生物技術(shù)制藥復(fù)習(xí)題

生物技術(shù)制藥復(fù)習(xí)題第一章緒論第一節(jié)生物技術(shù)的發(fā)展史1、生物技術(shù)：以生命科學(xué)為基礎(chǔ)，運(yùn)用生物體的特性和功效，設(shè)計(jì)構(gòu)建含有與其性狀的新物種或新品系，并與工程結(jié)合，運(yùn)用這樣的新物種進(jìn)行加工生產(chǎn)，為社會(huì)提供商品服務(wù)的一種綜合性技術(shù)體系。它的范疇：基因工程、細(xì)胞工程、酶工程、發(fā)酵工程、生化工程?；蚬こ淌巧锛夹g(shù)的核心。P12、蛋白質(zhì)工程第二代基因工程；海洋生物技術(shù)第三代生物技術(shù)P13、生物技術(shù)發(fā)展史：傳統(tǒng)、近代（抗生素、發(fā)酵罐）、當(dāng)代（DNA重組）P31974年，Boyer和Cohen建立了DNA重組技術(shù)1975年，Koher和Milstein建立了單克隆抗體技術(shù)1982年，第一種基因工程藥品重組人胰島素被同意上市1989年，我國(guó)第一種基因工程藥品干擾素同意上市，中國(guó)的重組腺病毒-p53注射液成為石階上第一種正式同意的基因治療藥品。第二節(jié)生物技術(shù)藥品1、生物技術(shù)制藥：生物技術(shù)制藥：采用當(dāng)代生物技術(shù)人為地發(fā)明某些條件，借助某些微生物、植物或動(dòng)物來(lái)生產(chǎn)所需的醫(yī)藥品。P42、生物技術(shù)藥品：采用DNA重組技術(shù)活其它生物技術(shù)研制的蛋白質(zhì)或核酸類(lèi)藥品。它與天然生化藥品、微生物藥品、海洋藥品和生物制品共同歸為生物藥品。3、當(dāng)代生物藥品分為4類(lèi)：重組DNA技術(shù)制造的基因重組多肽、蛋白質(zhì)類(lèi)治療劑；基因藥品；天然藥品；合成與部分合成藥品。4、生物藥品按用途分為：治療藥品；防止藥品；診療藥品。5、生物技術(shù)藥品的特性：（1）分子構(gòu)造復(fù)雜；（2）含有種屬特異性；（3）治療針對(duì)性強(qiáng)、療效高；（4）穩(wěn)定性差（5）基因穩(wěn)定性；（6）免疫原性；（7）體內(nèi)半衰期短；（8）受體效應(yīng)；（9）多效性和網(wǎng)絡(luò)性效應(yīng)；（10）檢查的特殊性。第三節(jié)生物技術(shù)制藥1、生物技術(shù)制藥的特性：高技術(shù)、高投入、長(zhǎng)周期、高風(fēng)險(xiǎn)、高收益。P52、生物技術(shù)在制藥中的應(yīng)用有哪些？P7（1）基因工程制藥：①開(kāi)發(fā)基因工程藥品，如干擾素（IFN）、紅細(xì)胞生成素（EPO）等②基因工程疫苗，如乙肝基因工程疫苗③基因工程抗體，它能夠作為導(dǎo)向藥品的載體④基因診療與基因治療⑤應(yīng)用基因工程技術(shù)建立新藥的篩選模型⑥應(yīng)用極影工程激活素改良菌種，產(chǎn)生新的微生物藥品⑦改善藥品生產(chǎn)工藝⑧運(yùn)用轉(zhuǎn)基因動(dòng)、植物生產(chǎn)蛋白質(zhì)類(lèi)藥品。（2）細(xì)胞工程制藥①單克隆抗體技術(shù)②動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)③植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)次級(jí)代謝產(chǎn)物。（3）酶工程制藥：酶與細(xì)胞的固定化及酶轉(zhuǎn)化制藥（4）發(fā)酵工程制藥：發(fā)酵工藝改善、新藥研制、菌種改造。第二章基因工程制藥第一節(jié)概述（略）第二節(jié)基因工程藥品的生產(chǎn)過(guò)程P151、基因工程技術(shù)：將重組對(duì)象的目的基因插入載體，拼接后轉(zhuǎn)入新的宿主細(xì)胞，構(gòu)建成工程菌(或細(xì)胞），實(shí)現(xiàn)遺傳物質(zhì)的重新組合，并使目的基因在工程菌內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和體現(xiàn)的技術(shù)。2、基因工程藥品制造的重要程序（過(guò)程）（重點(diǎn)和背面幾節(jié)聯(lián)系起來(lái)）（1）目的基因的克?。ǚ蛛x目的基因）：通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄、反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒从场⒒瘜W(xué)合成辦法來(lái)制備cDNA，再通過(guò)核酸探針雜交或免疫反映來(lái)篩選目的基因（2）目的基因與載體連接構(gòu)建DNA重組體：通過(guò)限制性?xún)?nèi)切酶DNA連接酶等核酸酶，把目的基因組入載體的有關(guān)克隆位點(diǎn)，慣用的載體有質(zhì)粒載體和噬菌體載體（3）將DNA重組體轉(zhuǎn)入宿主菌構(gòu)建工程菌：慣用的宿主菌有大腸桿菌、酵母菌等，先使宿主菌處在感受態(tài)，再通過(guò)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)等方式把重組DNA導(dǎo)入宿主菌，以構(gòu)建工程菌（4）工程菌發(fā)酵：提供適宜的培養(yǎng)基、反映器、控制好發(fā)酵過(guò)程中的多個(gè)參數(shù)，如溫度、PH、溶氧等，并通過(guò)升溫來(lái)誘導(dǎo)產(chǎn)物體現(xiàn)（5）目的基因體現(xiàn)產(chǎn)物的分離純化：通過(guò)固液分離、初步純化、高度純化、成品加工來(lái)制備產(chǎn)品；若是胞內(nèi)產(chǎn)物需要細(xì)胞破碎，若是包涵體則需要變性和復(fù)性（6）產(chǎn)品的檢查：檢測(cè)產(chǎn)品的質(zhì)量和性能。