第四章動物細胞工程制藥(1)-生物技術(shù)制藥

動物細胞工程制藥主要內(nèi)容細胞概述……了解動物細胞的形態(tài)和生理特性

……熟悉生產(chǎn)用動物細胞的要求和獲得

……掌握動物細胞的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基……掌握動物細胞培養(yǎng)的基本方法動物細胞大量培養(yǎng)的方法和操作方式

動物細胞生物反應(yīng)器

動物細胞產(chǎn)品的純化方法和質(zhì)量要求

動物細胞產(chǎn)品的制造實例

動物細胞制藥的前景與展望

一、細胞概述歷史與現(xiàn)狀細胞在生物制藥中的意義大腸桿菌細胞硅藻植物細胞模式圖百合花花瓣動物細胞掃描電鏡圖動物細胞模式圖原核細胞與真核細胞區(qū)別原核細胞真核細胞細胞大小較小較大細胞核無成形的細胞核，核物質(zhì)集中在核區(qū)。無核膜，無核仁。DNA不與蛋白質(zhì)結(jié)合。有成形的真正的細胞核。有核膜，有核仁。DNA與蛋白質(zhì)形成染色體。細胞質(zhì)除核糖體外，無其它的細胞器。有各種細胞器。細胞壁有。主要是肽聚糖。植物細胞、真菌有，動物細胞無。代表生物放線菌、細菌、藍藻、衣原體真菌、植物、動物第二節(jié)動物細胞的形態(tài)與生理特性1.貼壁細胞的生長特征成纖維細胞人胃腺癌細胞2.懸浮細胞的生長特征白細胞細胞：K562腹水瘤細胞：Ehrlich腹水瘤細胞EAC3.兼性貼壁細胞CHO－K1CHO-K1動物細胞的化學(xué)組成與代謝大分子：蛋白質(zhì)核酸糖脂質(zhì)大分子代謝的三個階段三大營養(yǎng)素水解為單體中間產(chǎn)物的生成三羧酸循環(huán)產(chǎn)能代謝：三羧酸循環(huán)葡萄糖產(chǎn)能對比供氧不足：糖酵解途徑2ATP;供氧充分：三羧酸循環(huán)36～38ATP；動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)：供氧成為生物反應(yīng)器設(shè)計的最重要的因素之一！動物細胞的生理特點細胞的分裂周期長：12～18h細胞生長需貼附于基質(zhì)，并有接觸抑制現(xiàn)象；正常二倍體細胞的生長壽命有限；動物細胞對周圍環(huán)境敏感；動物細胞對培養(yǎng)基的要求高；動物細胞對蛋白質(zhì)的合成途徑和修飾功能與細菌不同。各類細胞周期時間表細胞生長需貼附于基質(zhì)，并有接觸抑制現(xiàn)象：在玻璃、塑料等基質(zhì)上生長，與電荷、鈣鎂離子、貼附因子（collagen，F(xiàn)ibronectin）有關(guān)。無血清培養(yǎng)基：少！血清、塑料瓶/玻璃瓶，生長密度80％左右為佳。及時傳代！正常二倍體細胞的壽命有限原代培養(yǎng)：離體培養(yǎng)開始的時間稱“原代培養(yǎng)”；經(jīng)若干代之后細胞趨于死亡。成纖維細胞～50代，加入表皮生長因子～150代。轉(zhuǎn)化成異常體后～無限細胞系，成為“永生化”細胞。動物細胞對周圍環(huán)境十分敏感細胞膜對理化因素：滲透壓，pH,離子濃度，剪切力，微量元素等敏感。一切導(dǎo)致脂質(zhì)和蛋白質(zhì)變性的因素都影響動物細胞的存活動物細胞對培養(yǎng)基的要求高原核細胞：碳源：葡萄糖，麥芽糖，淀粉，氮源：蛋白胨，玉米漿，酵母粉；無機鹽：PO4,,Na,K+,Fe++,動物細胞：營養(yǎng)要求高！12種必需氨基酸，8種以上維生素，多種無機鹽，微量元素，碳源：葡萄糖，多種細胞因子，貼壁因子，血清。動物細胞對蛋白質(zhì)的合成途徑和修飾功能與細菌不同既在游離核糖體（細胞質(zhì)基質(zhì)蛋白）上合成，更多的在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（分泌蛋白，整合蛋白，N-linkedglycoprotein）上進行。多數(shù)為糖蛋白。,高爾基體（O-linkedglycoprotein）。蛋白質(zhì)的糖基化與細胞功能密切相關(guān)：細胞識別，胞內(nèi)消化，外排分泌物。因此，有些生物藥品不能用原核細胞表達：EPO動物細胞來源的生物藥物比重越來越大！第三節(jié)生產(chǎn)用動物細胞的要求和獲得一、生產(chǎn)用動物細胞的要求：正常組織的原代細胞：雞胚、兔腎細胞等多次傳代的二倍體細胞：WI-38,2BS，Namalwa細胞：干擾素Vero細胞：狂犬病疫苗、脊髓灰質(zhì)炎癥疫苗雜交瘤細胞：OKT-3mAb逐步取消了非二倍體細胞的限制DNA殘留量的檢測！二、生產(chǎn)用動物細胞的獲得原代細胞二倍體細胞轉(zhuǎn)化細胞系融合細胞系重組工程細胞系原代細胞最無爭議的細胞，但費時，費力，成本高，如：雞胚細胞，原代兔腎或鼠腎細胞，淋巴細胞等；2.二倍體細胞：原代細胞的馴化產(chǎn)物，仍具正常細胞的特點：2n核型，貼壁依賴，接觸抑制，有限增殖（50代以內(nèi)），無致瘤性。代表性細胞株：WI－38，MRC-5，2BS；3.轉(zhuǎn)化細胞系：正常細胞的自發(fā)轉(zhuǎn)化，人為轉(zhuǎn)化（SV40，甲基膽蒽）SV40，即猿猴空泡病毒40（Simianvacuolatingvirus40），是一種多瘤病毒，也是一種DNA病毒，有造成腫瘤發(fā)生的潛在能力。代表細胞株：Namalwa,CHO,BHK-21,Vero4.融合細胞系：兩個或兩個以上細胞融合而成。——受精。動物－動物細胞，動物－植物細胞；誘導(dǎo)物：（1）仙臺病毒：副流感病毒I型。方法：4oC聚集，37oC反應(yīng)，細胞穿通，細胞融合。以經(jīng)很少使用。（2）聚乙二醇PEG:分子量1000，濃度50％，Ph8.0~8.2,融合率近100％。單抗生產(chǎn)中使用。（3）電融合：電場0.5～1.5V，脈沖1～50μs。5.基因工程技術(shù)構(gòu)建重組工程細胞

