靈芝多糖的生物保健功能及發(fā)酵條件優(yōu)化研究進(jìn)展

靈芝多糖的生物保健功能及發(fā)酵條件優(yōu)化研究進(jìn)展

靈山是多孔菌科的一種推子菌。在古代，人們認(rèn)為它對(duì)正氣和補(bǔ)充營養(yǎng)具有良好的效果，并且對(duì)藥物具有高度贊揚(yáng)?，F(xiàn)代科學(xué)檢測(cè)表明,靈芝在免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)、通過增強(qiáng)宿主免疫調(diào)節(jié)功能達(dá)到抗腫瘤作用、抗病毒作用、通過提高氧化酶活性而清除體內(nèi)自由基達(dá)到抗衰老的作用、降血脂等方面有著極其重要的醫(yī)學(xué)作用。隨著近年來對(duì)靈芝研究的不斷深入,發(fā)現(xiàn)靈芝多糖是靈芝的主要活性物質(zhì)之一,其重要性不言而喻。本文綜述了近年來國內(nèi)外對(duì)靈芝多糖的主要研究進(jìn)展。1結(jié)構(gòu)分析：靈堿多孔1.1不同種類多糖糖化學(xué)成分中單糖組成和比例如同其他的生物活性大分子,靈芝多糖的生物活性依賴于化學(xué)結(jié)構(gòu),因此,要研究靈芝多糖生物活性的機(jī)理,不可避免的要研究其化學(xué)結(jié)構(gòu)。對(duì)靈芝多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)的研究,主要集中于其單糖的組成、多糖分子量范圍、單糖連接方式等方面。近年來,隨著研究的不斷深入,對(duì)靈芝多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)已經(jīng)有了一定的了解。雖然靈芝多糖化學(xué)結(jié)構(gòu)由于靈芝種類的不同而有所差異,但其化學(xué)結(jié)構(gòu)的某些方面是固定不變的。如,其單糖組成普遍D-葡萄糖、D-果糖糖、D-半乳糖、D-甘露糖、D-木糖、L-巖藻糖、L-鼠李糖、L-阿拉伯糖,差異主要體現(xiàn)在組成的種類和比例的不同。羅立新等通過研究確定,在靈芝的菌絲體和子實(shí)體中得到的多糖,其單糖的組成不同,而且單糖的組成比例也不同。菌絲體多糖單糖是D-2葡萄糖、D-2半乳糖、D-2甘露糖、D-2木糖、L-2巖藻糖、L-2鼠李糖,而子實(shí)體多糖卻是由D-2葡萄糖、D-2半乳糖、D-2甘露糖、D-2木糖、L-2阿拉伯糖、L-2鼠李糖組成。而在Ye等的研究中,一種水溶性多糖的單糖組成僅由D-葡萄糖、D-半乳糖和L-果糖組成。單糖之間的連接方式,主鏈以β-(1→3)、β-(1→4)糖苷鍵連接,支鏈以β-(1→6)糖苷鍵連接。多糖分子量隨著多糖種類的不同,有很大差異,但一般都以104D為數(shù)量級(jí)。1.2試驗(yàn)方法包括測(cè)定山羊糖化學(xué)結(jié)構(gòu)1.2.1不同分子量的分離對(duì)于靈芝多糖的分子量測(cè)量,一般采用凝膠過濾層析的方式測(cè)定。在實(shí)驗(yàn)前,先將已知分子量的物質(zhì)通過凝膠層析柱,根據(jù)分子量大小的不同,通過凝膠的時(shí)間有所不同,可以得到一個(gè)關(guān)于分子量大小線性方程。通過收集到的靈芝多糖通過層析柱的時(shí)間或洗脫體積不同,可以得到準(zhǔn)確的分子量大小。在Ye等利用HPLC的方法,利用Dextrans標(biāo)準(zhǔn)品T-5、T-12、T-25、T-50、T-80、T-150和T-270做出線性方程,得出分離到的多糖分子量為1.2×104D。Li等利用HPSEC的方法,同樣用Dextrans標(biāo)準(zhǔn)品做出線性方程,最終測(cè)得分離到得靈芝多糖分子量。