第三節(jié)目的基因的獲得1、運(yùn)用基因工程生產(chǎn)蛋白質(zhì)或多肽需要得到其基因，制備目的基因慣用的辦法有哪些？P16（1）逆轉(zhuǎn)錄法以mRNA為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄的到cDNA，構(gòu)建cDNA文庫(kù)，從cDNA文庫(kù)中篩選目的基因。由于RNA轉(zhuǎn)錄加工過(guò)程中，內(nèi)含子序列已被剪切掉，因此，cDNA文庫(kù)中無(wú)內(nèi)含子，適于在原核系統(tǒng)中體現(xiàn)。但是，cDNA只包含蛋白質(zhì)的構(gòu)造基因部分，缺少有關(guān)的調(diào)控序列，因此在原核系統(tǒng)中體現(xiàn)，還需要根據(jù)體現(xiàn)載體的構(gòu)造，配以對(duì)應(yīng)的調(diào)控序列。（2）運(yùn)用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒从持苽浠颍?）化學(xué)合成法：只合用于克隆小分子肽的基因2、運(yùn)用逆轉(zhuǎn)錄法獲得目的基因的基本過(guò)程P16（1）mRNA的純化：從體現(xiàn)目的基因的細(xì)胞中提取總RNA，用寡聚脫氧胸苷（dT）纖維素柱從總RNA中提取純化mRNA。（2）cDNA的合成：以mRNA為模板，運(yùn)用逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第一鏈，再用DNA聚合酶合成cDNA的雙鏈。（3）cDNA克?。哼\(yùn)用適宜的連接辦法，將產(chǎn)生的雙鏈cDNA片段插入到適宜的載體中。（4）構(gòu)建cDNA文庫(kù)：將cDNA與載體連接的重組體轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，產(chǎn)生的克隆群體為cDNA文庫(kù)。（5）從cDNA文庫(kù)中篩選目的基因：得到cDNA文庫(kù)后，普通采用核酸探針雜交法和免疫反映鑒定法從數(shù)以萬(wàn)計(jì)的DNA片段中篩選出目的基因。3、載體分為：體現(xiàn)型載體和非體現(xiàn)型載體。P17第四節(jié)基因體現(xiàn)1、基因體現(xiàn)：指構(gòu)造基因在生物體中的轉(zhuǎn)錄、翻譯以及全部加工過(guò)程。P202、基因高效體現(xiàn)研究：指外源基因在某種細(xì)胞中的體現(xiàn)活動(dòng)，即剪切下外源基因片段，拼接到另一種基因體現(xiàn)體系中，使其能獲得原生物活性又可高產(chǎn)的體現(xiàn)產(chǎn)物。P203、基因體現(xiàn)的微生物宿主細(xì)胞分為兩大類(lèi)：P21第一類(lèi)為原核細(xì)胞（慣用的有大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鏈霉菌等）；⑴大腸桿菌（現(xiàn)在仍是基因工程研究中采用最多的原核體現(xiàn)體系）：體現(xiàn)基因產(chǎn)物形式多樣，大腸桿菌中的體現(xiàn)不存在信號(hào)肽，產(chǎn)品多為胞內(nèi)產(chǎn)物，提取困難。因分泌能力局限性，真核蛋白質(zhì)常形成不溶性的包含體，體現(xiàn)產(chǎn)物需經(jīng)變性復(fù)性才恢復(fù)活性。蛋白質(zhì)不能糖基化。產(chǎn)物蛋白質(zhì)N端多出一種蛋氨酸殘基。其內(nèi)毒素很難除去。⑵枯草芽胞桿菌：分泌能力強(qiáng)，蛋白質(zhì)不形成包含體。產(chǎn)物蛋白質(zhì)不能糖基化。有很強(qiáng)的胞外蛋白酶對(duì)產(chǎn)物降解。⑶鏈霉菌：作為外源性基因體現(xiàn)受到重視。不致病、使用安全、分泌能力強(qiáng)、體現(xiàn)產(chǎn)物可糖基化。第二類(lèi)為真核細(xì)胞（慣用的真核微生物有酵母、絲狀真菌等）⑴酵母：酵母菌是研究基因體現(xiàn)最有效的單細(xì)胞真核微生物。其基因組小，世代時(shí)間短，有單倍體雙倍體兩種形式，繁殖快速，無(wú)毒性。能外分泌，產(chǎn)物可糖基化。已有不少真核基因成功體現(xiàn)⑵絲狀真菌：分泌能力強(qiáng)，能對(duì)的進(jìn)行翻譯后加工（肽剪切糖基化）有成熟的發(fā)酵和后解決工藝。4、現(xiàn)在使用最廣泛的宿主菌是大腸桿菌和釀酒酵母。