（1）真核細胞基因表達載體的構(gòu)建I、病毒載體：牛痘病毒、腺病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒、桿狀病毒II、非病毒載體：質(zhì)粒（2)基因載體的導(dǎo)入和高效表達工程細胞株的篩選融合法：脂質(zhì)體化學(xué)法：磷酸鈣沉淀物理法：電轉(zhuǎn)、基因槍病毒法：DNA病毒、RNA病毒、多瘤病毒五、細胞庫的建立原始細胞庫：mastercellbank,MCB生產(chǎn)細胞庫:manufacturer’sworkingbank,MFWB;Workingcellbank(WCB)一、培養(yǎng)基的基本要求營養(yǎng)成分促生長因子激素滲透壓

pH無毒、無污染第四節(jié)動物細胞的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基1.營養(yǎng)成分

氨基酸氨基酸是細胞合成蛋白質(zhì)的原料。所有細胞都需要12種必須氨基酸：

纈、亮、異亮、蘇、賴、色、苯丙、蛋、組、酪、精、胱。此外還需要谷氨酰胺，它在細胞代謝過程中有重要作用，所含的氮是核酸中嘌呤和嘧啶合成的來源，同樣也是合成三、二、一磷酸酰苷所需要的基本物質(zhì)。

單糖

培養(yǎng)中的細胞可以進行有氧與無氧酵解，六碳糖是主要能源。此外六碳糖也是合成某些氨基酸、脂肪、核酸的原料。細胞對葡萄糖的吸收能力最高，半乳糖最低。一、培養(yǎng)基的基本要求1.營養(yǎng)成分

維生素：

主要是輔酶、輔基，必不可少。生物素、葉酸、煙酰胺、泛酸、吡哆醇、核黃素、硫胺素、維生素B12都是培養(yǎng)基常有的成分。

無機離子與微量元素

細胞生長除需要鈉、鉀、鈣、鎂、氮、磷等基本元素，還需要微量元素，如鐵、鋅、硒、銅、錳、鉬、釩等。一、培養(yǎng)基的基本要求2.