1.2.2衍生化和蒸發(fā)光散色儀目前應(yīng)用于多糖的單糖組成研究分析方法主要有薄層色譜法、高效液相色譜法及衍生化氣相色譜法等方法,其中衍生化氣相色譜法是目前多糖分析中最常用的手段。無論哪種方法,都要先將多糖水解,水解的方法主要有稀硫酸水解和三氟乙酸水解。在上述研究方法中,薄層色譜法操作簡單,但是對(duì)于含量較少的單糖作用不明顯,可用于初步檢測(cè);HPLC法的使用受到單糖在紫外光吸收較弱的缺點(diǎn)的影響,需要先經(jīng)過衍生化或使用蒸發(fā)光散色檢測(cè)器,因此其應(yīng)用范圍有限;多糖的組成分析多采用氣相色譜法,由于單糖的揮發(fā)性很低,所以在應(yīng)用氣相色譜法對(duì)多糖的單糖組成進(jìn)行分析時(shí),必須首先要進(jìn)行衍生化處理以增加其揮發(fā)性,常用的衍生化處理方法有硅烷化法和乙?；āe等的研究中,采用乙酰衍生化的方法,先將多糖用三氟乙酸水解后乙?；?利用高效離子交換層析,測(cè)得單糖的種類和數(shù)量。王賽貞等在研究中,將多糖經(jīng)三氟乙酸水解后,用1-苯基-3-甲基-5-吡啶啉酮(PMP)衍生化,在高效液相245nm紫外檢測(cè),首次發(fā)現(xiàn)了多糖活性成分中含有核糖。Guan等在研究中,水解多糖使用的是特異性酶,如阿拉伯糖酶、木糖酶等,然后將水解得到的單糖由PMP衍生化,在分別經(jīng)過HPLC和HPSEC,最終完成單糖的識(shí)別。1.2.3紫外糖苷鍵法靈芝多糖中,單糖之間以糖苷鍵形式連接,其對(duì)多糖分子的生物活性有著重要意義。目前常用的糖苷鍵分析方法主要有高碘酸氧化和Smith降解、甲基化、部分酸水解、紅外光譜,核磁共振等分析方法。高碘酸氧化是通過一系列的氧化還原作用,使最終的水解產(chǎn)物通過紫外檢測(cè),得出糖苷鍵的類型是l→4、1→6、1→2中的哪種。甲基化法先將多糖衍生化,在與氣相色譜、質(zhì)譜結(jié)合使用,可以準(zhǔn)確知道組成多糖的各單糖種類、比例和各單糖的連接位置。部分酸水解是將多糖分解為一個(gè)一個(gè)容易檢測(cè)的小片段,并且可以在特殊糖苷鍵處斷裂,從而推斷出多糖的大概結(jié)構(gòu)。在趙桂敏等的研究中,就綜合使用了這幾種方法來測(cè)定提取的多糖結(jié)構(gòu),最終確定了多糖SGL2Ⅱ22由葡萄糖和半乳糖組成,為少分支結(jié)構(gòu),由1→3連接和1→6連接的葡萄糖構(gòu)成主鏈,部分1→6連接葡萄糖在3位或4位有分支,側(cè)鏈為1→4連接的半乳糖,分支末端殘基為葡萄糖。2多香味睡眠功能2.1不同給藥劑量對(duì)嚴(yán)格降壓藥的影響隨著人們生活水平的提高,人口老齡化以及肥胖發(fā)生率的增加,糖尿病的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。糖尿病在中國的發(fā)病率達(dá)到2%,據(jù)統(tǒng)計(jì),中國已確診的糖尿病患者達(dá)4000萬,并且呈逐年上升趨勢(shì)。糖尿病在臨床上主要以高血糖為標(biāo)志,如何降低人們的血糖,預(yù)防人們患糖尿病成為關(guān)鍵。近年來隨著靈芝的保健作用得到重視,其中多糖作為主要的活性物質(zhì),其降低血糖的效果顯著。黃智璇等研究發(fā)現(xiàn),靈芝多糖對(duì)降低血糖有很好的效果。由四氧嘧啶致高血糖小鼠,在高劑量(400mg/kg)靈芝多糖條件下,小鼠血糖濃度為13.53mmol/L,而對(duì)照組小鼠血糖濃度為14.68mmol/L,血糖降低7.83%;由去甲腎上腺素致高血糖小鼠,高劑量(400mg/kg)靈芝多糖條件下,小鼠血糖濃度為6.9mmol/L,而對(duì)照組小鼠血糖濃度為8.71mmol/L,血糖降低20.8%。