疫區(qū)之間差異不明顯。2.2mtp/epf型菌株的分離和鑒定對PCR鑒定為2型菌的36份樣品,進(jìn)行了毒力因子基因mrp與epf的檢測,結(jié)果見表2。表2中顯示,20株分離自非疫區(qū)豬群的2型菌株中,18株mrp和epf均為陰性,即表現(xiàn)型為mrp-epf-的菌株占90%,另有2株表現(xiàn)型分別為mrp+epf-和mrp-epf+。相反,分離自疫區(qū)的16株2型菌表現(xiàn)型均為mrp+epf+。3豬鏈球菌2型的感染力和毒力因子豬鏈球菌2型廣泛存在于豬的呼吸道中,豬活體扁桃體棉試子檢查檢出率多數(shù)在50%以上。但一般認(rèn)為,豬群是否會發(fā)生豬鏈球菌病與其帶菌率的高低并無直接的關(guān)系。究其原因可能與不同的2型菌株的致病力存在明顯差異有關(guān),而這種差異與各菌株的毒力因子是直接相關(guān)的。豬鏈球菌的毒力因子較為復(fù)雜,其中較為重要的有MRP和EF等。據(jù)對從荷蘭分離到的180株豬鏈球菌2型菌株的MRP與EF分析發(fā)現(xiàn),從病豬體內(nèi)分離的菌株有80%為mrp+epf+表現(xiàn)型,相反,從健康豬扁桃體中分離的菌株僅2%為該表現(xiàn)型,而有86%表現(xiàn)為mrp-epf-。在用不同的表現(xiàn)型菌株感染小豬時發(fā)現(xiàn),mrp+epf+的表現(xiàn)型菌株可以引起典型的腦炎、多發(fā)性漿液炎及多發(fā)性關(guān)節(jié)炎,而mrp-epf-的表現(xiàn)型菌株對豬則沒有致病力。本實驗中,正常豬群中豬鏈球菌2型的帶菌率除少數(shù)豬群外,普遍較高,為31.6%~77%,平均為40.9%,疫區(qū)與非疫區(qū)豬群的2型菌帶菌率差異不明顯。但毒力因子mrp和epf的陽性率疫區(qū)與非疫區(qū)存在明顯差異,來自非疫區(qū)的2型菌株除極少數(shù)表現(xiàn)為mrp+epf-或mrp-epf+外(各為5%),絕大多數(shù)都表現(xiàn)為對豬無毒力的mrp-epf-表現(xiàn)型(90%),無一株表現(xiàn)為mrp+epf+,相反來自疫區(qū)的所有2型菌株均為對豬有強(qiáng)毒力的mrp+epf+表現(xiàn)型。此結(jié)果提示雖然正常豬群中2型豬鏈球菌的帶菌率與豬群是否暴發(fā)流行該病并無直接關(guān)系,但重要的可能是mrp+epf+表現(xiàn)型菌株的出現(xiàn)比率,攜帶mrp+epf+表現(xiàn)型菌株的豬可能是本病的主要潛在傳染源,當(dāng)內(nèi)、外界條件成熟時(如氣候濕熱,長途運輸?shù)?,極有