促生長因子及激素

各種激素、生長因子的功能維持細胞的功能保持細胞的狀態(tài)（分化或未分化）

有些激素對許多細胞生長有促生長作用，如胰島素，它能促進細胞利用葡萄糖和氨基酸。

有些激素對某一類細胞有明顯促進作用，如氫化可的松可促進表皮細胞的生長，泌乳素有促進乳腺上皮細胞生長作用等。一、培養(yǎng)基的基本要求3.

滲透壓

細胞必須生活在等滲環(huán)境中，大多數(shù)培養(yǎng)細胞對滲透壓有一定耐受性人血漿滲透壓290mOsm/kg，可視為培養(yǎng)人體細胞的理想滲透壓鼠細胞滲透壓在320mOsm/kg左右。大多數(shù)哺乳動物細胞，滲透壓在260～320mOsm/kg的范圍都適宜一、培養(yǎng)基的基本要求4.

pH

大多數(shù)細胞適宜pH為7.2～7.4培養(yǎng)基應(yīng)具一定的緩沖能力

造成pH波動主要是代謝產(chǎn)生的CO2，在封閉式培養(yǎng)過程中CO2與水結(jié)合產(chǎn)生碳酸，培養(yǎng)基pH很快下降。

為解決這一問題，合成培養(yǎng)基中使用了NaHCO3-CO2緩沖系統(tǒng)，通過穩(wěn)定調(diào)節(jié)溫箱中CO2濃度（5％），使之與培養(yǎng)基中的NaHCO3

處于平衡狀態(tài)一、培養(yǎng)基的基本要求5.

無毒、無污染體外生長的細胞對微生物及一些有害有毒物質(zhì)沒有任何抵抗能力，因此培養(yǎng)基應(yīng)達到

無化學(xué)物質(zhì)污染無微生物污染（如細菌、真菌、支原體、病毒等）無對細胞產(chǎn)生損傷作用的生物活性物質(zhì)污染（如抗體、補體）對于天然培養(yǎng)基，污染主要來源于取材過程及生物材料本身，應(yīng)當嚴格選材，嚴格操作。對于合成培養(yǎng)基，污染主要來源于配制過程，配制所用的水，器皿應(yīng)十分潔凈，配制后應(yīng)嚴格過濾除菌。一、培養(yǎng)基的基本要求天然培養(yǎng)基血清的種類血清的主要成分和作用血清的質(zhì)量標準血清的外觀血清的使用與儲存使用血清的優(yōu)缺點二、天然培養(yǎng)基

天然培養(yǎng)基

天然培養(yǎng)基是指來自動物體液或利用組織分離提取的一類培養(yǎng)基，如血漿、血清、淋巴液、雞胚浸出液等。

但是由于天然培養(yǎng)基制作過程復(fù)雜、批間差異大，因此逐漸為合成培養(yǎng)基所替代。

目前廣泛使用的培養(yǎng)基是血清，另外各種組織提取液、促進細胞貼壁的膠原類物質(zhì)在培養(yǎng)某些特殊細胞也是必不可少。二、天然培養(yǎng)基

血清的種類

小牛血清

取自出生10～30天的小牛新牛血清

取自出生24小時之內(nèi)的新生牛胎牛血清

取自剖腹產(chǎn)的胎牛，血清中所含的抗體、補體等對細胞有害的成分最少二、天然培養(yǎng)基

二、天然培養(yǎng)基

血清的主要成分和作用

主要成分血清是由血漿去除纖維蛋白而形成的，血清中含有各種血漿蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生長因子、激素、無機物等

主要作用

提供基本營養(yǎng)物質(zhì)

提供激素和各種生長因子

提供結(jié)合蛋白

對培養(yǎng)中的細胞起到某些保護作用血清的質(zhì)量標準

血清質(zhì)量高低取決于兩方面因素：一是取材對象，二是取材過程。

理化性質(zhì)