P225、大腸桿菌基因體現(xiàn)載體P23（1）pBV220系統(tǒng)pBV220系統(tǒng)國(guó)內(nèi)使用最多的載體,其構(gòu)成：①來(lái)源于pUC8多克隆位點(diǎn)；②核糖體rrnB基因終止信號(hào)；③pBR322第4225～3735位；④pUC18第2066～680位；⑤λ噬菌體cIts857克制子基因及PR啟動(dòng)子；⑥pRC23的PL啟動(dòng)子及SD序列（2）pET系統(tǒng)6、影響目的基因在大腸桿菌中體現(xiàn)的因素P22外源基因體現(xiàn)產(chǎn)量與細(xì)胞濃度和細(xì)胞體現(xiàn)產(chǎn)量呈正有關(guān)。單個(gè)細(xì)胞產(chǎn)量取決于：（1）外源基因的劑量：普通來(lái)說(shuō)細(xì)菌內(nèi)基因拷貝數(shù)增加，基因的體現(xiàn)產(chǎn)物也增加。（2）外源基因的體現(xiàn)效率①啟動(dòng)子的強(qiáng)弱：?jiǎn)?dòng)子是在轉(zhuǎn)錄水平上影響基因體現(xiàn)的因素。需要尋找強(qiáng)的啟動(dòng)子。②核糖體結(jié)合位點(diǎn)的有效性：大腸桿菌核糖體結(jié)合位點(diǎn)對(duì)真核基因在細(xì)菌中的高效體現(xiàn)是十分重要的。③SD序列和起始密碼ATG的間距：體現(xiàn)非融合蛋白的核心是原核SD序列和真核起始密碼ATG之間的距離，距離過(guò)長(zhǎng)過(guò)短都影響真核基因的體現(xiàn)。④密碼子構(gòu)成：應(yīng)選擇使用大腸桿菌偏愛(ài)的密碼子。（3）體現(xiàn)產(chǎn)物的穩(wěn)定性：（4）細(xì)胞的代謝負(fù)荷：必須使宿主細(xì)胞的代謝負(fù)荷不至過(guò)重，又能高效體現(xiàn)出外源基因產(chǎn)物。（5）工程菌的培養(yǎng)條件外源基因的高水平體現(xiàn)，不僅涉及宿主、載體和克隆基因三者之間的互有關(guān)系，并且與其所處的環(huán)境條件息息有關(guān)，必須進(jìn)行優(yōu)化。7、真核基因在大腸桿菌中的體現(xiàn)形式P26⑴以融合蛋白的形式體現(xiàn)藥品基因以原核多肽和真核蛋白結(jié)合在一起稱(chēng)融合蛋白。優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便，體現(xiàn)蛋白在菌體內(nèi)穩(wěn)定，易實(shí)現(xiàn)高效體現(xiàn)；缺點(diǎn)：只能作抗原用。⑵以非融合蛋白的形式體現(xiàn)藥品基因非融合蛋白指在大腸桿菌中體現(xiàn)的蛋白質(zhì)以真核蛋白的mRNA的AUG為起始，在其氨基端不含細(xì)菌多肽序列。優(yōu)點(diǎn)：保持原有蛋白活性；缺點(diǎn)：易被蛋白酶破壞。⑶分泌型體現(xiàn)藥品基因（外源基因融合到編碼原核蛋白信號(hào)肽序列的下游）優(yōu)點(diǎn)：在周質(zhì)中穩(wěn)定，有活性，不含蛋氨酸殘基；缺點(diǎn)：產(chǎn)量不高，信號(hào)肽不被切割。8、載體有關(guān)定義載體：在基因工程重組DNA技術(shù)中將DNA片段(目的基因)轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞的一種能自我復(fù)制的DNA分子?？寺≥d體：從病毒、質(zhì)?；蚋叩壬锛?xì)胞中獲取的DNA作為載體，在其上插入適宜大小的外源DNA片段，將重組后的載體引入到宿主細(xì)胞中，并在宿主細(xì)胞中大量繁殖。體現(xiàn)載體：在克隆載體基本骨架的基礎(chǔ)上增加體現(xiàn)元件(如啟動(dòng)子、RBS、終止子等)，是目的基因能夠體現(xiàn)的載體。穿梭載體：指含有兩個(gè)親緣關(guān)系不同的復(fù)制子，能在兩種不同的生物中復(fù)制的載體（例如既能在原核生物中復(fù)制,又能在真核生物中復(fù)制的載體）。9、載體的復(fù)制系列可分四類(lèi)：P27（1）Yep類(lèi)（酵母附加體質(zhì)粒）（2）YRp類(lèi)（酵母復(fù)制型質(zhì)粒）（3）YCp類(lèi)（酵母著絲粒質(zhì)粒）（4）YIp類(lèi)（酵母整合型質(zhì)粒）10、影響目的基因在酵母菌中體現(xiàn)的因素⑴外源基因的拷貝數(shù)⑵外源基因的體現(xiàn)效率：①啟動(dòng)子②分泌信號(hào)的效率③終止序列的影響⑶外源蛋白的糖基化⑷宿主菌株的影響：①菌體生長(zhǎng)力強(qiáng)②菌體內(nèi)源蛋白酶要較弱③菌體性能穩(wěn)定④分泌能力強(qiáng)11、精確體現(xiàn)載體P28酵母載體有兩類(lèi)：普通體現(xiàn)載體和精確體現(xiàn)載體。精確體現(xiàn)載體：規(guī)定在啟動(dòng)子或前導(dǎo)肽編碼序列的適宜部位有內(nèi)切酶位點(diǎn)，以利于接入外源基因，并使它在體現(xiàn)和加工后氮末端氨基酸序列與天然產(chǎn)物相似，既無(wú)多出的氨基酸，也無(wú)缺失的氨基酸的克隆載體。第五節(jié)基因工程菌生長(zhǎng)代謝的特點(diǎn)1、碳源物質(zhì)為細(xì)胞提供能量，當(dāng)菌體生長(zhǎng)所需能量不不大于菌體有氧代謝提供的能量時(shí)，菌體會(huì)產(chǎn)生乙酸，造成培養(yǎng)基的pH值下降，從而影響菌體的生長(zhǎng)。適宜提高pH，可減少乙酸的克制作用；P31第六節(jié)基因工程菌的不穩(wěn)定性1、質(zhì)粒不穩(wěn)定分為那兩類(lèi)？