趙晶等除了研究了靈芝多糖對(duì)降血糖的作用外,還研究了不同劑量的靈芝多糖隨時(shí)間對(duì)降血糖的作用,發(fā)現(xiàn)在200mg/kg以下,血糖隨時(shí)間的變化很小,但高于200mg/kg后,降低血糖效果隨時(shí)間變化十分明顯。2.2對(duì)降血脂的作用高血脂癥,指血液中一種或幾種脂肪成分的增加,如膽固醇、脂蛋白、甘油三酯等,是造成動(dòng)脈硬化癥和心臟病發(fā)生的一個(gè)重要危險(xiǎn)因子。研究顯示,靈芝多糖對(duì)降血脂有很好的效果。吳鋒等在研究靈芝多糖對(duì)血脂的作用時(shí),發(fā)現(xiàn)使用靈芝多糖的小鼠的血脂中的膽固醇(TG)和甘油三酯(TC)都有明顯降低,而對(duì)于脂蛋白,其中高密度脂蛋白(HDL)沒有明顯的效果,而低密度脂蛋白(LDL)和脂蛋白(LPa)有非常明顯的降低。陳偉強(qiáng)等發(fā)現(xiàn),在大鼠血清中TG和TC的含量,隨靈芝多糖劑量的增加而降低,在靈芝多糖劑量在400mg/kg條件下,TC降低47%、TG降低46.87%。2.3不同的對(duì)mmp-9mrna表達(dá)的抑制作用實(shí)驗(yàn)表明,靈芝多糖可以在一定程度上抑制腫瘤的活性,但靈芝多糖對(duì)腫瘤細(xì)胞的抗癌構(gòu)效關(guān)系和抗癌機(jī)制仍不明了。曹琦珍等的研究表明,靈芝多糖對(duì)人肺癌PG細(xì)胞增殖無直接抑制作用,但是對(duì)PG細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性和黏附性有明顯的抑制,對(duì)金屬蛋白酶MMP-9,不但抑制其活性,并且對(duì)MMP-9mRNA的表達(dá)也有不同程度的抑制。同樣,在李穎博等的研究中,證實(shí)了靈芝多糖對(duì)人前列腺癌細(xì)胞(PC-3M)并沒有毒害作用,對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)的增殖也沒有作用,但是對(duì)這兩種細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性和黏附性有明顯的抑制。因此,有種對(duì)靈芝多糖的抗腫瘤機(jī)理的說法是,通過抑制腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和黏附特性達(dá)到的。林華型在總結(jié)了多人的結(jié)論后,認(rèn)為靈芝多糖并不能直接抑制或殺死腫瘤細(xì)胞,也不能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,其抑制腫瘤細(xì)胞的作用是通過通過介導(dǎo)加強(qiáng)宿主免疫功能而激活機(jī)體內(nèi)各種免疫應(yīng)答而實(shí)現(xiàn)的。而李建軍等的研究支持了林華型的結(jié)論,靈芝多糖會(huì)使在體腫瘤細(xì)胞DNA和RNA的比值下降,由此達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞的效果,但是離體腫瘤細(xì)胞卻沒有這種效果,因此說明靈芝多糖主要通過免疫介導(dǎo)對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用。2.4對(duì)免疫病理的調(diào)節(jié)作用人體免疫系統(tǒng),可以抵御外來細(xì)菌、病毒和其他有害物質(zhì)的侵襲,還能清除體內(nèi)衰老、突變、惡化或死亡的細(xì)胞。