益腎護(hù)骨方對廢用性骨質(zhì)疏松大鼠的影響

益腎護(hù)骨方對廢用性骨質(zhì)疏松大鼠的影響

廢棄性骨質(zhì)疏松癥通常以不同程度的手術(shù)為基礎(chǔ)，需要不同程度的下肢運(yùn)動，如長期河床、運(yùn)動功能受限和骨折后的所需控制。神經(jīng)損傷或病變（中樞神經(jīng)系統(tǒng)、脊髓或周圍神經(jīng)）引起的關(guān)節(jié)功能喪失和長期全身消耗。該疾病已經(jīng)成為骨創(chuàng)傷疾病、骨關(guān)節(jié)疾病及骨關(guān)節(jié)疾病術(shù)后康復(fù)的重要障礙,甚至有發(fā)生骨質(zhì)疏松性骨折的風(fēng)險,影響原發(fā)疾病的治療和康復(fù)。本研究前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)在廢用性骨質(zhì)疏松形成過程中,骨形成顯著降低持續(xù)降低,但速度趨緩,觀察最佳時間為造模術(shù)后4周或6周。本實(shí)驗(yàn)研究益腎護(hù)骨方對廢用性骨質(zhì)疏松動物模型血尿生化水平、骨結(jié)構(gòu)及股骨生物力學(xué)性能的影響,為益腎活血中藥防治廢用性骨質(zhì)疏松提供新思路。1材料表面1.1實(shí)驗(yàn)動物3月齡SD大鼠70只,雌雄不限,由江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。動物許可證號SCXK(蘇)2009-0002。1.2特效藥1.2.1藥液濃縮組采用水制備工藝由鹿角片10g,補(bǔ)骨脂10g,骨碎補(bǔ)10g,淮牛膝15g,熟地黃15g,當(dāng)歸15g,白芍15g,川芎10g組成,由常州市中醫(yī)醫(yī)院制劑室水煎濃縮成至每1mL藥液中含生藥1g。1.2.2強(qiáng)骨膠囊強(qiáng)骨膠囊(北京歧黃制藥有限公司,每粒膠囊0.25g,含骨碎補(bǔ)總黃酮有效成分0.18g),使用時加蒸餾水制成25g·L-1溶液。1.3試劑與試劑盒尿羥脯氨酸(HYP)試劑盒、尿肌酐(Cr)測定試劑、血清骨鈣素(BGP)放免試劑盒、血清抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)、Masson三色染色試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司);B41型光學(xué)顯微鏡(日本Olympus),萬能材料實(shí)驗(yàn)機(jī)(美國BOSE3510),醫(yī)學(xué)圖像定量分析系統(tǒng)(上海求為生物科技有限公司MIQAS)。2方法2.1動物組2.2切除坐骨神經(jīng)大鼠用10%水合氯醛以30mL·kg-1行腹腔麻醉后,暴露坐骨神經(jīng),于近髖處用銳利刀片切除坐骨神經(jīng),長約5mm,并將神經(jīng)斷端打結(jié)處理,逐層縫合切口。肌注慶大霉素0.1mL,以預(yù)防感染。2.3同體積的鹽水ig造模后第2天分別予以藥物干預(yù),ig給藥4周,每日1次,A、B組均正常飼料喂養(yǎng),自由飲水;C組造模后第2天予以藥物組同體積的生理鹽水ig;D1,D2,D3組分別于造模后第2天予以益腎護(hù)骨方52,26,16.25g·kg-1ig;E組造模后第2天予以強(qiáng)骨膠囊0.25g·kg-1ig。各組ig液體量為10mL·kg-1,其濃度及等效劑量按體重折算。2.4測試指標(biāo)2.4.1血液和尿液生化指標(biāo)的測定用全自動生化分析儀測定尿Cr,ALP,尿HYP用對二甲氨苯甲醛法測定,血清BGP用放射免疫法測定,TRACP用免疫酶聯(lián)法。2.4.2材料三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)取股骨標(biāo)本,生理鹽水沖凈,自凝樹脂將樣本兩端固定于統(tǒng)一包埋深度。樣本固定于實(shí)驗(yàn)夾上,進(jìn)行3點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)。