第十一章 經(jīng)典液相色譜法與檢測技術(shù)

1第十一章經(jīng)典液相色譜法與檢測技術(shù)

◆學(xué)習(xí)目的⊙◆知識(shí)要求⊙◆能力要求⊙◆學(xué)習(xí)目的2通過學(xué)習(xí)色譜法基本概念、基本類型、分離機(jī)制以及各種經(jīng)典液相色譜法的固定相、流動(dòng)相及其選擇等相關(guān)知識(shí)。了解色譜法的特點(diǎn)及其應(yīng)用，會(huì)利用吸附色譜、分配色譜等經(jīng)典柱色譜法和薄層色譜法對(duì)試樣進(jìn)行分離分析。為氣相色譜法和高效液相色譜法的學(xué)習(xí)奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也為學(xué)習(xí)藥物分析、天然藥物化學(xué)、藥物分離檢測技術(shù)等專業(yè)課程奠定基礎(chǔ)。◆知識(shí)要求31.掌握色譜法的基本概念，吸附色譜法和分配色譜法的分離機(jī)制，薄層色譜法的基本原理及其應(yīng)用。2.熟悉色譜法的分類，離子交換色譜法和凝膠色譜法的分離機(jī)制，各種經(jīng)典的柱色譜法基本原理及其應(yīng)用。3.了解色譜法的由來和發(fā)展。⊙◆能力要求熟練掌握薄層色譜法、柱色譜法的操作技術(shù)，學(xué)會(huì)應(yīng)用薄層色譜法等對(duì)物質(zhì)進(jìn)行分離和鑒定。

4⊙案例導(dǎo)入為什么采用這種方法可以使得這些性質(zhì)相似的物質(zhì)得以分離？固定相（布或紙片）和不斷加入的溶液對(duì)組分的分離起到什么作用，兩者如何選擇？分離后的各組分怎樣定性和準(zhǔn)確檢出……？5古羅馬時(shí)代人們將一滴含有混合色素的溶液滴到一塊布(或紙片)上，隨著溶液的擴(kuò)展，在布（或紙片）上會(huì)呈現(xiàn)一個(gè)一個(gè)的同心圓環(huán)，人們通過觀察這些同心圓環(huán)的差異來分析染料和色素。第一節(jié)概述

色譜法（chromatography）是一種根據(jù)物質(zhì)的物理或物理化學(xué)性質(zhì)不同而進(jìn)行分離分析的方法。6色譜法和其他方法相比較具有下列特點(diǎn)：1.分離效能高2.靈敏度高3.應(yīng)用范圍色譜法——起源真正意義的色譜實(shí)驗(yàn)色譜法的創(chuàng)始人是俄國植物學(xué)家Tsweet。一、色譜法產(chǎn)生與發(fā)展流動(dòng)相固定相被分離后，代表了不同組分的色帶色譜柱第一節(jié)概述

色譜法——發(fā)展柱色譜—20世紀(jì)初；趨勢：新型固定相和檢測器及各種檢測技術(shù)的聯(lián)用薄層、紙色譜—20世紀(jì)30～40年代；氣相色譜—20世紀(jì)50～60年代；高效液相色譜—20世紀(jì)70年代；超臨界流體色譜法

毛細(xì)管電泳法……20世紀(jì)80年代初第一節(jié)概述

第一節(jié)概述（一）按兩相的分子聚集狀態(tài)分類9色譜總稱流動(dòng)相固定相色譜名稱液相色譜法（LC）液體固體液—固色譜法（LSC）液體液—液色譜法（LLC）化學(xué)鍵合相化學(xué)鍵合相色譜法（BPC）氣相色譜法（GC）氣體固體氣—固色譜法（GSC）液體氣—液色譜法（GLC）超臨界流體色譜法（SFC）超臨界流體固體或化學(xué)鍵合相二、色譜法的分類第一節(jié)概述10（二）按操作形式分類

