第十一章 經典液相色譜法與檢測技術

1第十一章經典液相色譜法與檢測技術

◆學習目的⊙◆知識要求⊙◆能力要求⊙◆學習目的2通過學習色譜法基本概念、基本類型、分離機制以及各種經典液相色譜法的固定相、流動相及其選擇等相關知識。了解色譜法的特點及其應用，會利用吸附色譜、分配色譜等經典柱色譜法和薄層色譜法對試樣進行分離分析。為氣相色譜法和高效液相色譜法的學習奠定基礎，同時也為學習藥物分析、天然藥物化學、藥物分離檢測技術等專業(yè)課程奠定基礎?！糁R要求31.掌握色譜法的基本概念，吸附色譜法和分配色譜法的分離機制，薄層色譜法的基本原理及其應用。2.熟悉色譜法的分類，離子交換色譜法和凝膠色譜法的分離機制，各種經典的柱色譜法基本原理及其應用。3.了解色譜法的由來和發(fā)展?！选裟芰σ笫炀氄莆毡由V法、柱色譜法的操作技術，學會應用薄層色譜法等對物質進行分離和鑒定。

4⊙案例導入為什么采用這種方法可以使得這些性質相似的物質得以分離？固定相（布或紙片）和不斷加入的溶液對組分的分離起到什么作用，兩者如何選擇？分離后的各組分怎樣定性和準確檢出……？5古羅馬時代人們將一滴含有混合色素的溶液滴到一塊布(或紙片)上，隨著溶液的擴展，在布（或紙片）上會呈現一個一個的同心圓環(huán)，人們通過觀察這些同心圓環(huán)的差異來分析染料和色素。第一節(jié)概述

色譜法（chromatography）是一種根據物質的物理或物理化學性質不同而進行分離分析的方法。6色譜法和其他方法相比較具有下列特點：1.分離效能高2.靈敏度高3.應用范圍色譜法——起源真正意義的色譜實驗色譜法的創(chuàng)始人是俄國植物學家Tsweet。一、色譜法產生與發(fā)展流動相固定相被分離后，代表了不同組分的色帶色譜柱第一節(jié)概述

色譜法——發(fā)展柱色譜—20世紀初；趨勢：新型固定相和檢測器及各種檢測技術的聯用薄層、紙色譜—20世紀30～40年代；氣相色譜—20世紀50～60年代；高效液相色譜—20世紀70年代；超臨界流體色譜法

毛細管電泳法……20世紀80年代初第一節(jié)概述

第一節(jié)概述（一）按兩相的分子聚集狀態(tài)分類9色譜總稱流動相固定相色譜名稱液相色譜法（LC）液體固體液—固色譜法（LSC）液體液—液色譜法（LLC）化學鍵合相化學鍵合相色譜法（BPC）氣相色譜法（GC）氣體固體氣—固色譜法（GSC）液體氣—液色譜法（GLC）超臨界流體色譜法（SFC）超臨界流體固體或化學鍵合相二、色譜法的分類第一節(jié)概述10（二）按操作形式分類

色譜名稱柱色譜（CC）平面色譜填充柱色譜法毛細管柱色譜法薄層色譜法（TLC）紙色譜法（PC）固定相形式填充柱毛細管柱薄層板紙在玻璃或金屬管內填充或涂覆滿固定相在彈性石英或玻璃毛細管內壁覆有吸附劑薄層或固定液在玻璃或金屬板上涂布吸附劑等固定相具有多孔和強滲透能力的濾紙或纖維素薄膜色譜過程流動相由柱頭向柱尾不間斷沖洗流動相從板或紙的一端向另一端擴展二、色譜法的分類第一節(jié)概述第一節(jié)概述11（三）按色譜過程的分離機制分類吸附色譜法（AC）分配色譜法（DC）離子交換色譜法（IEC）凝膠色譜法（SEC）……二、色譜法的分類色譜法分類小結1213課堂互動請您闡述色譜法的分類方法，及各種色譜法的特點？第一節(jié)概述第一節(jié)概述第一節(jié)概述（一）分配系數和容量因子1.分配系數（K）142.容量因子（k）三、色譜法的基本原理第一節(jié)概述第一節(jié)概述153.分配系數與容量因子的關系