靈芝多糖主要是通過對(duì)淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)等免疫細(xì)胞的作用來調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能,其增強(qiáng)免疫應(yīng)答機(jī)制之一,就是通過對(duì)多種細(xì)胞因子進(jìn)行誘生或促誘生作用。作為生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑,它不僅能夠激活T、B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞(NK)等免疫細(xì)胞,還能活化補(bǔ)體,促進(jìn)細(xì)胞因子的生成,全面發(fā)揮對(duì)機(jī)體的調(diào)節(jié)作用。研究表明,靈芝多糖還對(duì)淋巴細(xì)胞中的NK細(xì)胞有增強(qiáng)作用。TNF-α、L-2、L-10等在免疫系統(tǒng)中占有重要地位。TNF-α在機(jī)體免疫防護(hù)方面有重要作用,還參與集體的免疫病理損傷;L-2有促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖、促進(jìn)B淋巴細(xì)胞分泌抗體、增強(qiáng)T細(xì)胞殺傷及增強(qiáng)NK細(xì)胞活性等作用。周桂琴等的研究結(jié)果表明靈芝多糖可以抑制腫瘤生長,其機(jī)理可能是通過刺激淋巴細(xì)胞,影響了TNF-α、L-2、L-10等因子的分泌,從而增強(qiáng)細(xì)胞及體液免疫,巨噬細(xì)胞的吞噬作用。任瑋等的研究也顯示,靈芝多糖可提高小鼠的免疫功能,增強(qiáng)NK細(xì)胞數(shù)量的作用,通過對(duì)L-2、L-4和IFN-γ的影響,調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。馮鵬等的研究結(jié)果表明,靈芝孢子多糖可以顯著提高荷瘤小鼠的體液免疫功能和網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬功能,并且對(duì)荷瘤小鼠的外周血的T細(xì)胞亞群中的殺傷性T細(xì)胞和輔助性T細(xì)胞均有一定的激活作用,而且對(duì)荷瘤小鼠的NK細(xì)胞具有一定的激活作用。李麗等在研究中發(fā)現(xiàn),靈芝多糖可以增加小鼠血清中干擾素IFN-γ的含量,對(duì)腫瘤生長也有抑制作用,在劑量的使用上,以中劑量(10mg/kg)的抑瘤率最好。2.5對(duì)細(xì)胞的抗氧化作用近年來,眾多學(xué)者對(duì)人衰老的原因提出了很多學(xué)說,如免疫學(xué)說、遺傳學(xué)說、自由基學(xué)說等,其中,自由基學(xué)說越來越引起人們的關(guān)注。Harman提出衰老的自由基學(xué)說,自由基是在細(xì)胞代謝過程中不斷產(chǎn)生的,具有強(qiáng)氧化性,在細(xì)胞內(nèi)可以與多種生物大分子,如蛋白質(zhì)、DNA、細(xì)胞膜中的不飽和脂肪酸等發(fā)生反應(yīng),從而導(dǎo)致多聚核蛋白解聚、抑制蛋白質(zhì)的合成,而這些正是細(xì)胞衰老的特征。最近的研究發(fā)現(xiàn),靈芝多糖對(duì)細(xì)胞的抗氧化作用十分明顯。游育紅等研究了靈芝多糖對(duì)ECV304氧化損傷的保護(hù)作用,結(jié)果顯示靈芝多糖可以減少氧自由基對(duì)細(xì)胞器的損傷,對(duì)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞壞死也有很好的抑制作用,使細(xì)胞存活率提高,證明了靈芝多糖保護(hù)細(xì)胞、抗氧化的作用。