第6章 糖代謝與控制

第六章糖代謝與調(diào)控代謝控制發(fā)酵課程授課教師：張俠E-mail：zhangxia79@第一節(jié)糖代謝與調(diào)節(jié)微生物分解葡萄糖可歸納為有氧降解和無氧降解兩大類型。葡萄糖有氧降解途徑的最終產(chǎn)物是CO2和H2O，同時(shí)產(chǎn)生組成細(xì)胞物質(zhì)的中間產(chǎn)物和大量的能量。主要包括EMP、TCA、HMP途徑。葡萄糖的無氧降解的產(chǎn)物為各種有機(jī)酸、醇和氣體（CO2和H2），主要包括EMP、HMP兩種基本方式。一、EMP途徑EMP途徑是生物界共有的。在該途徑中，葡萄糖被轉(zhuǎn)化為F-1,6-2P后開始降解成PYR，包括10個(gè)獨(dú)立的，但又是連續(xù)的反應(yīng)。PFK是EMP途徑的關(guān)鍵酶，受ATP、O2、檸檬酸的抑制，為AMP所激活。葡萄糖經(jīng)EMP途徑降解成丙酮酸的總反應(yīng)式為：C6H12O6+2NAD++2Pi+2ADP→2PYR+（NADH+H+）+2ATP在無氧條件下，如以乙醛作為受氫體，即是酒精發(fā)酵，如以丙酮酸作為受氫體，即是乳酸發(fā)酵。二、HMP途徑葡萄糖在轉(zhuǎn)化成6-磷酸葡萄糖酸后就分解成為CO2和5-磷酸核酮糖，也就是在單磷酸己糖的基礎(chǔ)上開始降解的。因此常稱為單磷酸己糖途徑，即HMP途徑。這條途徑的主要特點(diǎn)是：⑴葡萄糖直接脫氫和脫羧，不必先經(jīng)過三碳糖階段。⑵只有輔酶Ⅱ（NADP+）參與反應(yīng)。HMP途徑的總反應(yīng)式為：G-6-P+12NADP++7H20→6CO2+12(NADPH+H+)+PiHMP途徑的生物學(xué)意義：⑴HMP途徑是細(xì)胞產(chǎn)生還原力（NADP）的主要途徑。⑵HMP途徑是細(xì)胞內(nèi)不同結(jié)構(gòu)糖分子的重要來源，并為各種單糖的相互轉(zhuǎn)變提供條件。ED途徑主要存在于假單胞菌（Pseudomonassp.）等少數(shù)革蘭氏陰性菌。ED途徑特有的酶是KDPG醛縮酶。它催化己糖裂解為三碳化合物的反應(yīng)。ED途徑的總反應(yīng)式為：Glc+ADP+NADP++NAD+→2PYR+ATP+NADPH+2H++NADH三、ED途徑四、TCA循環(huán)三羧酸循環(huán)又稱檸檬酸循環(huán)，簡稱為TCA循環(huán)，也稱Krebscycle。丙酮酸氧化脫羧產(chǎn)物乙酰CoA與草酰乙酸（三羧酸循環(huán)中與乙酰CoA結(jié)合點(diǎn)）結(jié)合生成檸檬酸進(jìn)入循環(huán)。在循環(huán)過程中，乙酰CoA被氧化成H2O和CO2，并釋放出大量能量。生物氧化葡萄糖在有氧條件下的分解過程，包括3個(gè)環(huán)節(jié)：①底物的脫氫作用；②氫或電子的傳遞；③受氫體接受氫。五、電子傳遞系統(tǒng)與氧化磷酸化六、糖代謝的調(diào)節(jié)1、能荷調(diào)節(jié)糖代謝的調(diào)節(jié)主要是受能荷的控制，也就是受細(xì)胞內(nèi)能量水平的控制。糖代謝最重要的生理功能是以ATP的形式供給熱量，在葡萄糖氧化過程中，中間產(chǎn)物積累或減少，進(jìn)而引起能荷的變化，造成代謝終產(chǎn)物ATP的過?；驕p少。這些中間產(chǎn)物和腺嘌呤核苷酸通過抑制或激活糖代謝各階段關(guān)鍵酶的活性來調(diào)節(jié)能量的生成。能荷（Energycharge）：[（ATP）+1/2（ADP）]/[（ATP）+（ADP）+（AMP）]當(dāng)生物體內(nèi)生物合成或其它需能反應(yīng)加強(qiáng)時(shí)，細(xì)胞內(nèi)ATP分解生成ADP和AMP。一旦ATP減少，ADP或AMP增加，即能荷降低，就會(huì)激活某些催化糖類分解的酶或解除ATP對(duì)這些酶的抑制，并抑制糖原合成的酶，從而加速糖酵解，TCA循環(huán)產(chǎn)生的能量，通過氧化磷酸化作用生成ATP。當(dāng)能荷高時(shí)，即細(xì)胞內(nèi)能量水平高時(shí)，AMP、ADP都轉(zhuǎn)變成ATP，情況則相反。2、生物素的調(diào)節(jié)生物素對(duì)糖酵解的影響，主要是解糖速度，而不是EMP/HMP的比率。當(dāng)生物素充足時(shí)，解糖速度顯著提高，比PYR進(jìn)一步氧化速度提高得快，造成乳酸積累。當(dāng)生物素缺乏時(shí)，由于NAD水平降低的結(jié)果，間接地引起四碳二羧酸氧化能力下降。生物素充足和缺乏條件下，丙酮酸代謝的推測途徑。第二節(jié)D-核糖發(fā)酵一、D-核糖（Ribose）概述D-核糖在體內(nèi)具有重要的生理功能，參與多種新陳代謝活動(dòng)，是生物體內(nèi)遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)RNA、DNA及若干輔酶和維生素的組成成份。在醫(yī)藥上，D-核糖本身作為藥物用于治療心肌缺血、運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的肌肉疼痛。作為醫(yī)藥中間體，D-核糖是大規(guī)模合成核黃素、病毒唑的主要原料，可大幅度降低生產(chǎn)成本。在食品工業(yè)中可以作為調(diào)味品、調(diào)味香料等合成原料。在自然界中，D-核糖不以單體存在，長期以來一直作為昂貴的生化試劑，國內(nèi)需求主要依靠進(jìn)口。