稱為相比，在一定色譜條件下為定值；Vm為柱中流動相體積（近似等于第十二章中提及的死體積）；Vs

是柱中固定相（或固定液）的體積；κ值隨β

和K

的變化而變化。（一）分配系數和容量因子第一節(jié)概述分配系數（或容量因子）越小，組分的遷移速度越快，保留時間越短，即先流出色譜柱；反之亦然。

分配系數（或容量因子）不等是組分分離的前提。

164.分配系數、容量因子與保留值的關系

課堂互動請您分析：組分的分配系數

，與組分在固定相中的停留時間之間存在什么關系？第一節(jié)概述（一）分配系數和容量因子（二）色譜過程的分離機制

組分不斷被吸附、解吸附，如此反復多次的過程。組分的吸附平衡常數越大，越容易被吸附，遷移速度就越慢。吸附平衡常數17圖11-2吸附色譜分離機制示意圖吸附劑組分分子流動相分子被解吸的組分分子被解吸的流動相分子1.吸附色譜法分離機制第一節(jié)概述（二）色譜過程的分離機制18流動相攜帶樣品流經固定相時，各組分在兩相間不斷地進行溶解、萃取，再溶解、再萃取的過程分配系數大的組分移動速度慢，分配系數小的組分移動速度快。進入固定相的組分分子進入流動相的組分分子固定相2.分配色譜法分離機制圖11-3分配色譜分離機制示意圖第一節(jié)概述（二）色譜過程的分離機制3.離子交換色譜法分離機制19被分離的離子隨流動相流經離子交換樹脂時，與離子交換樹脂上可被交換的離子連續(xù)進行競爭交換，交換能力弱的離子，遷移速度快，保留時間短，先流出色譜柱。離子交換劑Θ固定離子組分離子⊕可交換陽離子圖11-4陽離子交換色譜分離機制示意圖第一節(jié)概述第一節(jié)概述以陽離子為例，離子交換反應的通式用下式表示：20選擇性系數KA/B用于衡量離子對樹脂的親和能力。KA/B越大（KA/B>1），說明A＋的交換能力大，保留時間長，則A＋比B＋后流出色譜柱；反之亦然。離子交換達到平衡時以濃度表示的平衡常數為：3.離子交換色譜法分離機制（二）色譜過程的分離機制4.凝膠色譜法分離機制21凝膠色譜分離機制示意圖O：凝膠顆粒o：大分子組分·：小分子組分組分的分離取決于凝膠顆粒的孔徑大小和被分離物質分子的大小。出柱順序：首先是大分子，其次是中等大小的分子，最后是小分子。第一節(jié)概述角度不同，對色譜法的分類不同。色譜法中分配系數（或容量因子）不等是組分分離的前提。中分配系數（或容量因子）越大，組分在固定相中的保留時間越長；反之亦然。凝膠色譜法中分子的尺寸（分子量）越小在固定相中的保留時間越長；反之亦然。點滴積累

22第一節(jié)概述23第二節(jié)柱色譜法柱色譜法是指將固定相填覆在玻璃管或不銹鋼管柱中的色譜法。經典柱色譜法的流動相是液體，固定相可以是吸附劑、液體，也可以是離子交換樹脂、凝膠等。一、液—固吸附柱色譜法24第二節(jié)柱色譜法固定相：吸附劑，是一些多孔性微粒物質，具有較大的比表面積和多個吸附中心，其吸附性能取決于吸附中心的多少及其吸附能力的大小。常用的吸附劑有硅膠、氧化鋁、聚酰胺、大孔吸附樹脂、活性炭等。一、液—固吸附柱色譜法1.固定相（1）硅膠（SiO2·XH2O）25硅膠的吸附活性與含水量有關。第二節(jié)柱色譜法硅膠含水量（%）活性級數活性氧化鋁含水量（%）0Ⅰ高低05Ⅱ315Ⅲ625Ⅳ1038Ⅴ15表11-3硅膠和氧化鋁的活性與含水量的關系硅膠呈微酸性，主要用于分離酸性和中性化合物。

硅膠活性級數和活性及吸附能力間的關系：硅膠的活性級數是根據其含水量高低確定。硅膠的活性是根據其吸附能力強弱確定。硅膠的含水量越高，活性級數越高，越多的硅醇基因為形成水合硅醇基，而使得硅膠吸附其他物質的能力下降，即硅膠的吸附性能下降，活性低。26難點釋疑第二節(jié)柱色譜法27（2）氧化鋁：吸附能力略高于硅膠，分離能力強，活性可以控制。氧化鋁的吸附活性與其含水量密切相關。一、液—固吸附柱色譜法1.固定相氧化鋁可分為酸性、中性、和堿性三種，其中中性氧化鋁應用廣泛。第二節(jié)柱色譜法酸性氧化鋁（pH4～5）用于分離酸性化合物以及對酸穩(wěn)定的中性化合物。堿性氧化鋁（pH9～10）用于分離堿性和中性化合物。中性氧化鋁（pH≈7.5）凡是酸性、堿性氧化鋁上能分離的化合物，中性氧化鋁都能分離。28一、液—固吸附柱色譜法（2）氧化鋁第二節(jié)柱色譜法（3）聚酰胺：是一類由酰胺聚合而成的高分子化合物，常用的是聚己內酰胺。