在BOSE3510萬能材料實(shí)驗(yàn)機(jī)上,在變形率為2mm·min-1恒定作用下對股骨標(biāo)本施加載荷,股骨標(biāo)本中點(diǎn)上方有一個壓桿。記錄股骨斷裂過程中力與位移曲線。2.4.3遠(yuǎn)側(cè)干端骨組織形態(tài)檢測取各組右脛骨近側(cè)1/3段,10%中性甲醛固定24~48h,10%中性EDTA液4~8℃脫鈣,冠狀對剖,70%,80%,90%乙醇順濃度梯度脫水,組織浸蠟,石蠟包埋,5μm切片,HE染色和Masson染色,鏡下觀察股骨遠(yuǎn)側(cè)干骺端骨組織形態(tài)改變。光學(xué)顯微鏡下觀察,取10×10倍下骨骺線下緣一視野,測節(jié)點(diǎn)數(shù)和游離末端數(shù)。2.5數(shù)據(jù)處理和分析統(tǒng)計分析采用SPSS11.5軟件包,所有數(shù)據(jù)行正態(tài)分布檢驗(yàn),呈正態(tài)分布數(shù)據(jù)以ue0af±s表示。多組間比較采用單因素方差分析,組間相互比較采用LSD分析,兩組間比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。3結(jié)果3.1大鼠患下肢偏行模型實(shí)驗(yàn)中無動物意外死亡,觀察各時間段內(nèi)大鼠體重增長基本正常。C,D1,D2,D3,E組大鼠造模后即出現(xiàn)患肢跛行,至處死仍不能恢復(fù),但均可以3個肢體行走及正常覓食。B組術(shù)后1周內(nèi)即可恢復(fù)4個肢體行走及正常覓食。見表1。3.2表3顯示了血液中alp、bgs、trach和hyp-cr的影響3.2.1各組大鼠血bgp比較C組血BGP與B組相比顯著降低(P<0.01),予以益腎護(hù)骨方干預(yù)后,與C組比較,D1,D2,D3組血BGP顯著升高(P<0.01)。3.2.4尿hop/cr比較C組尿HYP/Cr與B組相比顯著升高(P<0.01),予以益腎護(hù)骨方干預(yù)后,與C組比較,D1,D2,D3組尿HOP/Cr顯著降低(P<0.01)。見表1。3.3預(yù)后組與c組最大載荷對比C組股骨最大載荷與B組相比顯著升高(P<0.01),予以益腎護(hù)骨方干預(yù)后,D1,D2,D3組最大載荷與C組相比顯著降低(P<0.01)。C組彈性模量與B組相比顯著升高(P<0.01),予以益腎護(hù)骨方干預(yù)后,D1,D2,D3組彈性模量與C組相比顯著降低(P<0.01)。見表2。3.4影響脛骨組織形態(tài)的觀察和骨小梁形狀的計量學(xué)3.4.1小鼠骨髓骨小梁deA組與B組脛骨近側(cè)干骺段骨皮質(zhì)較厚,孔隙較少,骨小梁排列緊密,結(jié)構(gòu)正常。而C組骨結(jié)構(gòu)紊亂,骨小梁變細(xì)、稀疏,孔隙增多,皮質(zhì)明顯較薄,骨小梁有多處斷裂,骺板下區(qū)空曠,髓腔擴(kuò)大。D1,D2,D3,E組脛骨骨小梁結(jié)構(gòu)較A組與B組也有減少、變細(xì),骨小梁表面成骨細(xì)胞增生減少,破骨細(xì)胞增多。Masson染色:松質(zhì)骨部分,C組以藍(lán)色為主,表明骨基質(zhì)中礦物成分喪失,骨基質(zhì)向礦化骨樣組織轉(zhuǎn)化受抑制;D1,D2,D3組及E組則大部呈相互移行的紅色區(qū)域,表明該處骨基質(zhì)礦化良好。3.4.2骨小梁節(jié)點(diǎn)數(shù)、游離末端數(shù)C組骨小梁節(jié)點(diǎn)數(shù)與B組相比顯著減少(P<0.01),而游離末端數(shù)顯著增多(P<0.01),予以益腎護(hù)骨方干預(yù)后,D1,D2,D3組骨小梁節(jié)點(diǎn)數(shù)與C組相比顯著增多(P<0.01),而游離末端數(shù)顯著減少(P<0.01)。見表3。4補(bǔ)腎陰精、通經(jīng)化瘀通血廢用性骨質(zhì)疏松癥是繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥之一?！肮琴|(zhì)疏松”一般歸入中醫(yī)“骨痿”范疇。對于骨質(zhì)疏松癥的主要病機(jī),形成了腎虛為本、血瘀為標(biāo)的普遍認(rèn)識。所以,治療骨質(zhì)疏松歷代醫(yī)家多數(shù)均從補(bǔ)腎活血入手。