慢性應(yīng)激對大鼠腸道微生態(tài)的影響及松花粉的保健食品作用

慢性應(yīng)激對大鼠腸道微生態(tài)的影響及松花粉的保健食品作用

在該實(shí)驗(yàn)室，我們觀察并研究了在模擬重力損失條件下改變大鼠腸道菌群的變化，結(jié)果表明，在模擬重力損失條件下，大鼠腸道菌群失調(diào)，這意味著從腸道中受益的厭氧菌雙螺線菌的數(shù)量減少，必要氧的細(xì)菌——腸球菌的數(shù)量增加。在大鼠飼料中添加低聚糖水蘇糖可以改善模擬損失大鼠腸菌群的失調(diào)。然而,失重只是航天環(huán)境因素中的一個(gè)方面,噪聲、狹小空間(束縛)、恐懼(束縛)和疲勞(體力上和心理上的)等因素也不可避免地會作用于航天員的身體,使航天員處于一種應(yīng)激狀態(tài),導(dǎo)致神經(jīng)內(nèi)分泌的變化,從而造成全身各器官和系統(tǒng)的改變。這種變化應(yīng)該也會對航天員腸道微生態(tài)平衡產(chǎn)生負(fù)面影響。俄羅斯(前蘇聯(lián))研究人員發(fā)現(xiàn),航天期間所有航天員都發(fā)生不同程度的腸道菌群失調(diào),這種失調(diào)的特點(diǎn)為以厭氧菌為代表的“屏障”微生物種群數(shù)量降低,直至完全消失,在原籍菌的生境中出現(xiàn)過路菌及條件致病菌,這種變化即所謂的腸道微生態(tài)紊亂,能夠?qū)教靻T的健康構(gòu)成潛在威脅。研究表明,機(jī)體胃腸道微生態(tài)的平衡與穩(wěn)定受多種體內(nèi)外因素的影響。航天特殊環(huán)境因素以及神經(jīng)和情緒緊張,在航天員自身微菌群生態(tài)紊亂的形成與發(fā)展中具有重要作用。理論和實(shí)踐都證實(shí),保持機(jī)體腸道微生態(tài)平衡對維護(hù)航天員的健康和佳態(tài)是十分必要的。目前尚未見國內(nèi)關(guān)于在慢性應(yīng)激條件下機(jī)體腸道微生態(tài)變化方面的報(bào)道。本研究擬利用復(fù)合因素大鼠慢性應(yīng)激模型,觀察大鼠以腸道微菌群改變?yōu)橹鞯纳砩兓闆r,探討慢性應(yīng)激條件對機(jī)體腸道微生態(tài)的影響及可能的機(jī)理。通過給大鼠飼料中添加松花粉類保健食品材料,觀察其對慢性應(yīng)激條件下機(jī)體的保健作用。為從膳食營養(yǎng)途徑防護(hù)和改善慢性應(yīng)激因素所致航天員的亞健康狀態(tài)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的確定與模型的建立實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及材料基礎(chǔ)飼料:SPF級大、小鼠生長維持粉末飼料,北京科澳協(xié)力飼料有限公司生產(chǎn)。松花粉:中國林業(yè)科學(xué)院松花粉研究開發(fā)中心當(dāng)年產(chǎn)松花粉。水蘇糖:西安德施普生物制品有限責(zé)任公司生產(chǎn)。大鼠:SPF級清潔SD雄性大鼠,體重(120±10)g,由北京動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。實(shí)驗(yàn)分組及應(yīng)激動(dòng)物模型的建立動(dòng)物購回后適應(yīng)性喂養(yǎng)3d后進(jìn)行分組。根據(jù)動(dòng)物體重將動(dòng)物隨機(jī)平均分為4組,每組10只:正常對照組(normalcontrol,NC),飼喂大鼠基礎(chǔ)飼料;慢性應(yīng)激對照組(chronicstresscontrol,SC),飼喂大鼠基礎(chǔ)飼料;慢性應(yīng)激松花粉組(chronicstresspinepollen,PP),飼喂在基礎(chǔ)飼料中添加了5%亞林松花粉的飼料;慢性應(yīng)激水蘇糖組(stachyose,ST),飼喂在大鼠基礎(chǔ)飼料中添加了1%水蘇糖的飼料。所有大鼠均飲用純凈水,實(shí)驗(yàn)期間大鼠自由進(jìn)食和飲水。