聚酰胺主要通過分子中的酰氨基或羰基與化合物質子給予體形成氫鍵而對被分離組分產生吸附。聚酰胺在天然藥物有效成分的分離方面應用廣泛。29一、液—固吸附柱色譜法1.固定相第二節(jié)柱色譜法（4）大孔吸附樹脂：是一種不含交換基團，但具有大孔網狀結構的高分子化合物。通過范德華引力或產生氫鍵對被分離物質產生吸附。

大孔吸附樹脂的選擇性由多孔性網狀結構所決定。大孔吸附樹脂主要用于水溶性化合物的分離及純化。30一、液—固吸附柱色譜法1.固定相第二節(jié)柱色譜法第二節(jié)柱色譜法2.被測物質的結構與性質31不同類型的化合物極性由小到大的順序為：烷烴＜烯烴＜醚類＜硝基化合物＜酯類＜酮類＜醛類＜硫醇＜胺類＜醇類＜酚類＜羧酸類一、液—固吸附柱色譜法第二節(jié)柱色譜法判斷物質極性強弱時，可以參考以下規(guī)律：①基本母核相同，分子中極性基團的極性越大、極性基團越多，則分子的極性就越大；②分子中雙鍵越多、共軛雙鍵鏈越長，極性越大；③分子式相同，能形成分子內氫鍵的分子極性要弱；④在同系物中，分子量越大，分子的極性越小。322.被測物質的結構與性質一、液—固吸附柱色譜法第二節(jié)柱色譜法3.流動相性質常用溶劑的極性由小到大的順序為：石油醚＜環(huán)己烷＜四氯化碳＜苯＜甲苯＜乙醚＜三氯甲烷＜乙酸乙酯＜正丁醇＜丙酮＜乙醇＜甲醇＜水33一、液—固吸附柱色譜法第二節(jié)柱色譜法（1）吸附劑的選擇：分離極性大的物質，一般選用吸附活性小的吸附劑；反之亦然。即使得吸附劑與被分離物質間存在適宜強度的吸附作用力。344.吸附劑和流動相的選擇一、液—固吸附柱色譜法（2）流動相的選擇：“相似相溶”原則進行選擇。第二節(jié)柱色譜法35被測物質的極性、吸附劑活性和流動相極性之間的關系示意圖

一、液—固吸附柱色譜法一般用親水性吸附劑（如：硅膠）作色譜分離時，若分離物極性較小，應選擇何吸附劑和洗脫劑？分離物極性小，形成氫鍵的能力弱，所以宜選用吸附活性大（含水量低即活性級數低）的吸附劑，這樣分離物和吸附劑間才能形成一定強度的氫鍵，使固定相對其產生適宜的吸附作用；被分離物極性小，根據“相似相溶”原則宜選用極性小的洗脫劑。36案例分析第二節(jié)柱色譜法第二節(jié)柱色譜法二、液—液分配柱色譜法1.固定相由載體及涂漬或鍵合在載體表面的固定液組成。37載體是一種惰性物質，主要起負載或支撐固定液的作用。固定液正相色譜：強極性溶劑，如水、甲醇等。反相色譜：非極性或弱極性溶劑，如液體石蠟等。第二節(jié)柱色譜法2.流動相

正相色譜：極性小于固定相的醇類、酮類、酯類、鹵代烷、苯或其混合物。

反相色譜：水、稀醇等極性溶劑。應用各類化合物的分離，特別是親水性物質。38二、液—液分配柱色譜法

分配色譜分離時，已知某混合物中A、B二組分在兩相中的分配系數分別為315、450，請您分析，進行柱色譜分離時二組分的出柱順序。39課堂互動二、液—液分配柱色譜法第二節(jié)柱色譜法第二節(jié)柱色譜法1.固定相

