第四章動(dòng)物細(xì)胞工程制藥(1)-生物技術(shù)制藥

動(dòng)物細(xì)胞工程制藥主要內(nèi)容細(xì)胞概述……了解動(dòng)物細(xì)胞的形態(tài)和生理特性

……熟悉生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的要求和獲得

……掌握動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基……掌握動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法動(dòng)物細(xì)胞大量培養(yǎng)的方法和操作方式

動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器

動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)品的純化方法和質(zhì)量要求

動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)品的制造實(shí)例

動(dòng)物細(xì)胞制藥的前景與展望

一、細(xì)胞概述歷史與現(xiàn)狀細(xì)胞在生物制藥中的意義大腸桿菌細(xì)胞硅藻植物細(xì)胞模式圖百合花花瓣動(dòng)物細(xì)胞掃描電鏡圖動(dòng)物細(xì)胞模式圖原核細(xì)胞與真核細(xì)胞區(qū)別原核細(xì)胞真核細(xì)胞細(xì)胞大小較小較大細(xì)胞核無成形的細(xì)胞核，核物質(zhì)集中在核區(qū)。無核膜，無核仁。DNA不與蛋白質(zhì)結(jié)合。有成形的真正的細(xì)胞核。有核膜，有核仁。DNA與蛋白質(zhì)形成染色體。細(xì)胞質(zhì)除核糖體外，無其它的細(xì)胞器。有各種細(xì)胞器。細(xì)胞壁有。主要是肽聚糖。植物細(xì)胞、真菌有，動(dòng)物細(xì)胞無。代表生物放線菌、細(xì)菌、藍(lán)藻、衣原體真菌、植物、動(dòng)物第二節(jié)動(dòng)物細(xì)胞的形態(tài)與生理特性1.貼壁細(xì)胞的生長(zhǎng)特征成纖維細(xì)胞人胃腺癌細(xì)胞2.懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)特征白細(xì)胞細(xì)胞：K562腹水瘤細(xì)胞：Ehrlich腹水瘤細(xì)胞EAC3.兼性貼壁細(xì)胞CHO－K1CHO-K1動(dòng)物細(xì)胞的化學(xué)組成與代謝大分子：蛋白質(zhì)核酸糖脂質(zhì)大分子代謝的三個(gè)階段三大營(yíng)養(yǎng)素水解為單體中間產(chǎn)物的生成三羧酸循環(huán)產(chǎn)能代謝：三羧酸循環(huán)葡萄糖產(chǎn)能對(duì)比供氧不足：糖酵解途徑2ATP;供氧充分：三羧酸循環(huán)36～38ATP；動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)：供氧成為生物反應(yīng)器設(shè)計(jì)的最重要的因素之一！動(dòng)物細(xì)胞的生理特點(diǎn)細(xì)胞的分裂周期長(zhǎng)：12～18h細(xì)胞生長(zhǎng)需貼附于基質(zhì)，并有接觸抑制現(xiàn)象；正常二倍體細(xì)胞的生長(zhǎng)壽命有限；動(dòng)物細(xì)胞對(duì)周圍環(huán)境敏感；動(dòng)物細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基的要求高；動(dòng)物細(xì)胞對(duì)蛋白質(zhì)的合成途徑和修飾功能與細(xì)菌不同。各類細(xì)胞周期時(shí)間表細(xì)胞生長(zhǎng)需貼附于基質(zhì)，并有接觸抑制現(xiàn)象：在玻璃、塑料等基質(zhì)上生長(zhǎng)，與電荷、鈣鎂離子、貼附因子（collagen，F(xiàn)ibronectin）有關(guān)。無血清培養(yǎng)基：少！血清、塑料瓶/玻璃瓶，生長(zhǎng)密度80％左右為佳。及時(shí)傳代！正常二倍體細(xì)胞的壽命有限原代培養(yǎng)：離體培養(yǎng)開始的時(shí)間稱“原代培養(yǎng)”；經(jīng)若干代之后細(xì)胞趨于死亡。成纖維細(xì)胞～50代，加入表皮生長(zhǎng)因子～150代。轉(zhuǎn)化成異常體后～無限細(xì)胞系，成為“永生化”細(xì)胞。動(dòng)物細(xì)胞對(duì)周圍環(huán)境十分敏感細(xì)胞膜對(duì)理化因素：滲透壓，pH,離子濃度，剪切力，微量元素等敏感。一切導(dǎo)致脂質(zhì)和蛋白質(zhì)變性的因素都影響動(dòng)物細(xì)胞的存活動(dòng)物細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基的要求高原核細(xì)胞：碳源：葡萄糖，麥芽糖，淀粉，氮源：蛋白胨，玉米漿，酵母粉；無機(jī)鹽：PO4,,Na,K+,Fe++,動(dòng)物細(xì)胞：營(yíng)養(yǎng)要求高！12種必需氨基酸，8種以上維生素，多種無機(jī)鹽，微量元素，碳源：葡萄糖，多種細(xì)胞因子，貼壁因子，血清。動(dòng)物細(xì)胞對(duì)蛋白質(zhì)的合成途徑和修飾功能與細(xì)菌不同既在游離核糖體（細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)蛋白）上合成，更多的在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（分泌蛋白，整合蛋白，N-linkedglycoprotein）上進(jìn)行。多數(shù)為糖蛋白。,高爾基體（O-linkedglycoprotein）。蛋白質(zhì)的糖基化與細(xì)胞功能密切相關(guān)：細(xì)胞識(shí)別，胞內(nèi)消化，外排分泌物。因此，有些生物藥品不能用原核細(xì)胞表達(dá)：EPO動(dòng)物細(xì)胞來源的生物藥物比重越來越大！第三節(jié)生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的要求和獲得一、生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的要求：正常組織的原代細(xì)胞：雞胚、兔腎細(xì)胞等多次傳代的二倍體細(xì)胞：WI-38,2BS，Namalwa細(xì)胞：干擾素Vero細(xì)胞：狂犬病疫苗、脊髓灰質(zhì)炎癥疫苗雜交瘤細(xì)胞：OKT-3mAb逐步取消了非二倍體細(xì)胞的限制DNA殘留量的檢測(cè)！二、生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的獲得原代細(xì)胞二倍體細(xì)胞轉(zhuǎn)化細(xì)胞系融合細(xì)胞系重組工程細(xì)胞系原代細(xì)胞最無爭(zhēng)議的細(xì)胞，但費(fèi)時(shí)，費(fèi)力，成本高，如：雞胚細(xì)胞，原代兔腎或鼠腎細(xì)胞，淋巴細(xì)胞等；2.二倍體細(xì)胞：原代細(xì)胞的馴化產(chǎn)物，仍具正常細(xì)胞的特點(diǎn)：2n核型，貼壁依賴，接觸抑制，有限增殖（50代以內(nèi)），無致瘤性。代表性細(xì)胞株：WI－38，MRC-5，2BS；3.轉(zhuǎn)化細(xì)胞系：正常細(xì)胞的自發(fā)轉(zhuǎn)化，人為轉(zhuǎn)化（SV40，甲基膽蒽）SV40，即猿猴空泡病毒40（Simianvacuolatingvirus40），是一種多瘤病毒，也是一種DNA病毒，有造成腫瘤發(fā)生的潛在能力。代表細(xì)胞株：Namalwa,CHO,BHK-21,Vero4.融合細(xì)胞系：兩個(gè)或兩個(gè)以上細(xì)胞融合而成?！芫?。動(dòng)物－動(dòng)物細(xì)胞，動(dòng)物－植物細(xì)胞；誘導(dǎo)物：（1）仙臺(tái)病毒：副流感病毒I型。方法：4oC聚集，37oC反應(yīng)，細(xì)胞穿通，細(xì)胞融合。以經(jīng)很少使用。（2）聚乙二醇PEG:分子量1000，濃度50％，Ph8.0~8.2,融合率近100％。單抗生產(chǎn)中使用。（3）電融合：電場(chǎng)0.5～1.5V，脈沖1～50μs。5.基因工程技術(shù)構(gòu)建重組工程細(xì)胞