慢性應(yīng)激動(dòng)物模型采用3種刺激因素建立慢性應(yīng)激動(dòng)物模型:1)頭低位束縛:束縛造模采用自己研制的束縛筒。該筒由兩部分組成,前部為鐵皮制作的圓椎管形鐵筒,長5cm,大口內(nèi)徑6cm,小口內(nèi)徑2cm,大口與一長25cm的布質(zhì)袖套連接,袖套開口直徑8~10cm,為大鼠的進(jìn)入口。大鼠置入后,驅(qū)使其頭部進(jìn)入鐵皮椎管內(nèi),然后緊貼鼠身體束緊布套,在尾部用別針別住,使其無活動(dòng)空間。大鼠固定后,將其頭低位放置在坡度為15~20°的斜面上,時(shí)間為6h。2)強(qiáng)迫游泳:大鼠在水深50cm、直徑80cm的水箱中游泳,水溫控制在25±2℃左右,將大鼠尾部系1/5體重的負(fù)荷,記錄游泳開始到衰竭(鼻子沒入水中8s為止)的時(shí)間。另外,大鼠進(jìn)食量的多少會影響稱重和游泳時(shí)間,在試驗(yàn)前禁食12h。3)噪聲刺激:噪聲條件為1500Hz,92dB,每次1h,在本所噪聲實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。動(dòng)物分組后進(jìn)食相應(yīng)的飼料,1周后開始正式實(shí)驗(yàn)(目的是觀察各組大鼠的初始狀態(tài)是否有所不同)。每天隨機(jī)選一種應(yīng)激方式作用于應(yīng)激組的動(dòng)物,實(shí)驗(yàn)期46d。具體過程為:第1、6、9、10、13、18、20、21、22、24、27、31、32、35、38、40、43、45天噪聲應(yīng)激;第2、5、8、12、15、17、23、26、30、33、36、39、41、44天強(qiáng)迫游泳;第3、4、7、11、14、16、19、25、28、29、34、37、42、46天束縛應(yīng)激。對照組在不受實(shí)驗(yàn)應(yīng)激原的影響下,同期飼養(yǎng)46d。大鼠每次進(jìn)行游泳實(shí)驗(yàn)時(shí)稱一次體重,觀察其一般生長情況。大鼠腸道菌群分析糞便標(biāo)本采集分別在正式實(shí)驗(yàn)開始前1d(第0天),實(shí)驗(yàn)開始后第7、21、28、32、35和42天,采取逼迫法取大鼠新鮮糞便,第47天處死大鼠后取盲腸內(nèi)容物,進(jìn)行糞便菌群分析。糞便細(xì)菌培養(yǎng)按照熊德鑫厭氧菌分離鑒定方法制備選擇性需氧培養(yǎng)基(EMB、EC)以及厭氧培養(yǎng)基(KV、TPY、MRS)。采樣取大鼠新鮮糞便0.1g左右,立即裝入已稱重并裝有4ml生理鹽水和2~3粒玻璃珠的無菌試管中,裝樣后的試管再次稱重,求得樣本重量,蓋好管塞后放在液體快速振蕩器上混合,制成均勻懸液,然后用生理鹽水以10倍的比例倍比稀釋成系列。取上述處理的樣本系列稀釋液0.01ml接種到5種選擇性培養(yǎng)基上,分別置于厭氧和需氧環(huán)境中培養(yǎng)。需氧培養(yǎng)37℃24h觀察結(jié)果,厭氧培養(yǎng)48h后觀察結(jié)果,記錄菌落數(shù)。計(jì)算公式:每克糞便中的活菌集落數(shù)對數(shù)值CFU/g=log{[標(biāo)本重量(g)+稀釋液量(ml)]/標(biāo)本重量×稀釋度×菌落個(gè)數(shù)×100}生化指標(biāo)的測定實(shí)驗(yàn)結(jié)束日采用斷頭法處死大鼠,收集血液,室溫下凝固20min,低溫離心分離血清(4℃、4000r/min),進(jìn)行血生化指標(biāo)和免疫指標(biāo)的測定。采用雙抗體夾心ABC-ELISA法測定大鼠血清中的促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)和促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)。統(tǒng)計(jì)分析所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以ˉx±s表示,采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析并作t-檢驗(yàn)。