滲透壓、pH值、蛋白電泳圖譜、蛋白含量、激素水平、內(nèi)毒素等。

蛋白含量包括血清總蛋白含量（不低于35-45g/L）、球蛋白含量（應(yīng)小于20g/L)、血紅蛋白含量等。其中球蛋白含量是一項非常重要的指標，血清中球蛋白主要是抗體，球蛋白含量越低血清質(zhì)量越高。血紅蛋白也是越低越好。二、天然培養(yǎng)基血清的質(zhì)量標準

微生物檢測包括細菌、真菌、支原體、病毒等。特別是對支原體、病毒的檢測支原體是一種很小的微生物，可通過孔徑22mm的濾膜。支原體、病毒污染在光學(xué)顯微鏡下難于察覺，細胞也能生長繁殖，但會影響實驗結(jié)果。檢測支原體的方法很多，如培養(yǎng)法、PCR法、熒光染色法、電鏡觀察法等。二、天然培養(yǎng)基血清的質(zhì)量標準

促生長效果

這是血清重要的特性之一，應(yīng)以培養(yǎng)的細胞來檢測

克隆形成率懸浮生長的細胞，有限稀釋法，統(tǒng)計克隆生長百分比

貼瓶率測定

貼壁細胞，集落數(shù)占接種細胞數(shù)的百分比續(xù)傳代培養(yǎng)

細胞培養(yǎng)七天收集細胞，計數(shù)，取平均值。連續(xù)測試三個周期以上，觀察細胞生長狀況。二、天然培養(yǎng)基血清的外觀好的血清應(yīng)該是透明清亮，土黃色或棕黃色，無沉淀或極少沉淀，比較粘稠。如血清渾濁、不透明、含許多沉淀物，說明血清污染或血清中的蛋白質(zhì)變性。若血清呈棕紅色，說明血清中的血紅蛋白含量太高，取材時有溶血現(xiàn)象搖晃時感覺液體稀薄，說明血清中摻入的生理鹽水太多。二、天然培養(yǎng)基血清的使用與儲存

使用前處理

滅活處理，即56℃30分鐘。滅活的目的使去除血清中的補體成分。

儲存條件血清一般儲存在-20℃，同時應(yīng)避免反復(fù)凍融。購買大包裝的血清后首先要滅活處理，然后分裝成小包裝，儲存于-20℃，使用前融化。融化時最好現(xiàn)置于4℃。融化后的血清在4℃不宜長時間存放，應(yīng)盡快使用。

使用濃度自從有了合成培養(yǎng)基，血清就是作為一種添加成分與合成培養(yǎng)基混合使用，使用濃度一般為5～20％，最常用是10％。二、天然培養(yǎng)基二、天然培養(yǎng)基使用血清的優(yōu)缺點牛血清的優(yōu)點

來源充足制備技術(shù)成熟經(jīng)過長時間的應(yīng)用考驗人們對其有比較深入的理解細胞培養(yǎng)中使用血清的缺點改變某種細胞在體內(nèi)的正常狀態(tài)

含有一些對細胞會產(chǎn)生毒性的物質(zhì)

每批血清都有差別，其成分不能保持一致取材過程有可能帶入支原體、病毒三、合成培養(yǎng)基

基本培養(yǎng)基如何選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)基的配制無血清培養(yǎng)基無蛋白培養(yǎng)基限定化學(xué)成分培養(yǎng)基三、合成培養(yǎng)基

合成培養(yǎng)基是人工設(shè)計、配制的培養(yǎng)基。早期組織培養(yǎng)是利用天然培養(yǎng)基，目前合成培養(yǎng)基已經(jīng)成為一種標準化的商品，從最初的基本培養(yǎng)基發(fā)展到無血清培養(yǎng)基、無蛋白培養(yǎng)基，并且還在不斷發(fā)展。合成培養(yǎng)基的出現(xiàn)極大的促進了組織培養(yǎng)技術(shù)的普及發(fā)展?；九囵B(yǎng)基

基本組分

無機鹽

CaCl2、KCl、MgSO4、NaCl、NaHCO3、NaH2PO4

氨基酸

纈、亮、異亮、蘇、賴、色、苯丙、蛋、組、酪、精、胱(L型)