（1）真核細(xì)胞基因表達(dá)載體的構(gòu)建I、病毒載體：牛痘病毒、腺病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒、桿狀病毒II、非病毒載體：質(zhì)粒（2)基因載體的導(dǎo)入和高效表達(dá)工程細(xì)胞株的篩選融合法：脂質(zhì)體化學(xué)法：磷酸鈣沉淀物理法：電轉(zhuǎn)、基因槍病毒法：DNA病毒、RNA病毒、多瘤病毒五、細(xì)胞庫(kù)的建立原始細(xì)胞庫(kù)：mastercellbank,MCB生產(chǎn)細(xì)胞庫(kù):manufacturer’sworkingbank,MFWB;Workingcellbank(WCB)一、培養(yǎng)基的基本要求營(yíng)養(yǎng)成分促生長(zhǎng)因子激素滲透壓

pH無毒、無污染第四節(jié)動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基1.營(yíng)養(yǎng)成分

氨基酸氨基酸是細(xì)胞合成蛋白質(zhì)的原料。所有細(xì)胞都需要12種必須氨基酸：

纈、亮、異亮、蘇、賴、色、苯丙、蛋、組、酪、精、胱。此外還需要谷氨酰胺，它在細(xì)胞代謝過程中有重要作用，所含的氮是核酸中嘌呤和嘧啶合成的來源，同樣也是合成三、二、一磷酸酰苷所需要的基本物質(zhì)。