慢性應(yīng)激實(shí)驗(yàn)期間大鼠糞被調(diào)節(jié)性指標(biāo)慢性應(yīng)激對大鼠體重增長的影響在實(shí)驗(yàn)期間,對大鼠體重增長情況進(jìn)行了觀察,觀察結(jié)果見表1。從表1可以看出,在慢性應(yīng)激實(shí)驗(yàn)期間,從第1周起,ST和PP組大鼠的體重增長速度明顯減慢,從第3周起,SC組大鼠的體重增長速度也開始明顯減慢。慢性應(yīng)激對大鼠腸道菌群的影響在實(shí)驗(yàn)期間,每隔5~7d進(jìn)行一次大鼠糞便菌群分析,檢測結(jié)果見表1~5。實(shí)驗(yàn)初始檢測結(jié)果各組無差別,資料未給出。從表2可以看出,在慢性應(yīng)激實(shí)驗(yàn)期間,SC組大鼠與其他各組大鼠相比,糞便雙歧桿菌的數(shù)量總體呈下降趨勢,而PP組大鼠則不明顯。從表3可以看出,在慢性應(yīng)激實(shí)驗(yàn)期間,SC組大鼠與其他各組大鼠相比,糞便乳桿菌的數(shù)量除在第1周降低外,其他時(shí)間各組大鼠均無明顯差異。從表4可以看出,在慢性應(yīng)激實(shí)驗(yàn)期間,SC組大鼠與NC組和PP組大鼠相比,除第1周和第7周兩次檢測結(jié)果糞便類桿菌的數(shù)量明顯下降。其它時(shí)間各組大鼠間的差異均不明顯。從表5可以看出,在慢性應(yīng)激實(shí)驗(yàn)期間的大多數(shù)時(shí)間,SC組大鼠與其他各組大鼠相比,糞便腸球菌的數(shù)量明顯升高。從表6可以看出,在慢性應(yīng)激實(shí)驗(yàn)期間,SC組大鼠與PP粉組和ST組大鼠相比,從第4周起,糞便腸桿菌的數(shù)量總體呈增加趨勢。各組大鼠糞便過路菌群與原籍菌群數(shù)量的比值各組大鼠不同時(shí)間內(nèi)過路菌群(腸桿菌與腸球菌)與原籍菌群(雙歧桿菌、乳桿菌與類桿菌)數(shù)量的比值見表7。從表7可以看出,在慢性應(yīng)激實(shí)驗(yàn)期間的大多數(shù)時(shí)間,SC組大鼠糞便過路菌群與原籍菌群數(shù)量的比值均高于其他各組大鼠。提示在慢性應(yīng)激條件下,SC組大鼠發(fā)生了過路菌群中腸桿菌和腸球菌數(shù)量增加、原籍菌群中雙歧桿菌減少為特征的腸道微生態(tài)紊亂的現(xiàn)象。慢性應(yīng)激大鼠神經(jīng)內(nèi)分泌激素的變化為了了解大鼠慢性應(yīng)激期間神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)變化情況,實(shí)驗(yàn)結(jié)束日對大鼠血清促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)和促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)進(jìn)行了測定,測定結(jié)果見表8。從表8結(jié)果可以發(fā)現(xiàn),血清CRH水平慢性應(yīng)激實(shí)驗(yàn)3組大鼠都有升高,但PP和ST組與NC組之間差異無顯著性,而SC組大鼠明顯高于其它3組大鼠。這表明在實(shí)驗(yàn)應(yīng)激因素的作用下,實(shí)驗(yàn)大鼠神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)處于應(yīng)激狀態(tài)。但從血清ACTH水平來看,實(shí)驗(yàn)組3組大鼠均明顯低于NC組大鼠,顯示在慢性應(yīng)激期間,實(shí)驗(yàn)組大鼠神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)功能衰竭。從反應(yīng)程度來看,以SC組大鼠最差。松花粉對慢性應(yīng)激腸道微生態(tài)失調(diào)的作用大腸菌群是人體內(nèi)種類最多、數(shù)量最大的細(xì)菌庫,尤其是以雙歧桿菌為代表的腸道益生菌的數(shù)量和比例對人體具有十分重要的生理意義。