正畸治療大鼠牙周膜移動速度的初步研究

正畸治療大鼠牙周膜移動速度的初步研究

在畸形治療過程中，牙根吸收可能與許多因素有關(guān)。臨床研究表明垂直向或水平向開牙合患者其矯治前、后牙根吸收程度均大于深覆牙合患者,這說明異常牙周膜功能狀態(tài)與根吸收間存在一定關(guān)系。這些異常功能狀態(tài)包括:開牙合、牙異位等無咬合接觸狀態(tài)造成的牙周膜廢用性萎縮和深覆牙合、偏側(cè)咀嚼等引起的牙周膜機(jī)能代償性亢進(jìn)。本研究旨在通過移動不同牙周膜功能狀態(tài)的大鼠磨牙,來比較牙根吸收程度及牙齒移動速度的差異,并分析可能的原因。1材料和方法1.1中心飼養(yǎng)方健康成年雄性SD大鼠33只(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供),6～8周齡,體質(zhì)量(250±20)g,普通塊料分籠飼養(yǎng),自由攝食飲水。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。大鼠隨機(jī)分為2大組:正常對照組(C組)11只和實(shí)驗(yàn)組22只。1.2動物模型的建立實(shí)驗(yàn)組22只雄性SD大鼠腹腔麻醉下拔除右下頜(C區(qū))全部磨牙,致其右上頜(A區(qū))磨牙喪失對頜牙而無咬合接觸;而左側(cè)上下頜磨牙(B區(qū)和D區(qū))所受咬合力代償性增大。拔牙3周后形成A區(qū)磨牙牙周膜廢用性萎縮和B區(qū)磨牙牙周膜代償性機(jī)能亢進(jìn)動物模型。已做預(yù)實(shí)驗(yàn)確定動物模型的準(zhǔn)確性。據(jù)此又將實(shí)驗(yàn)組分為廢用組(A組)、代償組(B組)2個亞組,每組11只。A、B、C3組各處死1只動物,組織學(xué)檢查牙周膜功能狀態(tài)。1.3下頜第一牙間大鼠經(jīng)200g/L烏拉坦溶液(1g/kg)腹腔注射麻醉后仰臥固定,將一根長5mm鎳鈦螺旋拉簧用直徑0.25mm正畸結(jié)扎鋼絲固定于上頜第一磨牙與同側(cè)切牙間(A組與C組為右上頜第一磨牙,B組為左上頜第一磨牙),初始力值為0.59N(60g)(電子稱測定),使第一磨牙近中移動(圖1)。上頜中切牙與結(jié)扎絲間以光固化材料加固,防止脫落。實(shí)驗(yàn)過程中嚴(yán)密監(jiān)控大鼠的加力裝置,若有損壞和脫落,及時修理安裝。1.4x線片的拍攝實(shí)驗(yàn)組與對照組大鼠在加力14d后頸椎脫臼處死,取加力側(cè)上頜組織,在拆除加力裝置前通過可視性X線投照技術(shù)(radiovideograph,RVG)拍攝并測定上頜第一與第二磨牙間間隙寬度,以確定牙齒移動距離(圖2)。具體方法:將組織塊頰舌向水平固定于X線攝影臺上,照相時使X線垂直向進(jìn)入標(biāo)本,保持每次照相時標(biāo)本、X線球管及膠片三者間關(guān)系恒定,以確保拍攝結(jié)果的可靠性與可比性。本研究X線片均由一名有經(jīng)驗(yàn)技師嚴(yán)格按投照標(biāo)準(zhǔn)拍攝。每張X線片重復(fù)測量5次,取平均值。1.5he染色及trap染色將帶有加力側(cè)上頜第一磨牙及周圍牙槽骨的組織塊放入40g/L甲醛溶液(pH7.4)4℃固定24h,100g/LEDTA(pH7.4)脫鈣4～6周,梯度乙醇脫水,正丁醇透明,浸蠟,常規(guī)石蠟包埋。將標(biāo)本按平行牙長軸方向做近遠(yuǎn)中向連續(xù)組織切片,片厚5μm。選取可見到上頜第一磨牙近中牙根根管的組織切片行HE染色,檢查壓力側(cè)牙根吸收情況;抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色鑒別破骨細(xì)胞。TRAP染色方法:將4mg的萘酚AS-BI磷酸酯酶(Sigma,USA)溶于0.25mlN、N-二甲基甲酰胺中,加入0.2mol/L醋酸緩沖液25ml(pH5.0),再加入35mg的對品紅染劑(Sigma,USA)和60μl100g/L氯化鎂,液體過濾后加熱至37℃,加50mmol/L酒石酸。標(biāo)本切片浸入以上配制好的液體中孵育,37℃,2h,之后流水沖洗30min,蘇木精復(fù)染7min,沖洗,脫水,封片,鏡下觀察(陰性對照組不加萘酚AS-BI磷酸酯酶)。TRAP染色陽性的多核細(xì)胞出現(xiàn)于新形成的根吸收陷窩處,以此鑒別于陳舊性吸收。1.6彩色病理圖分析利用電子顯微鏡(OlympusBX50,Japan)和高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)(HPIAS-1000),選擇上頜第一磨牙近中根近中面最深的根吸收陷窩,測定陷窩頂?shù)礁砻婕傧脒B線的距離(圖3),每個牙選5張切片測量,取其平均值代表每個牙根吸收的最大深度。