王宏勛等研究了混合使用多糖對(duì)去除羥自由基的效果,發(fā)現(xiàn)復(fù)合使用多糖比僅使用一種多糖去除羥自由基效果要好,并且探索了不同比例的靈芝多糖和枸杞多糖對(duì)去除羥自由基的效果。胡太平等首次證明了,在血管壁中產(chǎn)生O2·的NHDPH氧化酶酶系的活性受到靈芝多糖的抑制,而O2·含量過高會(huì)導(dǎo)致多種高血壓病癥的發(fā)生。3不同碳源、不同微量元素和維生素a由于靈芝多糖突出的保健功效,因此靈芝商品很受歡迎。對(duì)靈芝的生產(chǎn),傳統(tǒng)的方法是以固體培養(yǎng)基培植,但這種方法有生產(chǎn)周期長、生產(chǎn)效率低等因素的制約,無法實(shí)現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。而液體發(fā)酵技術(shù)的出現(xiàn),使得大規(guī)模生產(chǎn)靈芝成為可能。液體發(fā)酵得到的靈芝,在營養(yǎng)成分方面,如靈芝多糖、靈芝酸等,比傳統(tǒng)方法生產(chǎn)的靈芝子實(shí)體還要高。因此,液態(tài)發(fā)酵成為獲得靈芝多糖的重要手段。眾多學(xué)者優(yōu)化靈芝發(fā)酵的條件,主要從發(fā)酵的營養(yǎng)條件、菌種接種量、pH值、DO、溫度等方面加以控制,從而達(dá)到提高靈芝多糖產(chǎn)量的目的。張志軍等研究了種子培養(yǎng)4、5、6d情況下對(duì)靈芝多糖發(fā)酵的影響,以培養(yǎng)5d的種子發(fā)酵的多糖產(chǎn)量在第4天達(dá)到最高,產(chǎn)量為4.3g/L。Changa等在研究中考察了多種因素對(duì)靈芝多糖和菌絲量的影響,麥芽提取物可以極大的提高多糖的含量,而使用赤砂糖比單純使用蔗糖效果要好;氮源選擇了酵母浸膏和脫脂乳,其中脫脂乳含有含氮化合物和乳糖,這會(huì)促進(jìn)多糖的產(chǎn)生;并嘗試了加入植物油,其對(duì)提高產(chǎn)量有一定的效果。Hsieh等的研究結(jié)果表明,當(dāng)以葡萄糖作為碳源時(shí),靈芝胞外多糖濃度隨著葡萄糖濃度升高而升高,在葡萄糖質(zhì)量濃度為60g/L時(shí),多糖質(zhì)量濃度達(dá)到1.79g/L;在以玉米漿為氮源時(shí),多糖濃度隨玉米漿濃度升高而下降,與菌絲量恰好相反;在考察鎂鹽和磷源對(duì)多糖的影響時(shí),發(fā)現(xiàn)鎂鹽的影響更加顯著,磷源對(duì)菌絲生長有益,對(duì)產(chǎn)生多糖有抑制作用。Lee等研究了靈芝胞內(nèi)多糖和胞外多糖的產(chǎn)生條件,認(rèn)為麥芽糖和葡萄糖是有效碳源,在25℃、60g/L葡萄糖、8~12d培養(yǎng)的條件下,有助于胞外多糖的高產(chǎn);而在10~15℃、低碳氮比、最少10d的條件下,有助于胞內(nèi)多糖的高產(chǎn)。陳志玲等研究了幾種微量元素和維生素對(duì)靈芝多糖的影響,發(fā)現(xiàn)靈芝多糖含量以添加1.0‰VB1最高,其培養(yǎng)液中為6.00g/L,菌絲體中為552.5mg/g;添加0.1‰~0.2‰。硫酸鋅和1.0‰復(fù)合VB1,能顯著提高靈芝多糖含量,添加適量的鐵、鋅也能顯著提高靈芝多糖。Zhu等在研究中發(fā)現(xiàn),可以加入從夏塊菌(TuberaestivumVittad.)提取出的真菌刺激素來提高靈芝多糖的產(chǎn)量。4超聲波促進(jìn)多糖提取發(fā)酵產(chǎn)生靈芝多糖,主要包括兩個(gè)部分,即胞內(nèi)多糖和胞外多糖。胞外多糖由于直接在發(fā)酵液中,所以易于提取。而胞內(nèi)多糖在細(xì)胞壁或細(xì)胞間質(zhì)中,所以需要先破