維生素

偏多酸鈣、氯化膽堿、葉酸、肌醇、煙酰胺、吡哆醛、核黃素

硫胺素

碳水化合物

葡萄糖

除了以上與細胞生長有關(guān)的物質(zhì)以外，培養(yǎng)基中一般還要加入一種pH指示劑酚紅（當溶液酸性時pH小于6.8呈黃色；當溶液堿性時pH大于8.4呈紅色）三、合成培養(yǎng)基

基本培養(yǎng)基

種類

MEM

僅含12

種必需氨基酸、谷氨酰胺，8種維生素及必要的無機鹽

由于成分簡單，易于添加某種特殊成分適于某些特殊細胞培養(yǎng)

DMEM（Dulbecco‘smodifiedEaglemedium)在MEM培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上研制的。

與MEM比較增加了各種成分用量，分高糖型（低于4500g/L）和低糖型（低于1000g/L）高糖型有利于細胞停泊于一個位置生長，適于生長較快、附著較困難低腫瘤細胞。三、合成培養(yǎng)基

基本培養(yǎng)基

種類

IMDM（Iscove‘smodifiedDulbecco’smedium）含有

42種成分，與

DMEM

比較增加了許多非必須氨基酸及一些維生素，增加了HEPES，葡萄糖含量為高糖型。適合細胞密度較低、細胞生長困難的情況，如細胞融合之后雜交細胞的篩選培養(yǎng)，DNA轉(zhuǎn)染后轉(zhuǎn)化細胞的篩選培養(yǎng)。

RPMI1640其組分較為簡單，適合許多種細胞生長，如腫瘤細胞、正常細胞、原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)等。是目前應(yīng)用最為廣泛的培養(yǎng)基之一。三、合成培養(yǎng)基

如何選擇培養(yǎng)基

選擇培養(yǎng)基沒有一定的標準，有幾點建議可供參考：

建立某種細胞株所用的培養(yǎng)基應(yīng)該是培養(yǎng)這種細胞首選的培養(yǎng)基?？梢圆殚唴⒖嘉墨I，或在購買細胞株時咨詢。

根據(jù)細胞株的特點、實驗的需要來選擇培養(yǎng)基。如小鼠細胞株多選RPMI1640；進行細胞雜交、基因轉(zhuǎn)移實驗，可選擇IMDM.

用多種培養(yǎng)基培養(yǎng)目的細胞，觀察其生長狀態(tài)，可以用生長曲線、集落形成率等指標判斷，根據(jù)實驗結(jié)果選擇最佳培養(yǎng)基，這是最客觀的方法三、合成培養(yǎng)基

培養(yǎng)基的配制

目前在國內(nèi)市場主要是干粉型，應(yīng)正確配制，才能保證培養(yǎng)基質(zhì)量。配制培養(yǎng)基要注意以下問題：

認真閱讀說明書。說明書都注明干粉不包含的成分，常見的有NaHCO3

谷氨酰胺、丙酮酸鈉、HEPES等。這些成分有些是必須添加的，有些根據(jù)實驗需要決定。

配制是要保證充分溶解，NaHCO3、谷氨酰胺等物質(zhì)都要等培養(yǎng)基完全溶解之后才能添加。配制所用的水應(yīng)是雙蒸水或三蒸水，離子濃度很低，三蒸水最佳。所用器皿應(yīng)嚴格消毒。配制好的培養(yǎng)基應(yīng)馬上過濾除菌，無菌保存于4℃。三、合成培養(yǎng)基

無血清培養(yǎng)基

無血清培養(yǎng)基即不需要添加血清就可以維持細胞在體外較長時間生長繁殖的合成培養(yǎng)基。雖然基礎(chǔ)培養(yǎng)基加少量血清所配制的完全培養(yǎng)基可以滿足大部分細胞培養(yǎng)實驗的要求，但對有些實驗卻不適合，如觀察一種生長因子對某種細胞的作用，這時需要排除其他生長因子的干擾作用。而血清中可能含有各種生長因子；又如需要測定某種細胞在培養(yǎng)過程中分泌某種物質(zhì)（抗體、生長因子）的能力；或者要大規(guī)模的培養(yǎng)某種細胞，以獲得它們的分泌產(chǎn)物。三、合成培養(yǎng)基

無血清培養(yǎng)基無血清培養(yǎng)基的基本配方

基礎(chǔ)培養(yǎng)基及添加組分兩大部分。基礎(chǔ)培養(yǎng)液以HamF12和DMEM最為常用，一般兩者以1:1混合。添加組分包括以下幾大類物質(zhì)：