單糖

培養(yǎng)中的細(xì)胞可以進(jìn)行有氧與無氧酵解，六碳糖是主要能源。此外六碳糖也是合成某些氨基酸、脂肪、核酸的原料。細(xì)胞對(duì)葡萄糖的吸收能力最高，半乳糖最低。一、培養(yǎng)基的基本要求1.營(yíng)養(yǎng)成分

維生素：

主要是輔酶、輔基，必不可少。生物素、葉酸、煙酰胺、泛酸、吡哆醇、核黃素、硫胺素、維生素B12都是培養(yǎng)基常有的成分。

無機(jī)離子與微量元素

細(xì)胞生長(zhǎng)除需要鈉、鉀、鈣、鎂、氮、磷等基本元素，還需要微量元素，如鐵、鋅、硒、銅、錳、鉬、釩等。一、培養(yǎng)基的基本要求2.

促生長(zhǎng)因子及激素

各種激素、生長(zhǎng)因子的功能維持細(xì)胞的功能保持細(xì)胞的狀態(tài)（分化或未分化）

有些激素對(duì)許多細(xì)胞生長(zhǎng)有促生長(zhǎng)作用，如胰島素，它能促進(jìn)細(xì)胞利用葡萄糖和氨基酸。

有些激素對(duì)某一類細(xì)胞有明顯促進(jìn)作用，如氫化可的松可促進(jìn)表皮細(xì)胞的生長(zhǎng)，泌乳素有促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞生長(zhǎng)作用等。一、培養(yǎng)基的基本要求3.

滲透壓

細(xì)胞必須生活在等滲環(huán)境中，大多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)滲透壓有一定耐受性人血漿滲透壓290mOsm/kg，可視為培養(yǎng)人體細(xì)胞的理想滲透壓鼠細(xì)胞滲透壓在320mOsm/kg左右。大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞，滲透壓在260～320mOsm/kg的范圍都適宜一、培養(yǎng)基的基本要求4.

pH

大多數(shù)細(xì)胞適宜pH為7.2～7.4培養(yǎng)基應(yīng)具一定的緩沖能力

造成pH波動(dòng)主要是代謝產(chǎn)生的CO2，在封閉式培養(yǎng)過程中CO2與水結(jié)合產(chǎn)生碳酸，培養(yǎng)基pH很快下降。

為解決這一問題，合成培養(yǎng)基中使用了NaHCO3-CO2緩沖系統(tǒng)，通過穩(wěn)定調(diào)節(jié)溫箱中CO2濃度（5％），使之與培養(yǎng)基中的NaHCO3

處于平衡狀態(tài)一、培養(yǎng)基的基本要求5.

無毒、無污染體外生長(zhǎng)的細(xì)胞對(duì)微生物及一些有害有毒物質(zhì)沒有任何抵抗能力，因此培養(yǎng)基應(yīng)達(dá)到

無化學(xué)物質(zhì)污染無微生物污染（如細(xì)菌、真菌、支原體、病毒等）無對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損傷作用的生物活性物質(zhì)污染（如抗體、補(bǔ)體）對(duì)于天然培養(yǎng)基，污染主要來源于取材過程及生物材料本身，應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格選材，嚴(yán)格操作。對(duì)于合成培養(yǎng)基，污染主要來源于配制過程，配制所用的水，器皿應(yīng)十分潔凈，配制后應(yīng)嚴(yán)格過濾除菌。一、培養(yǎng)基的基本要求天然培養(yǎng)基血清的種類血清的主要成分和作用血清的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)血清的外觀血清的使用與儲(chǔ)存使用血清的優(yōu)缺點(diǎn)二、天然培養(yǎng)基

天然培養(yǎng)基

天然培養(yǎng)基是指來自動(dòng)物體液或利用組織分離提取的一類培養(yǎng)基，如血漿、血清、淋巴液、雞胚浸出液等。

但是由于天然培養(yǎng)基制作過程復(fù)雜、批間差異大，因此逐漸為合成培養(yǎng)基所替代。

目前廣泛使用的培養(yǎng)基是血清，另外各種組織提取液、促進(jìn)細(xì)胞貼壁的膠原類物質(zhì)在培養(yǎng)某些特殊細(xì)胞也是必不可少。二、天然培養(yǎng)基

血清的種類

小牛血清

取自出生10～30天的小牛新牛血清

取自出生24小時(shí)之內(nèi)的新生牛胎牛血清

取自剖腹產(chǎn)的胎牛，血清中所含的抗體、補(bǔ)體等對(duì)細(xì)胞有害的成分最少二、天然培養(yǎng)基

二、天然培養(yǎng)基

血清的主要成分和作用

主要成分血清是由血漿去除纖維蛋白而形成的，血清中含有各種血漿蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生長(zhǎng)因子、激素、無機(jī)物等

主要作用

提供基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)