目前,雖然借助現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)對廢用性骨質(zhì)疏松癥病因、病理的分子生物、生物力學(xué)等方面有了較深入的進(jìn)展,但從西藥治療方面來看,目前仍無長足進(jìn)展。雖然對原發(fā)性骨質(zhì)疏松有很多有效方案可以選擇,但缺乏有效的治療方案治療廢用性骨質(zhì)疏松。益腎護(hù)骨方是張前德教授在長期臨床工作中總結(jié)歸納的經(jīng)驗(yàn)方。益腎護(hù)骨方由鹿角片、補(bǔ)骨脂、骨碎補(bǔ)、淮牛膝、熟地黃、當(dāng)歸、白芍、川芎8味中藥組成。鹿角片為血肉有情之品,溫補(bǔ)腎陽,為君,補(bǔ)骨脂、骨碎補(bǔ)補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨,為臣,熟地黃補(bǔ)腎陰,陰中求陽,添精益髓,為佐藥;淮牛膝,善引諸藥下達(dá)腰膝,不僅能補(bǔ)肝強(qiáng)筋骨,尚能在滋膩之群中輕疏靈動,通調(diào)經(jīng)脈而活血祛瘀,兼有“調(diào)血”之職,為使藥。當(dāng)歸、白芍、川芎養(yǎng)血活血止痛?？傊?益腎護(hù)骨方既著重補(bǔ)腎氣、溫腎陽,兼顧滋補(bǔ)腎陰精,以冀陰中求陽,陰陽互生;另外補(bǔ)益的同時,加用牛膝等通經(jīng)化瘀活絡(luò)之品,標(biāo)本兼顧,補(bǔ)而不滯,通而不傷其正。廢用性骨質(zhì)疏松癥是骨代謝失調(diào)所致的結(jié)果,骨代謝異常,主要表現(xiàn)為骨吸收與骨形成的平衡失調(diào)。本研究結(jié)果顯示,益腎護(hù)骨方干預(yù)后,與模型組相比,血ALP,TRACP及尿HOP/Cr較模型組明顯降低(P<0.01),血BGP較模型組明顯升高(P<0.01),說明益腎護(hù)骨方有抑制骨過渡轉(zhuǎn)化,促進(jìn)成骨細(xì)胞活性,抑制成骨細(xì)胞破壞的作用。骨的生物力學(xué)特性是對骨量、骨質(zhì)量、骨結(jié)構(gòu)等的綜合體現(xiàn),骨的生物力學(xué)特性最能直接反映骨組織的抗骨折能力,而這種抗骨折能力是骨組織所具備的主要功能的基礎(chǔ)。骨的生物力學(xué)性能的評定不僅是評價骨質(zhì)量和強(qiáng)度的主要方法,也是評價骨質(zhì)疏松癥的最佳方法之一。本研究結(jié)果顯示,益腎護(hù)骨方干預(yù)后,與模型組相比,股骨最大載荷及彈性模量均較模型組明顯升高(P<0.01),說明益腎護(hù)骨方提高骨組織力學(xué)性能,增強(qiáng)股骨抗骨折能力。骨形態(tài)學(xué)是評價骨吸收及骨形成的有效手段,研究骨小梁的微構(gòu)筑,即對骨小梁節(jié)點(diǎn)數(shù)和游離末端數(shù)的定量研究,對骨質(zhì)疏松癥的診斷、骨折風(fēng)險預(yù)測和藥物療效評定具有較大的參考價值。本研究結(jié)果顯示,益腎護(hù)骨方干預(yù)后,改善了骨小梁微構(gòu)筑,促進(jìn)骨基質(zhì)的礦化,且與模型組相比,骨小梁節(jié)點(diǎn)數(shù)和游離末端數(shù)均有明顯的增加(P<0.01),說明益腎護(hù)骨方能改善骨小梁微構(gòu)筑,增強(qiáng)骨力學(xué)結(jié)構(gòu)。本實(shí)驗(yàn)通過從骨代謝生化指標(biāo)、骨結(jié)構(gòu)及股骨生物力學(xué)性能的角度研究益腎護(hù)骨方對廢用性骨質(zhì)疏松大鼠有不同程度的成骨作用,可以不同程度延緩或減輕大鼠廢用性骨質(zhì)疏松的發(fā)生。動物實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性喂養(yǎng)l周,再按照體重排序后,按隨機(jī)數(shù)字表分別將大鼠分為7組,即A組-正常對照組、B組-假手術(shù)組、C組-模型組、D1~D3組-益腎護(hù)骨方高、中、低劑量組(相當(dāng)于成人劑量的20,10,6.25倍)、E組-陽性藥物強(qiáng)骨膠囊對照組,每組10只。C,D1,D2,D3,E組行右后肢坐骨神經(jīng)切斷術(shù),B組的手術(shù)