促貼壁物質(zhì)

貼壁細胞，無血清培養(yǎng)基中一定要添加促貼壁和擴展因子

促生長因子及激素

針對不同細胞添加不同的生長因子。激素也是刺激細胞生長、維持細胞功能的重要物質(zhì)，有些激素是許多細胞必不可少的，如胰島素三、合成培養(yǎng)基

無血清培養(yǎng)基無血清培養(yǎng)基的基本配方

酶抑制劑

培養(yǎng)貼壁生長的細胞，需要用胰酶消化傳代，在無血清培養(yǎng)基中必不可少須含酶抑制劑，以終止酶的消化作用，達到保護細胞的目的最常用的是大豆胰酶抑制劑。

結(jié)合蛋白和轉(zhuǎn)運蛋白

轉(zhuǎn)鐵蛋白和牛血清白蛋白。牛血清白蛋白的添加比較大，可增加培養(yǎng)基的粘度，保護細胞免受機械損傷。許多旋轉(zhuǎn)式培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基都含有牛血清白蛋白。

微量元素

硒是最常見的。三、合成培養(yǎng)基

無蛋白培養(yǎng)基（proteinfreemidium，PFM）

無蛋白培養(yǎng)基即不含有動物蛋白的培養(yǎng)基。無血清培養(yǎng)基仍含有較多的動物蛋白，如胰島素，轉(zhuǎn)鐵蛋白、牛血清白蛋白等。從生物技術(shù)發(fā)展的趨勢來看，不含動物蛋白的培養(yǎng)基有廣泛的應(yīng)用前景，許多利用基因工程技術(shù)重組的蛋白質(zhì)最終要應(yīng)用于人體，如果在生長過程中使用了含有動物蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基，純化過程就比較復(fù)雜，最終要達到一定的質(zhì)量標準也有一定的難度無蛋白培養(yǎng)基就是為了適應(yīng)這發(fā)展趨勢而出現(xiàn)的，許多無蛋白培養(yǎng)基添加了植物水解物以替代動物激素、生長因子的作用。目前已經(jīng)有適合于CHO細胞生長的PFM。PFM只適合于懸浮生長的細胞。三、合成培養(yǎng)基

限定化學(xué)成分培養(yǎng)基（chemicaldefinedmedium，CDM）

限定化學(xué)成分培養(yǎng)基（CDM）是指培養(yǎng)基中的所有成分都是明確的。它不含有動物蛋白，也不添加植物水解物，而是使用了一些已知結(jié)構(gòu)與功能的小分子化合物，如短肽、植物激素等。這種培養(yǎng)基更有利于分析細胞的分泌產(chǎn)物。目前已經(jīng)有適合于293細胞、CHO細胞、雜交瘤細胞生長的CDM。CDM只適合于懸浮生長的細胞三、合成培養(yǎng)基

四、其他培養(yǎng)用液平衡鹽溶液消化液pH調(diào)整液平衡鹽溶液（balancedsaltsolution，BSS）

組成平衡鹽溶液主要是由無機鹽、葡萄糖組成

作用是維持細胞滲透壓平衡，保持pH穩(wěn)定及提供簡單的營養(yǎng)

用途主要用于取材時組織塊的漂洗、細胞的漂洗、配制其他試劑配制溶液應(yīng)使用雙蒸水或去離子水。如果配方中含有Ca2+、Mg2+，應(yīng)當首先溶解這些成分。配好的平衡鹽溶液可以過濾除菌或高溫滅菌四、其他培養(yǎng)用液消化液

用途

取材進行原代培養(yǎng)時需要將組織塊消化解離形成細胞懸液傳代培養(yǎng)時也需要將貼壁細胞從瓶壁上消化下來

胰酶溶液

胰酶的活性可以用消化酪蛋白的能力表示，常見1:125和1:250組織培養(yǎng)用的胰酶溶液一般配制成0.1～0.25%的濃度，配制時要用不含Ca2+、Mg2+及血清的平衡鹽溶液胰酶作用及溶解的最佳pH8～9，配制胰酶溶液應(yīng)將液體調(diào)至pH8過濾除菌。四、其他培養(yǎng)用液消化液