離子交換樹脂40交聯度：離子交換樹脂中所含交聯劑的量。用于衡量離子交換樹脂的選擇性，交聯度大，樹脂的網狀結構緊密，網眼小，選擇性好。交換容量：實驗條件下，每克干樹脂真正參加交換的活性基團數。用于衡量離子交換樹脂的交換能力，交換容量大，樹脂的交換能力強。三、離子交換柱色譜法第二節(jié)柱色譜法2.流動相水為溶劑的緩沖溶液。應用去離子水的制備，天然藥物化學成分的分離。41三、離子交換柱色譜法第二節(jié)柱色譜法四、凝膠柱色譜法1.固定相選擇時應使試樣的相對分子量落入凝膠的相對分子質量范圍內。42（1）排斥極限：化合物的相對分子質量達到某一數值后就不能滲透進入凝膠的任何孔穴，這一數值稱~。（2）全滲透點：化合物的相對分子質量小于某一數值后就能進入凝膠的所有孔穴，則這一數值稱~。（3）相對分子質量范圍：排斥極限與全滲透點之間的相對分子質量范圍稱為~。第二節(jié)柱色譜法第二節(jié)柱色譜法應用天然藥物化學和生物化學的研究，水溶性高分子化合物如蛋白制劑等的分析。432.流動相一般水溶性試樣選擇水溶液為流動相，而非水溶性試樣則選擇四氫呋喃、氯仿、甲苯等有機溶劑為流動相。四、凝膠柱色譜法第二節(jié)柱色譜法五、柱色譜法的應用例如采用柱色譜法中的凝膠色譜法，以葡聚糖凝膠為固定相，1mol/L的NaCl為流動相，可以將分子量存在差異的葡萄糖和淀粉進行分離。例如采用分配色譜法以硅膠為固定相，水飽和的乙酸乙酯為流動相，可以將洋地黃毒苷、羥基洋地黃毒苷、異羥基洋地黃毒苷三種單體進行分離等。44點滴積累1.硅膠（或氧化鋁）活性級數高，活性低，吸附能力弱。2.吸附柱色譜法：被分離組分與固定相間的吸附作用力適中；組分與流動相“相似相溶”。3.分配柱色譜法：固定相與流動相極性不同，且不互溶；適于各類化合物分離，特別是親水性化合物分離4.離子交換柱色譜法：分子量較小的樣品宜選擇交聯度大的樹脂，分子量較大的樣品宜選擇交聯度小的樹脂；常選用水為溶劑的緩沖溶液做流動相。5.凝膠色譜法：樣品的分子量范圍落入凝膠的相對分子質量范圍內；常選用水溶劑或非水溶劑做流動相。45第二節(jié)柱色譜法第三節(jié)平面色譜法一、基本原理（一）分離原理薄層色譜法：將固定相（如：吸附劑）均勻地涂鋪在光潔的玻璃板、塑料板或金屬板上形成薄層，在薄層板上進行分離分析的方法。分離機制與吸附柱色譜的分離機制相似。46第三節(jié)平面色譜法（二）比移值與相對比移值

47比移值（Rf）：

L0原點溶劑前沿ABL1L2Rf的測量示意圖

Rf可用范圍是0.2～0.8，最佳范圍是0.3～0.5。

第三節(jié)平面色譜法48相對比移值（Rr）

Rr可以大于1，也可以小于1。，

L0原點溶劑前沿ABL1L2Rf的測量示意圖第三節(jié)平面色譜法491.已知A與參考物質B的相對比移值為1.2，當B物質在一定色譜條件下，在某薄層板上展開后，斑點距原點6cm，此時溶劑前沿到原點的距離為18cm，若A也在此薄層板上同時展開。請分析A在薄層板的何位置，A物質的比移值是多少？2.分別說明什么？課堂互動第三節(jié)平面色譜法第三節(jié)平面色譜法

二、吸附劑的選擇50與吸附柱色譜法所用的吸附劑相似，其主要區(qū)別在于薄層色譜法所用的吸附劑顆粒更細小。

三、展開劑的選擇遵循“相似相溶”原則。

薄層色譜中常用的溶劑按極性由弱到強的順序是：石油醚＜環(huán)己烷＜二硫化碳＜四氯化碳＜三氯乙烷＜苯＜甲苯＜二氯甲烷三氯甲烷＜苯＜甲苯＜二氯甲烷＜三氯甲烷＜乙醚＜乙酸乙酯＜丙酮＜正丙醇＜乙醇＜甲醇＜吡啶＜水第三節(jié)平面色譜法51在苯-乙醇（9?1）展開劑中，您知道苯、乙醇的作用嗎？吸附薄層色譜實驗中以硅膠板為薄層板，環(huán)己烷為展開劑，若某極性組分Rf=0

，請分析應如何調整展開劑的極性？課堂互動第三節(jié)平面色譜法四、操作方法

薄層色譜法的操作可分為制板、點樣、展開、顯色與檢視、系統(tǒng)適用性試驗和測定六個步驟。

52第三節(jié)平面色譜法薄層板：

分為硬板軟板，熒光薄層板等。53符號含意符號含意G以石膏作粘合劑C薄層已被分成條帶H無外加粘合劑Silanised,RP-2二甲基硅烷改性的反相R特別純化的RP反相P制備用RP-8，RP-18C-8，C-18烷基改性W水可濕性的NH2氨基改性親水層F254,366熒光指示劑激發(fā)波長CHIR手性固定相F254S抗酸性熒光指示劑CN氰基改性固定相40,60……平均孔徑（?）DIOL二醇基改性固定相市售吸附劑和預制板包裝上的符號及含意引自/books/C/1