P32工程菌在傳代過(guò)程中經(jīng)常出現(xiàn)質(zhì)粒不穩(wěn)定的現(xiàn)象，質(zhì)粒不穩(wěn)定分為分裂不穩(wěn)定和構(gòu)造不穩(wěn)定。質(zhì)粒的分裂不穩(wěn)定是指工程菌在分裂時(shí)出現(xiàn)一定比例的不含質(zhì)粒的子代菌的現(xiàn)象。與含質(zhì)粒菌產(chǎn)生不含質(zhì)粒子代菌的頻率；這兩種菌比數(shù)率差別的大小有關(guān)質(zhì)粒的構(gòu)造不穩(wěn)定是指外源基因從質(zhì)粒上丟失或堿基重排、缺失所致工程菌性能的變化?；?、提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的辦法P33（1）選擇適宜的宿主菌：遺傳穩(wěn)定（2）選擇適宜的載體：高拷貝數(shù)；（3）選擇壓力：如加抗生素提高穩(wěn)定性；（4）分階段控制培養(yǎng)：先使菌體生長(zhǎng)至一定密度；再誘導(dǎo)外源基因的體現(xiàn)（5）控制培養(yǎng)條件（6）固定化第八節(jié)重組工程菌的培養(yǎng)1、基因工程菌的培養(yǎng)方式P36（1）分批培養(yǎng)（2）補(bǔ)料分批培養(yǎng)：將種子接入發(fā)酵反映器中進(jìn)行培養(yǎng),通過(guò)一段時(shí)間后間歇或持續(xù)地補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基，使菌體進(jìn)一步生長(zhǎng)的辦法。（3）持續(xù)培養(yǎng)（4）透析培養(yǎng)（5）固定化培養(yǎng)2、基因工程菌的培養(yǎng)工藝P37（1）培養(yǎng)基的影響（2）接種量的影響（3）溫度的影響（4）溶氧量的影響（5）誘導(dǎo)時(shí)機(jī)的影響（6）誘導(dǎo)體現(xiàn)程序的影響：普通在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)久或?qū)?shù)生長(zhǎng)后期升溫誘導(dǎo)體現(xiàn)。（7）pH的影響：生長(zhǎng)pH在6.8～7.4左右，后期外源蛋白的體現(xiàn)其最佳pH為6.0～6.5。第九節(jié)高密度發(fā)酵（1）高密度發(fā)酵：一種相對(duì)概念，普通指培養(yǎng)基中工程菌的菌體濃度在50gDCW/L以上，理論上的最高值可達(dá)200gDCW/L。（2）影響高密度發(fā)酵的因素：培養(yǎng)基；溶氧濃度；pH；溫度；代謝副產(chǎn)物（3）實(shí)現(xiàn)高密度發(fā)酵的辦法①發(fā)酵條件的改善a.培養(yǎng)基的選擇（普遍采用6g/L的甘油為碳源）；b.建立流加式培養(yǎng)的方式；c.提高供氧能力②構(gòu)建出產(chǎn)乙酸能力低的工程化宿主菌a.阻斷乙酸產(chǎn)生的重要途徑；b.對(duì)碳代謝流進(jìn)行分流；c.限制進(jìn)入糖酵解途徑的碳代謝流；d.引入血紅蛋白基因③構(gòu)建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌第十節(jié)基因工程藥品的分離純化1、體現(xiàn)的產(chǎn)物都是多肽或蛋白質(zhì)，它的制得含有下列特點(diǎn)：（1）體現(xiàn)產(chǎn)物在初始料中含量較低；（2）含有大量細(xì)胞及代謝產(chǎn)物；（3）體現(xiàn)產(chǎn)物穩(wěn)定性差，易失活變性；（4）體現(xiàn)產(chǎn)物的種類(lèi)繁多、構(gòu)造不一、活性各異；（5）對(duì)其質(zhì)量規(guī)定純度高、無(wú)菌、無(wú)熱原。2、分離純化的基本過(guò)程若是敘述題最佳對(duì)過(guò)程進(jìn)行一定的介紹3、建立分離純化工藝的根據(jù)（1）含目的產(chǎn)物的起始料的特點(diǎn)基因工程菌的發(fā)酵產(chǎn)物其上游過(guò)程的多個(gè)因素對(duì)分離、純化工藝有影響。涉及：①菌種的類(lèi)型及其代謝特性。②原材料培養(yǎng)基的來(lái)源及其質(zhì)量。③生產(chǎn)工藝及條件。（2）物料中雜質(zhì)的種類(lèi)和性質(zhì)。（3）目的產(chǎn)物特性。（4）產(chǎn)品質(zhì)量的規(guī)定4、細(xì)胞破碎與固液分離⑴細(xì)胞收集：離心法、膜分離法。⑵細(xì)胞破碎：機(jī)械破碎法、非機(jī)械破碎法；物理法、化學(xué)法、生物法⑶固液分離：離心、膜過(guò)濾、雙水相萃取5、細(xì)胞破碎的辦法；P47（1）物理辦法：勻漿法、珠磨法、超聲波法（2）化學(xué)法：滲入沖擊法（高滲+低滲）、增溶法（表面活性劑等）（3）生物法：酶溶法6、分離純化慣用的色譜分離辦法有那些？P50分離純化重要依賴(lài)色譜分離辦法。色譜技術(shù)是醫(yī)藥生物技術(shù)下游過(guò)程精制階段的慣用手段，其優(yōu)點(diǎn)是該法含有多個(gè)多樣的分離機(jī)制、設(shè)備簡(jiǎn)樸、便于自動(dòng)化控制和分離過(guò)程中無(wú)發(fā)熱等有害效應(yīng)。色譜技術(shù)分為離子交換色譜、疏水色譜、反相色譜、親和色譜、凝膠過(guò)濾色譜、高壓液相色譜等。