提供激素和各種生長(zhǎng)因子

提供結(jié)合蛋白

對(duì)培養(yǎng)中的細(xì)胞起到某些保護(hù)作用血清的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

血清質(zhì)量高低取決于兩方面因素：一是取材對(duì)象，二是取材過程。

理化性質(zhì)

滲透壓、pH值、蛋白電泳圖譜、蛋白含量、激素水平、內(nèi)毒素等。

蛋白含量包括血清總蛋白含量（不低于35-45g/L）、球蛋白含量（應(yīng)小于20g/L)、血紅蛋白含量等。其中球蛋白含量是一項(xiàng)非常重要的指標(biāo)，血清中球蛋白主要是抗體，球蛋白含量越低血清質(zhì)量越高。血紅蛋白也是越低越好。二、天然培養(yǎng)基血清的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

微生物檢測(cè)包括細(xì)菌、真菌、支原體、病毒等。特別是對(duì)支原體、病毒的檢測(cè)支原體是一種很小的微生物，可通過孔徑22mm的濾膜。支原體、病毒污染在光學(xué)顯微鏡下難于察覺，細(xì)胞也能生長(zhǎng)繁殖，但會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。檢測(cè)支原體的方法很多，如培養(yǎng)法、PCR法、熒光染色法、電鏡觀察法等。二、天然培養(yǎng)基血清的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

促生長(zhǎng)效果

這是血清重要的特性之一，應(yīng)以培養(yǎng)的細(xì)胞來檢測(cè)

克隆形成率懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞，有限稀釋法，統(tǒng)計(jì)克隆生長(zhǎng)百分比

貼瓶率測(cè)定

貼壁細(xì)胞，集落數(shù)占接種細(xì)胞數(shù)的百分比續(xù)傳代培養(yǎng)

細(xì)胞培養(yǎng)七天收集細(xì)胞，計(jì)數(shù)，取平均值。連續(xù)測(cè)試三個(gè)周期以上，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況。二、天然培養(yǎng)基血清的外觀好的血清應(yīng)該是透明清亮，土黃色或棕黃色，無沉淀或極少沉淀，比較粘稠。如血清渾濁、不透明、含許多沉淀物，說明血清污染或血清中的蛋白質(zhì)變性。若血清呈棕紅色，說明血清中的血紅蛋白含量太高，取材時(shí)有溶血現(xiàn)象搖晃時(shí)感覺液體稀薄，說明血清中摻入的生理鹽水太多。二、天然培養(yǎng)基血清的使用與儲(chǔ)存

使用前處理

滅活處理，即56℃30分鐘。滅活的目的使去除血清中的補(bǔ)體成分。

儲(chǔ)存條件血清一般儲(chǔ)存在-20℃，同時(shí)應(yīng)避免反復(fù)凍融。購(gòu)買大包裝的血清后首先要滅活處理，然后分裝成小包裝，儲(chǔ)存于-20℃，使用前融化。融化時(shí)最好現(xiàn)置于4℃。融化后的血清在4℃不宜長(zhǎng)時(shí)間存放，應(yīng)盡快使用。

使用濃度自從有了合成培養(yǎng)基，血清就是作為一種添加成分與合成培養(yǎng)基混合使用，使用濃度一般為5～20％，最常用是10％。二、天然培養(yǎng)基二、天然培養(yǎng)基使用血清的優(yōu)缺點(diǎn)牛血清的優(yōu)點(diǎn)

來源充足制備技術(shù)成熟經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間的應(yīng)用考驗(yàn)人們對(duì)其有比較深入的理解細(xì)胞培養(yǎng)中使用血清的缺點(diǎn)改變某種細(xì)胞在體內(nèi)的正常狀態(tài)

含有一些對(duì)細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生毒性的物質(zhì)

每批血清都有差別，其成分不能保持一致取材過程有可能帶入支原體、病毒三、合成培養(yǎng)基

基本培養(yǎng)基如何選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)基的配制無血清培養(yǎng)基無蛋白培養(yǎng)基限定化學(xué)成分培養(yǎng)基三、合成培養(yǎng)基

合成培養(yǎng)基是人工設(shè)計(jì)、配制的培養(yǎng)基。早期組織培養(yǎng)是利用天然培養(yǎng)基，目前合成培養(yǎng)基已經(jīng)成為一種標(biāo)準(zhǔn)化的商品，從最初的基本培養(yǎng)基發(fā)展到無血清培養(yǎng)基、無蛋白培養(yǎng)基，并且還在不斷發(fā)展。合成培養(yǎng)基的出現(xiàn)極大的促進(jìn)了組織培養(yǎng)技術(shù)的普及發(fā)展?；九囵B(yǎng)基

基本組分

無機(jī)鹽

CaCl2、KCl、MgSO4、NaCl、NaHCO3、NaH2PO4

氨基酸

纈、亮、異亮、蘇、賴、色、苯丙、蛋、組、酪、精、胱(L型)