EDTA溶液EDTA溶液也常用來解離細胞，它的作用機制是破壞細胞間的連接。對于一些貼壁特別牢固的細胞，還可以用EDTA和胰酶的混合液進行消化EDTA

溶液的使用濃度為

0.02%，配制時應(yīng)加堿助溶，配制后可過濾除菌，也可高溫消毒滅菌。膠原酶溶液

膠原酶在上皮類細胞原代培養(yǎng)時經(jīng)常使用，膠原酶作用的對象是膠原組織，因此不容易對細胞產(chǎn)生損傷。膠原酶的使用濃度為0.1～0.3mg/L或200000U/L，作用的最佳pH6.5膠原酶不受Ca2+、Mg2+及血清的抑制，配制時可用PBS。四、其他培養(yǎng)用液pH調(diào)整液

NaHCO3溶液NaHCO3是培養(yǎng)基中必須添加的成分，一般情況下按說明書的要求準確添加，以保證培養(yǎng)基在5%CO2的環(huán)境下pH達到設(shè)計標準。如果是封閉式培養(yǎng)，即不與5%CO2的環(huán)境發(fā)生交換達到平衡，所使用的培養(yǎng)基就不能按照說明書所要求加入NaHCO3。此時常用

5.6%或7.4%的NaHCO3溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基，使之達到所要求的pH環(huán)境。

HEPES溶液HEPES（羥乙基哌嗪乙硫磺酸）是一種弱酸，對細胞無毒性，主要作用是防止培養(yǎng)基pH迅速變動。在開放式培養(yǎng)條件下，觀察細胞時培養(yǎng)基脫離了5%CO2的環(huán)境CO2

氣體迅速逸出，pH迅速升高，若加了HEPES，此時可以維持pH7.0左右。一般在進行克隆化培養(yǎng)時要添加HEPES。四、其他培養(yǎng)用液抗生素

常用的是青霉素和鏈霉素，俗稱“雙抗溶液”。青霉素主要是對革蘭陽性菌有效，鏈霉素主要對革蘭陰性菌有效。加入這兩種抗生素可預(yù)防絕大多數(shù)細菌污染。一般使用青霉素終濃度0.007～0.008g/100ml，鏈霉素終濃0.01g/100ml配制成100倍濃縮液，可用PBS或培養(yǎng)基配制。四、其他培養(yǎng)用液五、環(huán)境和消毒細胞培養(yǎng)中常用的儀器設(shè)備

無菌室超凈工作臺三重純水蒸餾器抽氣泵壓力蒸氣消毒器電熱恒溫培養(yǎng)箱CO2培養(yǎng)箱恒溫水浴鍋倒置顯微鏡離心機無菌過濾器洗刷裝置細胞計數(shù)板和電子細胞技術(shù)儀五、環(huán)境和消毒細胞培養(yǎng)的無菌環(huán)境

無菌室

無菌室的結(jié)構(gòu)一般由更衣間、緩沖間、操作間三部分組成。無菌室的消毒和防污染為保持無菌狀態(tài)，經(jīng)常消毒是必要的，通常采用每日（使用前紫外照射（1～2小時），每周甲醛、乳酸、過氧乙酸熏蒸（2小時）

和

每月新潔爾滅擦拭地面和墻壁一次的方式進行消毒。應(yīng)注意防止無菌室的污染。造成無菌室污染的可能包括：送入無菌室的風(fēng)沒有被過濾除菌；進出無菌室時，能使外界空氣直接對流進無菌室的操作間等。五、環(huán)境和消毒細胞培養(yǎng)的無菌環(huán)境

超凈工作臺

工作原理鼓風(fēng)機驅(qū)動空氣通過高效過濾器得以凈化，凈化的空氣被徐徐吹過臺面空間而將其中的塵埃、細菌甚至病毒顆粒帶走，使工作區(qū)構(gòu)成無菌環(huán)境。根據(jù)氣流在超凈工作臺的流動方向不同，可將超凈工作臺分為側(cè)流式

直流式和外流式三種類型。五、環(huán)境和消毒細胞培養(yǎng)的無菌環(huán)境

超凈工作臺

超凈臺的使用與保養(yǎng)