色譜名稱柱色譜（CC）平面色譜填充柱色譜法毛細(xì)管柱色譜法薄層色譜法（TLC）紙色譜法（PC）固定相形式填充柱毛細(xì)管柱薄層板紙?jiān)诓ＡЩ蚪饘俟軆?nèi)填充或涂覆滿固定相在彈性石英或玻璃毛細(xì)管內(nèi)壁覆有吸附劑薄層或固定液在玻璃或金屬板上涂布吸附劑等固定相具有多孔和強(qiáng)滲透能力的濾紙或纖維素薄膜色譜過程流動(dòng)相由柱頭向柱尾不間斷沖洗流動(dòng)相從板或紙的一端向另一端擴(kuò)展二、色譜法的分類第一節(jié)概述第一節(jié)概述11（三）按色譜過程的分離機(jī)制分類吸附色譜法（AC）分配色譜法（DC）離子交換色譜法（IEC）凝膠色譜法（SEC）……二、色譜法的分類色譜法分類小結(jié)1213課堂互動(dòng)請(qǐng)您闡述色譜法的分類方法，及各種色譜法的特點(diǎn)？第一節(jié)概述第一節(jié)概述第一節(jié)概述（一）分配系數(shù)和容量因子1.分配系數(shù)（K）142.容量因子（k）三、色譜法的基本原理第一節(jié)概述第一節(jié)概述153.分配系數(shù)與容量因子的關(guān)系

稱為相比，在一定色譜條件下為定值；Vm為柱中流動(dòng)相體積（近似等于第十二章中提及的死體積）；Vs

是柱中固定相（或固定液）的體積；κ值隨β

和K

的變化而變化。（一）分配系數(shù)和容量因子第一節(jié)概述分配系數(shù)（或容量因子）越小，組分的遷移速度越快，保留時(shí)間越短，即先流出色譜柱；反之亦然。

分配系數(shù)（或容量因子）不等是組分分離的前提。

164.分配系數(shù)、容量因子與保留值的關(guān)系

課堂互動(dòng)請(qǐng)您分析：組分的分配系數(shù)

，與組分在固定相中的停留時(shí)間之間存在什么關(guān)系？第一節(jié)概述（一）分配系數(shù)和容量因子（二）色譜過程的分離機(jī)制

組分不斷被吸附、解吸附，如此反復(fù)多次的過程。組分的吸附平衡常數(shù)越大，越容易被吸附，遷移速度就越慢。吸附平衡常數(shù)17圖11-2吸附色譜分離機(jī)制示意圖吸附劑組分分子流動(dòng)相分子被解吸的組分分子被解吸的流動(dòng)相分子1.吸附色譜法分離機(jī)制第一節(jié)概述（二）色譜過程的分離機(jī)制18流動(dòng)相攜帶樣品流經(jīng)固定相時(shí)，各組分在兩相間不斷地進(jìn)行溶解、萃取，再溶解、再萃取的過程分配系數(shù)大的組分移動(dòng)速度慢，分配系數(shù)小的組分移動(dòng)速度快。進(jìn)入固定相的組分分子進(jìn)入流動(dòng)相的組分分子固定相2.分配色譜法分離機(jī)制圖11-3分配色譜分離機(jī)制示意圖第一節(jié)概述（二）色譜過程的分離機(jī)制3.離子交換色譜法分離機(jī)制19被分離的離子隨流動(dòng)相流經(jīng)離子交換樹脂時(shí)，與離子交換樹脂上可被交換的離子連續(xù)進(jìn)行競爭交換，交換能力弱的離子，遷移速度快，保留時(shí)間短，先流出色譜柱。離子交換劑Θ固定離子組分離子⊕可交換陽離子圖11-4陽離子交換色譜分離機(jī)制示意圖第一節(jié)概述第一節(jié)概述以陽離子為例，離子交換反應(yīng)的通式用下式表示：20選擇性系數(shù)KA/B用于衡量離子對(duì)樹脂的親和能力。KA/B越大（KA/B>1），說明A＋的交換能力大，保留時(shí)間長，則A＋比B＋后流出色譜柱；反之亦然。離子交換達(dá)到平衡時(shí)以濃度表示的平衡常數(shù)為：3.離子交換色譜法分離機(jī)制（二）色譜過程的分離機(jī)制4.凝膠色譜法分離機(jī)制21凝膠色譜分離機(jī)制示意圖O：凝膠顆粒o：大分子組分·：小分子組分組分的分離取決于凝膠顆粒的孔徑大小和被分離物質(zhì)分子的大小。出柱順序：首先是大分子，其次是中等大小的分子，最后是小分子。第一節(jié)概述角度不同，對(duì)色譜法的分類不同。色譜法中分配系數(shù)（或容量因子）不等是組分分離的前提。中分配系數(shù)（或容量因子）越大，組分在固定相中的保留時(shí)間越長；反之亦然。凝膠色譜法中分子的尺寸（分子量）越小在固定相中的保留時(shí)間越長；反之亦然。點(diǎn)滴積累