2結(jié)果2.1牙周膜機(jī)代謝性增強(qiáng)A組(牙周膜廢用性萎縮)牙周膜寬度明顯變窄,結(jié)構(gòu)稀疏,纖維、細(xì)胞排列明顯紊亂,成纖維細(xì)胞數(shù)量減少,牙槽骨骨皮質(zhì)變薄,骨髓腔增寬;B組(牙周膜機(jī)能代償性增強(qiáng))牙周膜寬度明顯增加,結(jié)構(gòu)致密,纖維、細(xì)胞排列有序,成纖維細(xì)胞數(shù)量增多,牙槽骨骨皮質(zhì)增厚;C組(正常咬合力組)大鼠牙周膜寬度正常,結(jié)構(gòu)致密,纖維、細(xì)胞排列有序(圖4)。組織形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果表明,此方法已建立有效的動物模型。2.2組顯著性差異分析結(jié)果見表1。經(jīng)SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件包ANOVA方差分析(F=31.12,P<0.01),3組間有顯著性差異。選擇Bonferroni法進(jìn)行組間兩兩比較,B組與A組、C組間差異有顯著性意義(P<0.01),A、C兩組間差異無顯著性意義(P>0.05)。2.3牙周膜間根吸收陷窩深度各組第一磨牙近中根近中面吸收最嚴(yán)重的部位多位于根尖1/3區(qū),與相關(guān)研究一致。牙周膜廢用性萎縮組(A組)近中根近中面可見多個根吸收陷窩,且深度多達(dá)牙本質(zhì);牙周膜正常組(C組)根吸收陷窩數(shù)量較多,但深度多限于牙骨質(zhì)層;牙周膜機(jī)能代償性增強(qiáng)組(B組)根吸收陷窩數(shù)量少且深度淺(圖5)。各組牙根面吸收深度測量值見表2。經(jīng)ANOVA單因素方差分析顯示(F=15.518,P<0.01),3組間有顯著性差異。Bonferroni法進(jìn)行組間兩兩比較,A組與B組、C組間差異有顯著性意義(P<0.01),B、C兩組間差異無顯著性意義(P>0.05)。3牙周膜優(yōu)化模型的建立在以往的研究中,學(xué)者們通過磨除一定的牙體組織降低咬合、局部牙合墊或固定橋修復(fù)增高咬合等方法來建立咬合力減弱或增強(qiáng)的動物模型。目前應(yīng)用最廣且簡便易行的方法是拔除一個區(qū)的全部或部分牙,使對頜磨牙喪失咬合接觸,而對側(cè)磨牙產(chǎn)生咬合代償,達(dá)到建立咬合力改變的動物模型的目的。本實(shí)驗(yàn)通過拔除大鼠右下頜所有磨牙,改變其咬合力,3周后形成誘導(dǎo)性牙周膜功能狀態(tài)的改變。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,正常咬合力狀態(tài)下,大鼠牙周膜結(jié)構(gòu)致密,膠原纖維與細(xì)胞排列有序,牙槽骨骨壁較平,表面襯以連續(xù)排列的扁平成骨細(xì)胞;咬合力喪失所誘導(dǎo)的牙周膜廢用性萎縮組牙周膜結(jié)構(gòu)稀疏,膠原纖維與細(xì)胞的排列明顯紊亂,牙槽骨骨皮質(zhì)變薄;而咬合力增強(qiáng)所誘導(dǎo)的牙周膜機(jī)能亢進(jìn)組牙周膜寬度明顯增加,結(jié)構(gòu)致密,其纖維、細(xì)胞排列有序,牙槽骨壁可見明顯骨形成區(qū)。表明此方法已成功建立誘導(dǎo)性牙周膜廢用性萎縮和牙周膜機(jī)能代償性亢進(jìn)模型,與相關(guān)研究結(jié)果一致。本實(shí)驗(yàn)選擇上頜第一磨牙近中牙根來測定根吸收情況的原因:首先,近中牙根是上頜第一磨牙5個牙根中最大者,因而易獲取滿足要求的連續(xù)組織切片;其次,近中牙根位于第一磨牙頰舌向中份,與所受的外力處于同一個平面;最后,以往的大量研究也采用第一磨牙近中牙根進(jìn)行測量,便于結(jié)果間對比。抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrateresistantacidphosphatase,TRAP)是破骨細(xì)胞特征性酶,其表達(dá)和分泌與破骨細(xì)胞功能密切相關(guān),是破骨細(xì)胞重要的酶組化識別標(biāo)志。牙齒正畸受力時,含有高活性酸性磷酸酶的破骨細(xì)胞常位于壓力側(cè)牙槽骨或牙根表面的吸收陷窩內(nèi)。因此TRAP陽性細(xì)胞常用于鑒別活躍的牙根吸收,以區(qū)別于陳舊性根吸收。實(shí)驗(yàn)中將TRAP染色與根吸收深度的定量檢測相結(jié)合,以使結(jié)果更科學(xué)可信。實(shí)驗(yàn)各組均采用大而持續(xù)的矯治力,這種矯治力可導(dǎo)致牙周膜功能狀態(tài)正常的牙發(fā)生牙根吸收。本實(shí)驗(yàn)中牙周膜廢用性萎縮組牙根吸收程度最嚴(yán)重(大多深達(dá)牙本質(zhì)),明顯高于其它2組,說明除了矯治力,牙周膜功能狀態(tài)與牙根吸收也相關(guān)。廢用性萎縮牙周膜中各功能結(jié)構(gòu)均表現(xiàn)為進(jìn)行性退變,這可能加重了由矯治力引起的牙根吸收:由于牙周膜寬度變窄,矯治力在近中根的近中側(cè)(壓力側(cè))力量更為集中,而且排列紊亂的牙周纖維削弱了牙周膜對矯治力的緩沖作用,因而局部壓力相對增大,導(dǎo)致各種炎癥介質(zhì)水平升高,刺激破骨細(xì)胞活化,最終加劇