維生素

偏多酸鈣、氯化膽堿、葉酸、肌醇、煙酰胺、吡哆醛、核黃素

硫胺素

碳水化合物

葡萄糖

除了以上與細(xì)胞生長(zhǎng)有關(guān)的物質(zhì)以外，培養(yǎng)基中一般還要加入一種pH指示劑酚紅（當(dāng)溶液酸性時(shí)pH小于6.8呈黃色；當(dāng)溶液堿性時(shí)pH大于8.4呈紅色）三、合成培養(yǎng)基

基本培養(yǎng)基

種類

MEM

僅含12

種必需氨基酸、谷氨酰胺，8種維生素及必要的無機(jī)鹽

由于成分簡(jiǎn)單，易于添加某種特殊成分適于某些特殊細(xì)胞培養(yǎng)

DMEM（Dulbecco‘smodifiedEaglemedium)在MEM培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上研制的。

與MEM比較增加了各種成分用量，分高糖型（低于4500g/L）和低糖型（低于1000g/L）高糖型有利于細(xì)胞停泊于一個(gè)位置生長(zhǎng)，適于生長(zhǎng)較快、附著較困難低腫瘤細(xì)胞。三、合成培養(yǎng)基

基本培養(yǎng)基

種類

IMDM（Iscove‘smodifiedDulbecco’smedium）含有

42種成分，與

DMEM

比較增加了許多非必須氨基酸及一些維生素，增加了HEPES，葡萄糖含量為高糖型。適合細(xì)胞密度較低、細(xì)胞生長(zhǎng)困難的情況，如細(xì)胞融合之后雜交細(xì)胞的篩選培養(yǎng)，DNA轉(zhuǎn)染后轉(zhuǎn)化細(xì)胞的篩選培養(yǎng)。

RPMI1640其組分較為簡(jiǎn)單，適合許多種細(xì)胞生長(zhǎng)，如腫瘤細(xì)胞、正常細(xì)胞、原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)等。是目前應(yīng)用最為廣泛的培養(yǎng)基之一。三、合成培養(yǎng)基

如何選擇培養(yǎng)基

選擇培養(yǎng)基沒有一定的標(biāo)準(zhǔn)，有幾點(diǎn)建議可供參考：

建立某種細(xì)胞株所用的培養(yǎng)基應(yīng)該是培養(yǎng)這種細(xì)胞首選的培養(yǎng)基。可以查閱參考文獻(xiàn)，或在購(gòu)買細(xì)胞株時(shí)咨詢。

根據(jù)細(xì)胞株的特點(diǎn)、實(shí)驗(yàn)的需要來選擇培養(yǎng)基。如小鼠細(xì)胞株多選RPMI1640；進(jìn)行細(xì)胞雜交、基因轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)，可選擇IMDM.

用多種培養(yǎng)基培養(yǎng)目的細(xì)胞，觀察其生長(zhǎng)狀態(tài)，可以用生長(zhǎng)曲線、集落形成率等指標(biāo)判斷，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇最佳培養(yǎng)基，這是最客觀的方法三、合成培養(yǎng)基

培養(yǎng)基的配制

目前在國(guó)內(nèi)市場(chǎng)主要是干粉型，應(yīng)正確配制，才能保證培養(yǎng)基質(zhì)量。配制培養(yǎng)基要注意以下問題：

認(rèn)真閱讀說明書。說明書都注明干粉不包含的成分，常見的有NaHCO3

谷氨酰胺、丙酮酸鈉、HEPES等。這些成分有些是必須添加的，有些根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要決定。

配制是要保證充分溶解，NaHCO3、谷氨酰胺等物質(zhì)都要等培養(yǎng)基完全溶解之后才能添加。配制所用的水應(yīng)是雙蒸水或三蒸水，離子濃度很低，三蒸水最佳。所用器皿應(yīng)嚴(yán)格消毒。配制好的培養(yǎng)基應(yīng)馬上過濾除菌，無菌保存于4℃。三、合成培養(yǎng)基

無血清培養(yǎng)基

無血清培養(yǎng)基即不需要添加血清就可以維持細(xì)胞在體外較長(zhǎng)時(shí)間生長(zhǎng)繁殖的合成培養(yǎng)基。雖然基礎(chǔ)培養(yǎng)基加少量血清所配制的完全培養(yǎng)基可以滿足大部分細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的要求，但對(duì)有些實(shí)驗(yàn)卻不適合，如觀察一種生長(zhǎng)因子對(duì)某種細(xì)胞的作用，這時(shí)需要排除其他生長(zhǎng)因子的干擾作用。而血清中可能含有各種生長(zhǎng)因子；又如需要測(cè)定某種細(xì)胞在培養(yǎng)過程中分泌某種物質(zhì)（抗體、生長(zhǎng)因子）的能力；或者要大規(guī)模的培養(yǎng)某種細(xì)胞，以獲得它們的分泌產(chǎn)物。三、合成培養(yǎng)基