（1）離子交換層析P51離子交換介質(zhì)由三部分構(gòu)成：（1）不溶性高分子聚合物—載體；（2）共價(jià)鍵結(jié)合于載體上活性基團(tuán)或功效集團(tuán)（3）與活性基團(tuán)帶相反電荷平衡離子或反離子（決定是陰離子交換樹(shù)脂還是陽(yáng)離子交換樹(shù)脂）如：酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂R-SO3H蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和表面電荷的分布重要影響離子交換的性能。它由平衡、上樣、洗脫（分為梯度洗脫和階段洗脫2種）、再生4個(gè)重要環(huán)節(jié)構(gòu)成。（2）疏水層析P54運(yùn)用蛋白質(zhì)分子表面上的疏水區(qū)域和介質(zhì)中的疏水基團(tuán)之間的互相作用，無(wú)機(jī)鹽的存在能使互相作用力增強(qiáng)。流動(dòng)相為pH6～8鹽水溶液。慣用的介質(zhì)是多聚糖（如瓊脂糖）和硅膠。（3）親和層析P4756親和層析是運(yùn)用固定化配基與目的蛋白質(zhì)之間特異的生物親和力進(jìn)行吸附，如抗體與抗原、受體與激素、酶與底物之間的作用。洗脫時(shí)分為特異性洗脫和非特異性洗脫。（4）凝膠過(guò)濾層析P59凝膠過(guò)濾是以含有大小一定的多孔性凝膠作為分離介質(zhì)，小分子能進(jìn)入孔內(nèi)，在柱中緩慢移動(dòng)，而大分子不能進(jìn)入孔內(nèi)，快速移動(dòng)，大分子量物質(zhì)先流出，小分子物質(zhì)后流出。運(yùn)用這種移動(dòng)差別可使大分子與小分子分開(kāi)。7、用于分離純化的技術(shù)應(yīng)滿(mǎn)足那些規(guī)定？P62(1)技術(shù)條件溫和，能保持目的產(chǎn)物的生物活性。(2)選擇性好，能從復(fù)雜的混合物中有效地將目的產(chǎn)物分離出來(lái)，達(dá)成較高純化倍數(shù)。(3)收率要高。(4)兩個(gè)技術(shù)之間不需要對(duì)物料加以解決或調(diào)節(jié)，這樣能夠減少工藝環(huán)節(jié)。(5)整個(gè)分離純化過(guò)程要快速，能夠滿(mǎn)足高生產(chǎn)率的規(guī)定。第十一節(jié)變性蛋白的復(fù)性1、外源基因在大腸桿菌中的高體現(xiàn)經(jīng)常造成包涵體的形成P632、包涵體：指細(xì)菌體現(xiàn)的蛋白在細(xì)胞內(nèi)凝集，形成無(wú)活性的固體顆粒。3、包涵體的分離和溶解P63（1）包涵體的分離：重組菌破碎后，離心得沉淀部分，再用低濃度變性劑（脲或鹽酸胍）、去垢劑（TritonX-100）、脫氧膽酸鈉洗滌。（2）包涵體溶解：般用強(qiáng)的變性劑如脲（6-8M）、鹽酸胍（6M），或用去垢劑，如SDS、正十六烷基三甲基銨氯化物等，溶解涵體蛋白質(zhì)。（3）包涵體復(fù)性：稀釋復(fù)性和透析復(fù)性；含二硫鍵的蛋白的復(fù)性；封閉蛋白的疏水蔟增進(jìn)復(fù)性；凝膠過(guò)濾層析復(fù)性；小分子添加劑增進(jìn)的復(fù)性；分子伴侶或折疊酶增進(jìn)的復(fù)性；人工分子伴侶的復(fù)性第十二節(jié)基因工程藥品的質(zhì)量控制1、由基因重組技術(shù)所獲得的蛋白質(zhì)藥品產(chǎn)品進(jìn)行鑒定時(shí)，常作那些項(xiàng)目分析？P68（1）肽圖分析肽圖分析是用酶法或化學(xué)法降解目的蛋白質(zhì)后，對(duì)生成的肽段進(jìn)行的分離分析。它是一種可檢測(cè)蛋白質(zhì)一級(jí)構(gòu)造中細(xì)微變化的最有效辦法，該技術(shù)敏捷高效的特點(diǎn)使其成為對(duì)基因工程藥品的分子構(gòu)造和遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)和驗(yàn)證的首選辦法。（2）氨基酸成分分析在氨基酸成分分析中，普通含50個(gè)左右的氨基酸殘基的蛋白質(zhì)的定量分析是靠近理論值的，即與序列分析成果一致。（3）部分氨基酸序列分析部分氨基酸序列分析（N端15個(gè)氨基酸）可作為重組蛋白質(zhì)和多肽的重要鑒定指標(biāo)。（4）重組蛋白質(zhì)的濃度測(cè)定和分子量測(cè)定蛋白質(zhì)濃度測(cè)定辦法重要有凱氏定氮法、雙縮脲法、染料結(jié)合比色法、福林-酚法和紫外法等。蛋白質(zhì)分子量測(cè)定最慣用的辦法有凝膠過(guò)濾法和SDS法，凝膠過(guò)濾法是測(cè)定完整的蛋白質(zhì)分子量，而SDS法測(cè)定的是蛋白質(zhì)亞基的分子量。（5）蛋白質(zhì)二硫鍵分析二硫鍵和巰基與蛋白質(zhì)的生物活性親密有關(guān)，基因工程藥品產(chǎn)品的硫-硫鍵與否對(duì)的配對(duì)是一種重要問(wèn)題。第三章動(dòng)物細(xì)胞制藥第一節(jié)概述細(xì)胞工程：是指以細(xì)胞為對(duì)象，應(yīng)用生命科學(xué)理論，借助工程學(xué)原理與技術(shù)，有目的地運(yùn)用第二節(jié)動(dòng)物細(xì)胞的形態(tài)和生理特點(diǎn)（重點(diǎn)）1、離體培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞分為那些類(lèi)型？