在某種程度上可以說,人體腸道微菌群的種類、數(shù)量和比例及相互作用情況即腸道微生態(tài)狀況,與人體的健康息息相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)采用多種刺激因素長時(shí)間反復(fù)作用于大鼠,使大鼠處于慢性應(yīng)激狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在慢性應(yīng)激條件下,大鼠腸道菌群發(fā)生明顯的變化:實(shí)驗(yàn)對照組大鼠腸道菌群中腸球菌數(shù)量顯著增加,腸桿菌的數(shù)量也有增加的趨勢;雙歧桿菌的數(shù)量顯著減少;而乳桿菌數(shù)量變化不太明顯,在所有檢測的菌種中以雙歧桿菌變化最顯著。慢性應(yīng)激組過路菌群的數(shù)量與原籍菌的數(shù)量的比值也比對照組高,說明在慢性應(yīng)激條件下出現(xiàn)了過路菌的增加和/或原籍菌的減少現(xiàn)象。綜上,在慢性應(yīng)激條件下,大鼠腸道菌群之間的平衡被破壞,即出現(xiàn)了腸道微生態(tài)失調(diào),發(fā)生了不利于健康的變化。松花粉組大鼠在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間雙歧桿菌數(shù)量無明顯減少,表明食用松花粉能夠有效地防護(hù)慢性應(yīng)激導(dǎo)致的腸道微生態(tài)失調(diào),且其作用優(yōu)于功能單一的低聚糖。在慢性應(yīng)激條件下,導(dǎo)致大鼠腸道菌群失調(diào)的確切原因尚不清楚,推測與慢性應(yīng)激條件下消化道功能紊亂由關(guān)。在頭低位束縛條件下,身體固定和體液向頭部和上體轉(zhuǎn)移可造成消化道運(yùn)動(dòng)減少,消化液分泌活動(dòng)發(fā)生改變,這些變化對腸道微生態(tài)均有直接影響。已知腸蠕動(dòng)在控制細(xì)菌生長中起重要作用,束縛時(shí)腸蠕動(dòng)減弱,結(jié)腸通過時(shí)間延長,可造成腸內(nèi)腐敗菌的過度增殖,消化液分泌的數(shù)量和性質(zhì)決定食糜的組成,也決定了腸道內(nèi)容物的性狀,從而影響腸道微生物的構(gòu)成。且應(yīng)激本身也可造成消化液分泌、腸道蠕動(dòng)和血流量及黏膜的改變,引起消化道功能紊亂,對腸道益生菌產(chǎn)生不利的影響,從而導(dǎo)致了腸道微生態(tài)的失調(diào)。同時(shí),噪聲刺激和強(qiáng)迫游泳的過程對大鼠也是較大的刺激,大鼠必定對該刺激產(chǎn)生較大的應(yīng)激反應(yīng),并導(dǎo)致神經(jīng)內(nèi)分泌的變化,進(jìn)而引發(fā)一系列全身器官和系統(tǒng)的改變。按塞里學(xué)說,當(dāng)刺激因素長期存在時(shí),機(jī)體神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的功能進(jìn)入衰竭期,表現(xiàn)為CRH升高,ACTH下降,陳易新慢性束縛實(shí)驗(yàn)大鼠觀察到此現(xiàn)象,從本實(shí)驗(yàn)大鼠血清CRH和ACTH的水平似乎也能夠得到證實(shí)。機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)低下時(shí),其中包括消化系統(tǒng)功能紊亂。松花粉防護(hù)慢性應(yīng)激腸道微生態(tài)紊亂的確切機(jī)理仍不清楚。松花粉是我國特有鄉(xiāng)土樹種-馬尾松和油松的花粉,它是松樹花蕊的精細(xì)胞。它含有種類齊全、最佳搭配的營養(yǎng)成分,多達(dá)200余種,凡維生素、氨基酸、酶、脂類、碳水化物和礦物質(zhì)都含有,且每種成份含量均很豐富,全部屬于活性,能在很短的時(shí)間內(nèi)不必經(jīng)消化直接被人體吸收。食用松花粉能夠均衡地補(bǔ)充營養(yǎng)和大量的生命元素,調(diào)節(jié)人體內(nèi)分泌系統(tǒng)和消化功能,有效地增強(qiáng)體質(zhì)、調(diào)整機(jī)體狀態(tài),強(qiáng)化機(jī)體新陳代謝。推測松花粉的防護(hù)作用可能與其