22第一節(jié)概述23第二節(jié)柱色譜法柱色譜法是指將固定相填覆在玻璃管或不銹鋼管柱中的色譜法。經(jīng)典柱色譜法的流動(dòng)相是液體，固定相可以是吸附劑、液體，也可以是離子交換樹脂、凝膠等。一、液—固吸附柱色譜法24第二節(jié)柱色譜法固定相：吸附劑，是一些多孔性微粒物質(zhì)，具有較大的比表面積和多個(gè)吸附中心，其吸附性能取決于吸附中心的多少及其吸附能力的大小。常用的吸附劑有硅膠、氧化鋁、聚酰胺、大孔吸附樹脂、活性炭等。一、液—固吸附柱色譜法1.固定相（1）硅膠（SiO2·XH2O）25硅膠的吸附活性與含水量有關(guān)。第二節(jié)柱色譜法硅膠含水量（%）活性級(jí)數(shù)活性氧化鋁含水量（%）0Ⅰ高低05Ⅱ315Ⅲ625Ⅳ1038Ⅴ15表11-3硅膠和氧化鋁的活性與含水量的關(guān)系硅膠呈微酸性，主要用于分離酸性和中性化合物。

硅膠活性級(jí)數(shù)和活性及吸附能力間的關(guān)系：硅膠的活性級(jí)數(shù)是根據(jù)其含水量高低確定。硅膠的活性是根據(jù)其吸附能力強(qiáng)弱確定。硅膠的含水量越高，活性級(jí)數(shù)越高，越多的硅醇基因?yàn)樾纬伤瞎璐蓟?，而使得硅膠吸附其他物質(zhì)的能力下降，即硅膠的吸附性能下降，活性低。26難點(diǎn)釋疑第二節(jié)柱色譜法27（2）氧化鋁：吸附能力略高于硅膠，分離能力強(qiáng)，活性可以控制。氧化鋁的吸附活性與其含水量密切相關(guān)。一、液—固吸附柱色譜法1.固定相氧化鋁可分為酸性、中性、和堿性三種，其中中性氧化鋁應(yīng)用廣泛。第二節(jié)柱色譜法酸性氧化鋁（pH4～5）用于分離酸性化合物以及對(duì)酸穩(wěn)定的中性化合物。堿性氧化鋁（pH9～10）用于分離堿性和中性化合物。中性氧化鋁（pH≈7.5）凡是酸性、堿性氧化鋁上能分離的化合物，中性氧化鋁都能分離。28一、液—固吸附柱色譜法（2）氧化鋁第二節(jié)柱色譜法（3）聚酰胺：是一類由酰胺聚合而成的高分子化合物，常用的是聚己內(nèi)酰胺。

聚酰胺主要通過分子中的酰氨基或羰基與化合物質(zhì)子給予體形成氫鍵而對(duì)被分離組分產(chǎn)生吸附。聚酰胺在天然藥物有效成分的分離方面應(yīng)用廣泛。29一、液—固吸附柱色譜法1.固定相第二節(jié)柱色譜法（4）大孔吸附樹脂：是一種不含交換基團(tuán)，但具有大孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高分子化合物。通過范德華引力或產(chǎn)生氫鍵對(duì)被分離物質(zhì)產(chǎn)生吸附。

大孔吸附樹脂的選擇性由多孔性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)所決定。大孔吸附樹脂主要用于水溶性化合物的分離及純化。30一、液—固吸附柱色譜法1.固定相第二節(jié)柱色譜法第二節(jié)柱色譜法2.被測物質(zhì)的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)31不同類型的化合物極性由小到大的順序?yàn)椋和闊N＜烯烴＜醚類＜硝基化合物＜酯類＜酮類＜醛類＜硫醇＜胺類＜醇類＜酚類＜羧酸類一、液—固吸附柱色譜法第二節(jié)柱色譜法判斷物質(zhì)極性強(qiáng)弱時(shí)，可以參考以下規(guī)律：①基本母核相同，分子中極性基團(tuán)的極性越大、極性基團(tuán)越多，則分子的極性就越大；②分子中雙鍵越多、共軛雙鍵鏈越長，極性越大；③分子式相同，能形成分子內(nèi)氫鍵的分子極性要弱；④在同系物中，分子量越大，分子的極性越小。322.被測物質(zhì)的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)一、液—固吸附柱色譜法第二節(jié)柱色譜法3.流動(dòng)相性質(zhì)常用溶劑的極性由小到大的順序?yàn)椋菏兔眩辑h(huán)己烷＜四氯化碳＜苯＜甲苯＜乙醚＜三氯甲烷＜乙酸乙酯＜正丁醇＜丙酮＜乙醇＜甲醇＜水33一、液—固吸附柱色譜法第二節(jié)柱色譜法（1）吸附劑的選擇：分離極性大的物質(zhì)，一般選用吸附活性小的吸附劑；反之亦然。即使得吸附劑與被分離物質(zhì)間存在適宜強(qiáng)度的吸附作用力。344.吸附劑和流動(dòng)相的選擇一、液—固吸附柱色譜法（2）流動(dòng)相的選擇：“相似相溶”原則進(jìn)行選擇。第二節(jié)柱色譜法35被測物質(zhì)的極性、吸附劑活性和流動(dòng)相極性之間的關(guān)系示意圖