用微生物發(fā)酵法可大規(guī)模生產(chǎn)D-核糖，價(jià)格低廉，解決了核黃素、病毒唑等藥物的原料來源，市場應(yīng)用前景非常樂觀。采用生物技術(shù)發(fā)酵法生產(chǎn)D-核糖成本低、污染小，是當(dāng)前最為經(jīng)濟(jì)有效的D－核糖生產(chǎn)方法。目前國際市場上D-核糖價(jià)格是30～40美元/千克，發(fā)酵法生產(chǎn)D-核糖成本約在人民幣150～200元/kg，屬于高附加值產(chǎn)品。二、D-核糖的生物合成途徑葡萄糖在葡萄糖激酶的作用下先生成葡萄糖-6-磷酸（G-6-P），并繼續(xù)由6-磷酸-D-葡萄糖脫氫酶催化轉(zhuǎn)化為6-磷酸-D-葡萄糖酸（6-P-D-Gn）(主要途徑）；G也可以在葡萄糖脫氫酶的作用下生成D-葡萄糖酸（Gn），經(jīng)葡糖酸激酶的催化生成6-P-D-Gn（次要途徑）。所生成的6-P-D-Gn在6-磷酸葡糖酸脫氫酶的作用下生成D-核酮糖-5-磷酸（D-Rn-5-P）。D-Rn-5-P在5-磷酸核酮糖差相異構(gòu)酶的作用下生成D-木酮糖-5-磷酸，也可在5-磷酸核糖異構(gòu)酶的作用下生成D-核酮糖-5-磷酸，后者經(jīng)酶的作用脫去磷酸便形成目的產(chǎn)物D-核糖。三、D-核糖的發(fā)酵機(jī)制D-核糖發(fā)酵是切斷HMP途徑，使微生物改變酶系，積累阻斷反應(yīng)的前體物，進(jìn)行代謝控制發(fā)酵的典型例子。由上面的代謝途徑可以看出，要使微生物積累D-核糖，必須選育喪失轉(zhuǎn)酮酶活力的突變株，由于缺少轉(zhuǎn)酮酶，所以由轉(zhuǎn)酮酶所催化的反應(yīng)就會(huì)發(fā)生阻斷，使D-核糖的前體物D-核糖-5-磷酸大量積累，再經(jīng)酶的作用脫去磷酸便可合成D-核糖。四、D-核糖發(fā)酵的代謝控制育種1、出發(fā)菌株的選擇研究發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌屬（Bacillus）細(xì)菌轉(zhuǎn)酮酶缺陷突變株積累核糖具有普遍性。使用不同的親株，雖然選育出同樣的突變型，但產(chǎn)物的種類也會(huì)有所差異。如芽孢桿菌屬細(xì)菌積累戊糖的現(xiàn)象是很普遍的，而大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌等細(xì)菌的突變株不積累戊糖。因此，多采用芽孢桿菌屬細(xì)菌作為出發(fā)菌株。2、轉(zhuǎn)酮酶缺陷突變株的分離分離轉(zhuǎn)酮酶缺陷突變株，可采用以下遺傳標(biāo)記：⑴選育不利用D-葡萄糖酸或L-阿拉伯糖的突變株。D-葡萄糖酸或L-阿拉伯糖必須通過HMP途徑進(jìn)行代謝。若轉(zhuǎn)酮酶發(fā)生缺陷，菌體自然也就不能利用D-葡萄糖或L-阿拉伯糖。⑵選育莽草酸缺陷突變株。莽草酸是由HMP途徑中的中間產(chǎn)物——D-赤蘚糖-4-磷酸與PEP為前體物而合成的。若轉(zhuǎn)酮酶發(fā)生缺陷，則D-赤蘚糖-4-磷酸合成受阻，也就不會(huì)合成莽草酸。⑶選育L-Trp缺陷、L-Tyr缺陷、L-Phe缺陷、CoQ缺陷、維生素K缺陷或葉酸缺陷突變株。原理同莽草酸缺陷突變株。3、其它標(biāo)記據(jù)報(bào)道，在維持轉(zhuǎn)酮酶缺陷的情況下，進(jìn)一步誘變，使菌體帶上具有高葡萄糖脫氫酶活性和喪失孢子形成能力等標(biāo)記，可使菌體的D-核糖積累量大幅度提高。葡萄糖脫氫酶是芽孢桿菌屬細(xì)菌的孢子所特有的酶，該酶由于NAD、NADP和NADH2、NADPH2會(huì)發(fā)生分子型的變換，結(jié)果在菌體對(duì)數(shù)生長期被誘導(dǎo)，導(dǎo)致D-核糖的大量積累。4、利用基因工程技術(shù)構(gòu)建核糖工程菌株巖盾等人將枯草芽孢菌染色體DNA中的轉(zhuǎn)酮酶基因克隆到載體質(zhì)粒pUB110中，再將氯霉素?；D(zhuǎn)移酶基因插入到轉(zhuǎn)酮酶基因之中，造成轉(zhuǎn)酮酶基因的不可逆失活。經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后得到線狀重組質(zhì)粒，將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到枯草芽孢桿菌宿主中，構(gòu)建出轉(zhuǎn)酮酶失活的D-核糖工程菌株，其D-核糖積累量達(dá)52g/L。小林等人將葡萄糖脫氫酶基因克隆到穿梭載體質(zhì)粒pHY300PLK中，然后轉(zhuǎn)化到枯草芽孢桿菌中，構(gòu)建出D-核糖工程菌株，能積累49g/LD-核糖。5、發(fā)酵控制D-核糖的發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源可以使用葡萄糖、D-甘露糖、山梨醇、D-甘露醇、麥芽糖、乳糖、甘油、糊精、可溶性淀粉等。有機(jī)氮源可以使用干酵母、牛肉膏、蛋白胨、玉米漿等。為促進(jìn)生長，尚需添加少量(NH4)2SO4，同時(shí)加入適量的CaCO3，以便中和發(fā)酵過程中生成的SO42-。由于葡萄糖生成核糖的反應(yīng)酶系與3個(gè)脫氫酶有關(guān)，所以，核糖發(fā)酵在好氣條件下進(jìn)行。一般要求pH中性，溫度37℃左右。第三節(jié)檸檬酸的發(fā)酵機(jī)制一、概述檸檬酸的應(yīng)用