P81動(dòng)物細(xì)胞適應(yīng)功效,形態(tài)各異。離體培養(yǎng)細(xì)胞分兩類(lèi)：貼壁細(xì)胞；懸浮細(xì)胞（1）貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)須有貼附的支持物表面，本身分泌或培養(yǎng)基中提供的貼附因子才干在該表面上生長(zhǎng)。兩種形態(tài)：成纖維細(xì)胞型和上皮細(xì)胞型（2）懸浮細(xì)胞：生長(zhǎng)不依賴(lài)支持物表面，在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)生長(zhǎng)。如淋巴細(xì)胞。（3）兼性貼壁細(xì)胞：生長(zhǎng)不嚴(yán)格依賴(lài)支持物。如中國(guó)地鼠卵巢細(xì)胞，小鼠L929細(xì)胞。2、什么是接觸克制現(xiàn)象？P84當(dāng)細(xì)胞在基質(zhì)上分裂增殖，逐步匯合成片時(shí)，即每個(gè)細(xì)胞與其周邊的細(xì)胞互相接觸時(shí)，細(xì)胞就停止增殖。此時(shí)若能保持充足的營(yíng)養(yǎng)，細(xì)胞仍可存活相稱(chēng)一段時(shí)間，但細(xì)胞密度不再增加，因此該現(xiàn)象又稱(chēng)之謂接觸克制或密度依賴(lài)克制現(xiàn)象。一旦細(xì)胞轉(zhuǎn)化為異倍體后，該現(xiàn)象隨之消失，細(xì)胞可多層生長(zhǎng)。細(xì)胞密度也就可大大增加。3、動(dòng)物細(xì)胞的生理特點(diǎn)P83（1）細(xì)胞的分裂周期長(zhǎng)動(dòng)物細(xì)胞分裂所需的時(shí)間普通為12～48h，它不僅隨細(xì)胞種屬的不同而不同，就是同一種屬的，不同部位的細(xì)胞其所需的時(shí)間也不同。周期=間期+分裂期間期（G1+S+G2）分裂期（M）（2）細(xì)胞生長(zhǎng)需貼附于基質(zhì)，并有接觸克制現(xiàn)象(3)正常二倍體細(xì)胞的生長(zhǎng)壽命是有限的(4)動(dòng)物細(xì)胞對(duì)周邊環(huán)境十分敏感。動(dòng)物細(xì)胞對(duì)多個(gè)物理化學(xué)因素，如滲入壓，pH，離子濃度，剪切力，微量元素等的變化耐受力很弱。(5)動(dòng)物細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基的規(guī)定高氨基酸、維生素，多個(gè)無(wú)機(jī)鹽和微量元素，細(xì)胞生長(zhǎng)因子、貼壁因子。(6)動(dòng)物細(xì)胞對(duì)蛋白質(zhì)的合成途徑和修飾功效與細(xì)菌不同動(dòng)物細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成除了在游離的核糖體上進(jìn)行外，還在與糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上結(jié)合的核糖體上進(jìn)行。（游離核糖體合成蛋白質(zhì)用于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)內(nèi)。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的核糖體合成蛋白質(zhì)是分泌的和膜中的整合蛋白多為糖蛋白。）3、動(dòng)物細(xì)胞作為宿主細(xì)胞生產(chǎn)藥品的特點(diǎn)；P85（1）優(yōu)點(diǎn)：產(chǎn)品多分泌在胞外，收集純化方便，得到較完善的翻譯后修飾，特別是糖基化，因此與天然產(chǎn)品更一致，適于臨床（2）缺點(diǎn)：培養(yǎng)條件規(guī)定高，成本貴，產(chǎn)量低第三節(jié)生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的規(guī)定和獲得1、生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的種類(lèi)及其特點(diǎn)P86用于生產(chǎn)的動(dòng)物細(xì)胞有三類(lèi)，即原代細(xì)胞、已建立的二倍體細(xì)胞系、以及可無(wú)限期傳代的轉(zhuǎn)化細(xì)胞系，以及用這些細(xì)胞進(jìn)行融合和重組的工程細(xì)胞。(1)原代細(xì)胞原代細(xì)胞是直接取自動(dòng)物組織、器官，通過(guò)分碎，消化而獲得的細(xì)胞懸液。用得最多的是雞胚細(xì)胞，原代兔腎或鼠腎細(xì)胞，以及血液的淋巴細(xì)胞。(2)二倍體細(xì)胞系原代細(xì)胞通過(guò)傳代、篩選、克隆，從而從多個(gè)細(xì)胞成分的組織中挑選，并純化出某種含有一定特性的細(xì)胞株。該細(xì)胞株仍含有“正?！奔?xì)胞的特點(diǎn)，普通均從動(dòng)物的胚胎組織中獲取。(3)轉(zhuǎn)化細(xì)胞這類(lèi)細(xì)胞是通過(guò)某個(gè)轉(zhuǎn)化過(guò)程形成的，它經(jīng)常由于染色體的斷裂變成了異倍體，從而失去了“正?！奔?xì)胞的特點(diǎn)，而獲得了無(wú)限增殖的能力。