一、液—固吸附柱色譜法一般用親水性吸附劑（如：硅膠）作色譜分離時(shí)，若分離物極性較小，應(yīng)選擇何吸附劑和洗脫劑？分離物極性小，形成氫鍵的能力弱，所以宜選用吸附活性大（含水量低即活性級(jí)數(shù)低）的吸附劑，這樣分離物和吸附劑間才能形成一定強(qiáng)度的氫鍵，使固定相對(duì)其產(chǎn)生適宜的吸附作用；被分離物極性小，根據(jù)“相似相溶”原則宜選用極性小的洗脫劑。36案例分析第二節(jié)柱色譜法第二節(jié)柱色譜法二、液—液分配柱色譜法1.固定相由載體及涂漬或鍵合在載體表面的固定液組成。37載體是一種惰性物質(zhì)，主要起負(fù)載或支撐固定液的作用。固定液正相色譜：強(qiáng)極性溶劑，如水、甲醇等。反相色譜：非極性或弱極性溶劑，如液體石蠟等。第二節(jié)柱色譜法2.流動(dòng)相

正相色譜：極性小于固定相的醇類、酮類、酯類、鹵代烷、苯或其混合物。

反相色譜：水、稀醇等極性溶劑。應(yīng)用各類化合物的分離，特別是親水性物質(zhì)。38二、液—液分配柱色譜法

分配色譜分離時(shí)，已知某混合物中A、B二組分在兩相中的分配系數(shù)分別為315、450，請(qǐng)您分析，進(jìn)行柱色譜分離時(shí)二組分的出柱順序。39課堂互動(dòng)二、液—液分配柱色譜法第二節(jié)柱色譜法第二節(jié)柱色譜法1.固定相

離子交換樹脂40交聯(lián)度：離子交換樹脂中所含交聯(lián)劑的量。用于衡量離子交換樹脂的選擇性，交聯(lián)度大，樹脂的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)緊密，網(wǎng)眼小，選擇性好。交換容量：實(shí)驗(yàn)條件下，每克干樹脂真正參加交換的活性基團(tuán)數(shù)。用于衡量離子交換樹脂的交換能力，交換容量大，樹脂的交換能力強(qiáng)。三、離子交換柱色譜法第二節(jié)柱色譜法2.流動(dòng)相水為溶劑的緩沖溶液。應(yīng)用去離子水的制備，天然藥物化學(xué)成分的分離。41三、離子交換柱色譜法第二節(jié)柱色譜法四、凝膠柱色譜法1.固定相選擇時(shí)應(yīng)使試樣的相對(duì)分子量落入凝膠的相對(duì)分子質(zhì)量范圍內(nèi)。42（1）排斥極限：化合物的相對(duì)分子質(zhì)量達(dá)到某一數(shù)值后就不能滲透進(jìn)入凝膠的任何孔穴，這一數(shù)值稱~。（2）全滲透點(diǎn)：化合物的相對(duì)分子質(zhì)量小于某一數(shù)值后就能進(jìn)入凝膠的所有孔穴，則這一數(shù)值稱~。（3）相對(duì)分子質(zhì)量范圍：排斥極限與全滲透點(diǎn)之間的相對(duì)分子質(zhì)量范圍稱為~。第二節(jié)柱色譜法第二節(jié)柱色譜法應(yīng)用天然藥物化學(xué)和生物化學(xué)的研究，水溶性高分子化合物如蛋白制劑等的分析。432.流動(dòng)相一般水溶性試樣選擇水溶液為流動(dòng)相，而非水溶性試樣則選擇四氫呋喃、氯仿、甲苯等有機(jī)溶劑為流動(dòng)相。四、凝膠柱色譜法第二節(jié)柱色譜法五、柱色譜法的應(yīng)用例如采用柱色譜法中的凝膠色譜法，以葡聚糖凝膠為固定相，1mol/L的NaCl為流動(dòng)相，可以將分子量存在差異的葡萄糖和淀粉進(jìn)行分離。例如采用分配色譜法以硅膠為固定相，水飽和的乙酸乙酯為流動(dòng)相，可以將洋地黃毒苷、羥基洋地黃毒苷、異羥基洋地黃毒苷三種單體進(jìn)行分離等。44點(diǎn)滴積累1.硅膠（或氧化鋁）活性級(jí)數(shù)高，活性低，吸附能力弱。2.吸附柱色譜法：被分離組分與固定相間的吸附作用力適中；組分與流動(dòng)相“相似相溶”。3.分配柱色譜法：固定相與流動(dòng)相極性不同，且不互溶；適于各類化合物分離，特別是親水性化合物分離4.離子交換柱色譜法：分子量較小的樣品宜選擇交聯(lián)度大的樹脂，分子量較大的樣品宜選擇交聯(lián)度小的樹脂；常選用水為溶劑的緩沖溶液做流動(dòng)相。5.凝膠色譜法：樣品的分子量范圍落入凝膠的相對(duì)分子質(zhì)量范圍內(nèi)；常選用水溶劑或非水溶劑做流動(dòng)相。45第二節(jié)柱色譜法第三節(jié)平面色譜法一、基本原理（一）分離原理薄層色譜法：將固定相（如：吸附劑）均勻地涂鋪在光潔的玻璃板、塑料板或金屬板上形成薄層，在薄層板上進(jìn)行分離分析的方法。分離機(jī)制與吸附柱色譜的分離機(jī)制相似。46第三節(jié)平面色譜法（二）比移值與相對(duì)比移值