無血清培養(yǎng)基無血清培養(yǎng)基的基本配方

基礎(chǔ)培養(yǎng)基及添加組分兩大部分。基礎(chǔ)培養(yǎng)液以HamF12和DMEM最為常用，一般兩者以1:1混合。添加組分包括以下幾大類物質(zhì)：

促貼壁物質(zhì)

貼壁細(xì)胞，無血清培養(yǎng)基中一定要添加促貼壁和擴(kuò)展因子

促生長(zhǎng)因子及激素

針對(duì)不同細(xì)胞添加不同的生長(zhǎng)因子。激素也是刺激細(xì)胞生長(zhǎng)、維持細(xì)胞功能的重要物質(zhì)，有些激素是許多細(xì)胞必不可少的，如胰島素三、合成培養(yǎng)基

無血清培養(yǎng)基無血清培養(yǎng)基的基本配方

酶抑制劑

培養(yǎng)貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞，需要用胰酶消化傳代，在無血清培養(yǎng)基中必不可少須含酶抑制劑，以終止酶的消化作用，達(dá)到保護(hù)細(xì)胞的目的最常用的是大豆胰酶抑制劑。

結(jié)合蛋白和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白

轉(zhuǎn)鐵蛋白和牛血清白蛋白。牛血清白蛋白的添加比較大，可增加培養(yǎng)基的粘度，保護(hù)細(xì)胞免受機(jī)械損傷。許多旋轉(zhuǎn)式培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基都含有牛血清白蛋白。

微量元素

硒是最常見的。三、合成培養(yǎng)基

無蛋白培養(yǎng)基（proteinfreemidium，PFM）

無蛋白培養(yǎng)基即不含有動(dòng)物蛋白的培養(yǎng)基。無血清培養(yǎng)基仍含有較多的動(dòng)物蛋白，如胰島素，轉(zhuǎn)鐵蛋白、牛血清白蛋白等。從生物技術(shù)發(fā)展的趨勢(shì)來看，不含動(dòng)物蛋白的培養(yǎng)基有廣泛的應(yīng)用前景，許多利用基因工程技術(shù)重組的蛋白質(zhì)最終要應(yīng)用于人體，如果在生長(zhǎng)過程中使用了含有動(dòng)物蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基，純化過程就比較復(fù)雜，最終要達(dá)到一定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)也有一定的難度無蛋白培養(yǎng)基就是為了適應(yīng)這發(fā)展趨勢(shì)而出現(xiàn)的，許多無蛋白培養(yǎng)基添加了植物水解物以替代動(dòng)物激素、生長(zhǎng)因子的作用。目前已經(jīng)有適合于CHO細(xì)胞生長(zhǎng)的PFM。PFM只適合于懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞。三、合成培養(yǎng)基

限定化學(xué)成分培養(yǎng)基（chemicaldefinedmedium，CDM）

限定化學(xué)成分培養(yǎng)基（CDM）是指培養(yǎng)基中的所有成分都是明確的。它不含有動(dòng)物蛋白，也不添加植物水解物，而是使用了一些已知結(jié)構(gòu)與功能的小分子化合物，如短肽、植物激素等。這種培養(yǎng)基更有利于分析細(xì)胞的分泌產(chǎn)物。目前已經(jīng)有適合于293細(xì)胞、CHO細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的CDM。CDM只適合于懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞三、合成培養(yǎng)基

四、其他培養(yǎng)用液平衡鹽溶液消化液pH調(diào)整液平衡鹽溶液（balancedsaltsolution，BSS）

組成平衡鹽溶液主要是由無機(jī)鹽、葡萄糖組成

作用是維持細(xì)胞滲透壓平衡，保持pH穩(wěn)定及提供簡(jiǎn)單的營(yíng)養(yǎng)

用途主要用于取材時(shí)組織塊的漂洗、細(xì)胞的漂洗、配制其他試劑配制溶液應(yīng)使用雙蒸水或去離子水。如果配方中含有Ca2+、Mg2+，應(yīng)當(dāng)首先溶解這些成分。配好的平衡鹽溶液可以過濾除菌或高溫滅菌四、其他培養(yǎng)用液消化液

用途

取材進(jìn)行原代培養(yǎng)時(shí)需要將組織塊消化解離形成細(xì)胞懸液傳代培養(yǎng)時(shí)也需要將貼壁細(xì)胞從瓶壁上消化下來

胰酶溶液

胰酶的活性可以用消化酪蛋白的能力表示，常見1:125和1:250組織培養(yǎng)用的胰酶溶液一般配制成0.1～0.25%的濃度，配制時(shí)要用不含Ca2+、Mg2+及血清的平衡鹽溶液胰酶作用及溶解的最佳pH8～9，配制胰酶溶液應(yīng)將液體調(diào)至pH8過濾除菌。四、其他培養(yǎng)用液消化液