由于轉(zhuǎn)化的細(xì)胞含有無(wú)限生命力，并且經(jīng)常倍增時(shí)間較短，對(duì)培養(yǎng)條件和生長(zhǎng)因子等規(guī)定較低，故更適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的需要。(4)其它：融合細(xì)胞系（物理法如高壓電場(chǎng)和化學(xué)法如仙臺(tái)病毒、聚乙二醇）和重組工程細(xì)胞系2、真核細(xì)胞基因體現(xiàn)載體的構(gòu)建，使用的載體有兩類(lèi)：（1）病毒載體：牛痘病毒、腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、桿狀病毒；（2）質(zhì)粒載體：穿梭質(zhì)粒載體P883、重組DNA導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞的慣用辦法：融正當(dāng)、化學(xué)法、物理法、病毒法，最慣用磷酸鈣沉淀法、電穿孔法P894、生產(chǎn)用的工程細(xì)胞必須建立兩個(gè)細(xì)胞庫(kù)：原始細(xì)胞庫(kù)（MCB）、生產(chǎn)用細(xì)胞庫(kù)（MWCB）或工作細(xì)胞庫(kù)（WCB）P91第四節(jié)動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基1、動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)條件P92(1)器材的清洗和消毒①器材的清洗:浸泡、刷洗、泡酸、沖洗②器材的消毒滅菌:物理消毒/化學(xué)消毒(2)水質(zhì):電阻值不不大于18MΩ,去熱原。(3)pH:7.2～7.4(4)滲入壓:290～300mOsm/kg(5)溫度:哺乳動(dòng)物37±0.5C；(6)空氣:氧的飽和質(zhì)60%,氧分壓4～0.7kPa2、培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)基的種類(lèi)和構(gòu)成P95動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基大致能夠分成三類(lèi)：天然培養(yǎng)基，合成培養(yǎng)基和無(wú)血清培養(yǎng)基。（1）天然培養(yǎng)基：血清、羊水、腹水等,成分復(fù)雜、成分不穩(wěn)定（2）合成培養(yǎng)基：成分明確、大量供應(yīng)，DME、MEM、DMEM等（第一種合成培養(yǎng)基是199培養(yǎng)基；①氨基酸：12種必需氨基酸+谷氨酰胺②維生素：形成輔基和輔酶③糖類(lèi)：能源，用葡萄糖和谷氨酰胺④無(wú)機(jī)鹽：維持滲入壓⑤其它成分：核酸前體和氧化還原劑如谷胱甘肽⑥添加5%～10%小牛血清：作用是提供生長(zhǎng)因子和激素；提供貼附因子和伸展因子；提供結(jié)合蛋白；提供必需脂肪酸和微量元素（3）無(wú)血清培養(yǎng)基：無(wú)血清培基的優(yōu)點(diǎn)以下：①提高了細(xì)胞培養(yǎng)的可重復(fù)性，避免了由于血清批間差別的影響。②減少了由血清帶來(lái)病毒、霉菌和支原體等微生物污染的危險(xiǎn)。③供應(yīng)充足，穩(wěn)定。④細(xì)胞產(chǎn)品易于純化。⑤避免了血清中某些因素對(duì)有些細(xì)胞的毒性。⑥減少了血清中蛋白對(duì)某些生物測(cè)定的干擾，便于對(duì)實(shí)驗(yàn)成果的分析。（簡(jiǎn)答題時(shí)候能夠不寫(xiě)優(yōu)點(diǎn)）無(wú)血清培養(yǎng)基加入添加劑：生長(zhǎng)因子和激素（胰島素）；結(jié)合蛋白（鉄傳遞蛋白和白蛋白）；貼附因子和伸展因子（膠原等）；有利細(xì)胞生長(zhǎng)的因子和元素（谷胱甘肽）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基本辦法1、細(xì)胞傳代；P101原代培養(yǎng)形成的單層細(xì)胞匯合后來(lái)，需要進(jìn)行分離培養(yǎng)，否則細(xì)胞會(huì)因生成空間局限性或由于細(xì)胞密度過(guò)大引發(fā)營(yíng)養(yǎng)枯竭，都將影響細(xì)胞的生長(zhǎng)，這一程序常稱(chēng)為傳代或傳代培養(yǎng)。傳代辦法：（1）懸浮細(xì)胞：加生長(zhǎng)液，然后分種（2）貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞傳代：采用酶消化法傳代。慣用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。第六節(jié)動(dòng)物細(xì)胞大量培養(yǎng)辦法和操作方式1、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的辦法P103（1）懸浮培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)即讓細(xì)胞自由地懸浮于培養(yǎng)基內(nèi)生長(zhǎng)增殖。優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便，培養(yǎng)條件比較均一，傳質(zhì)和傳氧較好，容易擴(kuò)大培養(yǎng)規(guī)模，不僅細(xì)胞體積較小，較難采用灌流培養(yǎng)，因此細(xì)胞密度普通較低。