47比移值（Rf）：

L0原點(diǎn)溶劑前沿ABL1L2Rf的測量示意圖

Rf可用范圍是0.2～0.8，最佳范圍是0.3～0.5。

第三節(jié)平面色譜法48相對(duì)比移值（Rr）

Rr可以大于1，也可以小于1。，

L0原點(diǎn)溶劑前沿ABL1L2Rf的測量示意圖第三節(jié)平面色譜法491.已知A與參考物質(zhì)B的相對(duì)比移值為1.2，當(dāng)B物質(zhì)在一定色譜條件下，在某薄層板上展開后，斑點(diǎn)距原點(diǎn)6cm，此時(shí)溶劑前沿到原點(diǎn)的距離為18cm，若A也在此薄層板上同時(shí)展開。請(qǐng)分析A在薄層板的何位置，A物質(zhì)的比移值是多少？2.分別說明什么？課堂互動(dòng)第三節(jié)平面色譜法第三節(jié)平面色譜法

二、吸附劑的選擇50與吸附柱色譜法所用的吸附劑相似，其主要區(qū)別在于薄層色譜法所用的吸附劑顆粒更細(xì)小。

三、展開劑的選擇遵循“相似相溶”原則。

薄層色譜中常用的溶劑按極性由弱到強(qiáng)的順序是：石油醚＜環(huán)己烷＜二硫化碳＜四氯化碳＜三氯乙烷＜苯＜甲苯＜二氯甲烷三氯甲烷＜苯＜甲苯＜二氯甲烷＜三氯甲烷＜乙醚＜乙酸乙酯＜丙酮＜正丙醇＜乙醇＜甲醇＜吡啶＜水第三節(jié)平面色譜法51在苯-乙醇（9?1）展開劑中，您知道苯、乙醇的作用嗎？吸附薄層色譜實(shí)驗(yàn)中以硅膠板為薄層板，環(huán)己烷為展開劑，若某極性組分Rf=0

，請(qǐng)分析應(yīng)如何調(diào)整展開劑的極性？課堂互動(dòng)第三節(jié)平面色譜法四、操作方法

薄層色譜法的操作可分為制板、點(diǎn)樣、展開、顯色與檢視、系統(tǒng)適用性試驗(yàn)和測定六個(gè)步驟。

52第三節(jié)平面色譜法薄層板：

分為硬板軟板，熒光薄層板等。53符號(hào)含意符號(hào)含意G以石膏作粘合劑C薄層已被分成條帶H無外加粘合劑Silanised,RP-2二甲基硅烷改性的反相R特別純化的RP反相P制備用RP-8，RP-18C-8，C-18烷基改性W水可濕性的NH2氨基改性親水層F254,366熒光指示劑激發(fā)波長CHIR手性固定相F254S抗酸性熒光指示劑CN氰基改性固定相40,60……平均孔徑（?）DIOL二醇基改性固定相市售吸附劑和預(yù)制板包裝上的符號(hào)及含意引自/books/C/1