EDTA溶液EDTA溶液也常用來解離細(xì)胞，它的作用機(jī)制是破壞細(xì)胞間的連接。對(duì)于一些貼壁特別牢固的細(xì)胞，還可以用EDTA和胰酶的混合液進(jìn)行消化EDTA

溶液的使用濃度為

0.02%，配制時(shí)應(yīng)加堿助溶，配制后可過濾除菌，也可高溫消毒滅菌。膠原酶溶液

膠原酶在上皮類細(xì)胞原代培養(yǎng)時(shí)經(jīng)常使用，膠原酶作用的對(duì)象是膠原組織，因此不容易對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損傷。膠原酶的使用濃度為0.1～0.3mg/L或200000U/L，作用的最佳pH6.5膠原酶不受Ca2+、Mg2+及血清的抑制，配制時(shí)可用PBS。四、其他培養(yǎng)用液pH調(diào)整液

NaHCO3溶液NaHCO3是培養(yǎng)基中必須添加的成分，一般情況下按說明書的要求準(zhǔn)確添加，以保證培養(yǎng)基在5%CO2的環(huán)境下pH達(dá)到設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)。如果是封閉式培養(yǎng)，即不與5%CO2的環(huán)境發(fā)生交換達(dá)到平衡，所使用的培養(yǎng)基就不能按照說明書所要求加入NaHCO3。此時(shí)常用

5.6%或7.4%的NaHCO3溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基，使之達(dá)到所要求的pH環(huán)境。

HEPES溶液HEPES（羥乙基哌嗪乙硫磺酸）是一種弱酸，對(duì)細(xì)胞無毒性，主要作用是防止培養(yǎng)基pH迅速變動(dòng)。在開放式培養(yǎng)條件下，觀察細(xì)胞時(shí)培養(yǎng)基脫離了5%CO2的環(huán)境CO2

氣體迅速逸出，pH迅速升高，若加了HEPES，此時(shí)可以維持pH7.0左右。一般在進(jìn)行克隆化培養(yǎng)時(shí)要添加HEPES。四、其他培養(yǎng)用液抗生素

常用的是青霉素和鏈霉素，俗稱“雙抗溶液”。青霉素主要是對(duì)革蘭陽性菌有效，鏈霉素主要對(duì)革蘭陰性菌有效。加入這兩種抗生素可預(yù)防絕大多數(shù)細(xì)菌污染。一般使用青霉素終濃度0.007～0.008g/100ml，鏈霉素終濃0.01g/100ml配制成100倍濃縮液，可用PBS或培養(yǎng)基配制。四、其他培養(yǎng)用液五、環(huán)境和消毒細(xì)胞培養(yǎng)中常用的儀器設(shè)備

無菌室超凈工作臺(tái)三重純水蒸餾器抽氣泵壓力蒸氣消毒器電熱恒溫培養(yǎng)箱CO2培養(yǎng)箱恒溫水浴鍋倒置顯微鏡離心機(jī)無菌過濾器洗刷裝置細(xì)胞計(jì)數(shù)板和電子細(xì)胞技術(shù)儀五、環(huán)境和消毒細(xì)胞培養(yǎng)的無菌環(huán)境

無菌室

無菌室的結(jié)構(gòu)一般由更衣間、緩沖間、操作間三部分組成。無菌室的消毒和防污染為保持無菌狀態(tài)，經(jīng)常消毒是必要的，通常采用每日（使用前紫外照射（1～2小時(shí)），每周甲醛、乳酸、過氧乙酸熏蒸（2小時(shí)）

和

每月新潔爾滅擦拭地面和墻壁一次的方式進(jìn)行消毒。應(yīng)注意防止無菌室的污染。造成無菌室污染的可能包括：送入無菌室的風(fēng)沒有被過濾除菌；進(jìn)出無菌室時(shí)，能使外界空氣直接對(duì)流進(jìn)無菌室的操作間等。五、環(huán)境和消毒細(xì)胞培養(yǎng)的無菌環(huán)境

超凈工作臺(tái)

工作原理鼓風(fēng)機(jī)驅(qū)動(dòng)空氣通過高效過濾器得以凈化，凈化的空氣被徐徐吹過臺(tái)面空間而將其中的塵埃、細(xì)菌甚至病毒顆粒帶走，使工作區(qū)構(gòu)成無菌環(huán)境。根據(jù)氣流在超凈工作臺(tái)的流動(dòng)方向不同，可將超凈工作臺(tái)分為側(cè)流式

直流式和外流式三種類型。五、環(huán)境和消毒細(xì)胞培養(yǎng)的無菌環(huán)境

超凈工作臺(tái)