檸檬酸（Citricacid）又名枸櫞酸，學(xué)名α-羥基丙烷三羧酸，是生物體主要代謝產(chǎn)物之一。

1)

飲料與冰淇淋檸檬酸廣泛用于配制各種水果型的飲料以及軟飲料。檸檬酸本身是果汁的天然成分之一，不僅賦于飲料水果風(fēng)味，而且具有增溶、緩沖、抗氧化等作用，能使飲料中的糖、香精、色素等成分交融協(xié)調(diào)，形成適宜的口味和風(fēng)味；添加檸檬酸可以改善冰淇淋的口味，增加乳化穩(wěn)定性，防止氧化作用。2)

果醬與釀造酒檸檬酸在果醬與果凍中同樣可以增進(jìn)風(fēng)味，并使產(chǎn)品抗氧化作用。由于果醬、果凍的凝膠性質(zhì)需要一定范圍的pH值，添加一定量的檸檬酸可以滿足這一要求。當(dāng)葡萄或其它釀酒原料成熟過度而酸度不足時(shí)，可以用檸檬酸調(diào)節(jié)，以防止所釀造的酒口味單薄。檸檬酸加到這些果汁中還有抗氧化和保護(hù)色素的作用，以保護(hù)果汁的新鮮感和防止變色。3)

腌制與罐頭食品

各種肉類和蔬菜在腌制加工時(shí)，加入或涂上檸檬酸可以改善風(fēng)味，除腥去臭，抗氧化。加入檸檬酸除了調(diào)酸作用之外，還有螯合金屬離子的作用，保護(hù)其中的抗壞血酸，使之不被金屬離子破壞。檸檬酸添加到植物油中也有類似的作用。4)

其它在醫(yī)藥工業(yè)中，檸檬酸作為抗凝血?jiǎng)?，可防止血液中凝血的產(chǎn)生。還可用于生產(chǎn)檸檬酸鈉作輸血?jiǎng)?。在化學(xué)工業(yè)中，檸檬酸三乙酯、三丁酯可作肥皂或香皂的添加劑，檸檬酸鋅可作為微量元素肥料使用。在洗滌劑工業(yè)中，檸檬酸在無磷酸鹽洗衣粉、液體洗滌劑等配方中使用，可代替三聚磷酸鈉，增強(qiáng)洗滌劑的去污能力。檸檬酸的消費(fèi)領(lǐng)域：飲料行業(yè)占40～45％食品添加劑等占15～20％洗滌劑占20～30％醫(yī)藥占5％其它占10％2004年全