超凈臺的平均風(fēng)速保持在0.32～0.48米/秒為宜，過大、過小均不利于保持凈化度。使用前最好開啟超凈臺內(nèi)紫外燈照射10～30分鐘，然后讓超凈臺預(yù)工作10～15分鐘，以除去臭氧和使用工作臺面空間呈凈化狀態(tài)使用完畢后，要用70%酒精將臺面和臺內(nèi)四周擦拭干凈，以保證超凈臺無菌。還要定期用甲醛熏蒸超凈臺五、環(huán)境和消毒常用培養(yǎng)器皿及清洗消毒

細胞培養(yǎng)需要大量消耗性物品，如玻璃器皿、金屬器皿、塑料、橡膠制品、布類、紙類等，因此掌握清洗、消毒知識，學(xué)會清洗、消毒方法是學(xué)習(xí)和從事細胞培養(yǎng)工作必須的。五、環(huán)境和消毒常用培養(yǎng)器皿及清洗

玻璃器皿的清洗

浸泡

新玻璃器皿使用前得先用自來水簡單刷洗，然后用

5％

鹽酸浸泡過夜；用過的玻璃器皿往往附有大量蛋白質(zhì)和油脂，干涸后不易刷洗掉，故用后應(yīng)立即浸入清水中備刷洗。

刷洗

將浸泡后的玻璃器皿放到洗滌劑水中，用軟毛刷反復(fù)刷洗。不要留死角，并防止破壞器皿表面的光潔度。將刷洗干凈的玻璃器皿洗凈、晾干，備浸酸。

浸酸

浸酸是將上述器皿浸泡到清潔液中，又稱酸液，通過酸液的強氧化作用清除器皿表面的可能殘留物質(zhì)。浸酸不應(yīng)少于六小時一般過夜或更長。

沖洗

刷洗和浸酸后的器皿都必須用水充分沖洗，浸酸后器皿是否沖洗的干凈，直接影響到細胞培養(yǎng)的成敗。手工洗滌浸酸后的器皿，每件器皿至少要反復(fù)“注水－倒空”15次以上，最后用重蒸水浸洗2～3次，晾干或烘干后包裝備用。五、環(huán)境和消毒常用培養(yǎng)器皿及清洗

橡膠制品清洗新的橡膠制品洗滌方法：0.5mol/LNaOH煮沸15分鐘，流水沖洗，0.5mol/LHCl煮沸15分鐘，流水沖洗，自來水煮沸2次，蒸餾水煮沸20分鐘，50℃烤干備用。塑料制品的清洗塑料制品特點：質(zhì)軟、易出現(xiàn)劃痕；耐腐蝕能力強、但不耐熱。清洗程序：使用器皿后立即用清水清洗，浸于自來水中過夜，用紗布或棉簽和50℃清洗液刷洗，流水沖洗，晾干，浸于清潔液中15分鐘，流水沖洗（15～20遍），蒸餾水浸洗三次，雙蒸水中泡24小時，晾干備用。五、環(huán)境和消毒消毒和滅菌

紫外線消毒

殺菌對象：紫外線可以殺死多種微生物。其中，革蘭陰性菌最為敏感其次是陽性菌，再次為芽孢，真菌孢子的抵抗力最強。

殺菌機制：紫外線是一種低能量的電磁輻射，直接作用是通過破壞微生物的核酸及蛋白質(zhì)等而使其滅活，間接作用是通過紫外線照射產(chǎn)生的臭氧殺死微生物。

使用范圍：目前多用紫外線直接照射培養(yǎng)室進行消毒，用法簡單，效果好五、環(huán)境和消毒消毒和滅菌

紫外線消毒

使用方法：紫外燈的消毒效果同紫外燈的輻射強度和照射劑量呈正相關(guān)，輻射強度隨燈距離增加而降低，照射劑量和照射時間呈正比。因此紫外燈同被照射物的距離和照射時間要適合離地面2米的30W燈可照射9平方米房間，每天照射2～3小時，期間可間隔30分鐘。燈管離地面2米以外要延長照射時間，2.5米照射效果較差。紫外燈照射工作臺的距離不應(yīng)超過1.5米，照射時間30分鐘為宜。注意事項：紫外燈不僅對皮膚、眼睛傷害，而且對培養(yǎng)細胞與試劑等也產(chǎn)生不良影響，因此，不要開著紫外等操作。五、環(huán)境