超凈臺(tái)的使用與保養(yǎng)

超凈臺(tái)的平均風(fēng)速保持在0.32～0.48米/秒為宜，過大、過小均不利于保持凈化度。使用前最好開啟超凈臺(tái)內(nèi)紫外燈照射10～30分鐘，然后讓超凈臺(tái)預(yù)工作10～15分鐘，以除去臭氧和使用工作臺(tái)面空間呈凈化狀態(tài)使用完畢后，要用70%酒精將臺(tái)面和臺(tái)內(nèi)四周擦拭干凈，以保證超凈臺(tái)無菌。還要定期用甲醛熏蒸超凈臺(tái)五、環(huán)境和消毒常用培養(yǎng)器皿及清洗消毒

細(xì)胞培養(yǎng)需要大量消耗性物品，如玻璃器皿、金屬器皿、塑料、橡膠制品、布類、紙類等，因此掌握清洗、消毒知識(shí)，學(xué)會(huì)清洗、消毒方法是學(xué)習(xí)和從事細(xì)胞培養(yǎng)工作必須的。五、環(huán)境和消毒常用培養(yǎng)器皿及清洗

玻璃器皿的清洗

浸泡

新玻璃器皿使用前得先用自來水簡(jiǎn)單刷洗，然后用

5％

鹽酸浸泡過夜；用過的玻璃器皿往往附有大量蛋白質(zhì)和油脂，干涸后不易刷洗掉，故用后應(yīng)立即浸入清水中備刷洗。

刷洗

將浸泡后的玻璃器皿放到洗滌劑水中，用軟毛刷反復(fù)刷洗。不要留死角，并防止破壞器皿表面的光潔度。將刷洗干凈的玻璃器皿洗凈、晾干，備浸酸。

浸酸

浸酸是將上述器皿浸泡到清潔液中，又稱酸液，通過酸液的強(qiáng)氧化作用清除器皿表面的可能殘留物質(zhì)。浸酸不應(yīng)少于六小時(shí)一般過夜或更長(zhǎng)。

沖洗

刷洗和浸酸后的器皿都必須用水充分沖洗，浸酸后器皿是否沖洗的干凈，直接影響到細(xì)胞培養(yǎng)的成敗。手工洗滌浸酸后的器皿，每件器皿至少要反復(fù)“注水－倒空”15次以上，最后用重蒸水浸洗2～3次，晾干或烘干后包裝備用。五、環(huán)境和消毒常用培養(yǎng)器皿及清洗

橡膠制品清洗新的橡膠制品洗滌方法：0.5mol/LNaOH煮沸15分鐘，流水沖洗，0.5mol/LHCl煮沸15分鐘，流水沖洗，自來水煮沸2次，蒸餾水煮沸20分鐘，50℃烤干備用。塑料制品的清洗塑料制品特點(diǎn)：質(zhì)軟、易出現(xiàn)劃痕；耐腐蝕能力強(qiáng)、但不耐熱。清洗程序：使用器皿后立即用清水清洗，浸于自來水中過夜，用紗布或棉簽和50℃清洗液刷洗，流水沖洗，晾干，浸于清潔液中15分鐘，流水沖洗（15～20遍），蒸餾水浸洗三次，雙蒸水中泡24小時(shí)，晾干備用。五、環(huán)境和消毒消毒和滅菌

紫外線消毒

殺菌對(duì)象：紫外線可以殺死多種微生物。其中，革蘭陰性菌最為敏感其次是陽性菌，再次為芽孢，真菌孢子的抵抗力最強(qiáng)。

殺菌機(jī)制：紫外線是一種低能量的電磁輻射，直接作用是通過破壞微生物的核酸及蛋白質(zhì)等而使其滅活，間接作用是通過紫外線照射產(chǎn)生的臭氧殺死微生物。

使用范圍：目前多用紫外線直接照射培養(yǎng)室進(jìn)行消毒，用法簡(jiǎn)單，效果好五、環(huán)境和消毒消毒和滅菌

紫外線消毒

使用方法：紫外燈的消毒效果同紫外燈的輻射強(qiáng)度和照射劑量呈正相關(guān)，輻射強(qiáng)度隨燈距離增加而降低，照射劑量和照射時(shí)間呈正比。因此紫外燈同被照射物的距離和照射時(shí)間要適合離地面2米的30W燈可照射9平方米房間，每天照射2～3小時(shí)，期間可間隔30分鐘。燈管離地面2米以外要延長(zhǎng)照射時(shí)間，2.5米照射效果較差。紫外燈照射工作臺(tái)的距離不應(yīng)超過1.5米，照射時(shí)間30分鐘為宜。注意事項(xiàng)：紫外燈不僅對(duì)皮膚、眼睛傷害，而且對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞與試劑等也產(chǎn)生不良影響，因此，不要開著紫外等操作。五、環(huán)境