（現(xiàn)在在生產(chǎn)中用于懸浮培養(yǎng)的設(shè)備重要是通氣攪拌罐式生物反映器和氣升式生物反映器。）2．貼壁培養(yǎng)貼壁培養(yǎng)是必須讓細(xì)胞貼附在某種基質(zhì)上，細(xì)胞才干生長(zhǎng)繁殖的培養(yǎng)辦法。較容易采用灌流培養(yǎng)的方式使細(xì)胞達(dá)成高密度。但操作比較麻煩，需要適宜的貼附材料和足夠的面積，培養(yǎng)條件不易均一，傳質(zhì)和傳氧較差。3．貼壁—懸浮培養(yǎng)①微載體培養(yǎng)：可發(fā)明相稱(chēng)大的貼附面積供細(xì)胞貼附生長(zhǎng)增殖，載體的體積很小，比重較輕，在輕度攪拌下即可攜帶細(xì)胞自由地懸浮在培養(yǎng)基內(nèi)。②包埋和微囊培養(yǎng)：包埋和微囊培養(yǎng)培養(yǎng)細(xì)胞不是貼附在載體表面，而是被包埋或包裹在凝膠載體或微囊內(nèi)。包埋或包裹在載體或微囊內(nèi)的細(xì)胞可獲得保護(hù)，避免了剪切力的損害；能夠獲得較高的細(xì)胞密度；可采用多個(gè)生物反映器進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)。（現(xiàn)在最普遍的是瓊脂糖和海藻酸鈣凝膠）③結(jié)團(tuán)培養(yǎng)：結(jié)團(tuán)培養(yǎng)的實(shí)質(zhì)是用細(xì)胞本身作為基質(zhì)，互相貼附后，再用懸浮的辦法進(jìn)行培養(yǎng)，因此它也是一種貼附—懸浮培養(yǎng)。該培養(yǎng)辦法操作簡(jiǎn)便，節(jié)省了微載體的成本。2、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的操作方式；P106動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的操作方式普通可分為分批式、加料—分批或流加式、半持續(xù)式、持續(xù)式和灌流式。（1）分批式操作（一種是將細(xì)胞和培養(yǎng)基一次性加入反映器內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，此后細(xì)胞不停增加，產(chǎn)物不停形成和積累。最后將條件培養(yǎng)基，即經(jīng)培養(yǎng)已含有細(xì)胞產(chǎn)物的培養(yǎng)基，或連同細(xì)胞一并取出，培養(yǎng)結(jié)束。另一種是先將細(xì)胞和培養(yǎng)基加入反映器，待細(xì)胞生長(zhǎng)至一定密度后，往反映器內(nèi)加入誘導(dǎo)劑或病毒等，經(jīng)一段時(shí)間作用后，將反映物取出。）（2）半持續(xù)式操作（該方式是當(dāng)細(xì)胞和培養(yǎng)基一起加入反映器后，在細(xì)胞增加和產(chǎn)物形成過(guò)程中，每間隔一段時(shí)間，取出部分培養(yǎng)物，或單純是條件培養(yǎng)基，或連同細(xì)胞、載體一起，然后補(bǔ)充同樣數(shù)量的新鮮培養(yǎng)基，或另加新鮮載體，繼續(xù)培養(yǎng)。該操作方式在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)和藥品生產(chǎn)中被廣泛采用。）（3）灌流式操作（該方式是當(dāng)細(xì)胞和培養(yǎng)基一起加入反映器后，在細(xì)胞增加和產(chǎn)物形成過(guò)程中，不停地將部分條件培養(yǎng)基取出，同時(shí)不停地補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基。它與持續(xù)式操作不同處，在于取出部分條件培養(yǎng)基時(shí)，絕大部分細(xì)胞仍保存在反映器內(nèi)，而持續(xù)式培養(yǎng)則同時(shí)也取出部分細(xì)胞。）括號(hào)部分的內(nèi)容重在理解第七節(jié)動(dòng)物細(xì)胞生物反映器1、動(dòng)物細(xì)胞生物反映器必需含有的基本規(guī)定；P107（1）一切材料，對(duì)細(xì)胞必須無(wú)毒性。（2）含有良好的傳質(zhì)、傳熱和混合的性能。（3）密封性能良好（4）對(duì)多個(gè)物理化學(xué)參數(shù)能自動(dòng)檢測(cè)、調(diào)節(jié)和高精度控制（5）可長(zhǎng)久持續(xù)運(yùn)轉(zhuǎn)（6）容器內(nèi)面光滑，無(wú)死角（7）拆裝、連接和清潔方便，能耐高壓蒸汽消毒，便于操作維修。設(shè)備成本盡量低。2、動(dòng)物細(xì)胞生物反映器的類(lèi)型及特點(diǎn)；P108（1）攪拌罐式生物反映器（現(xiàn)在最廣泛應(yīng)用的動(dòng)物細(xì)胞反映器）：靠攪拌槳提供液相攪拌的動(dòng)力，它有較大的操作范疇、良好的混合性和濃度均勻性（2）氣升式生物反映器：其特點(diǎn)是構(gòu)造簡(jiǎn)樸，操作方便。（3）固定床式生物反映器：構(gòu)造簡(jiǎn)樸、裝填材料無(wú)毒且利于細(xì)胞貼壁，剪切力小的特點(diǎn)（4）流化床式生物反映器：可持續(xù)操作（5）袋式或膜式生物反映器：可取出某些有害代謝物（6）中空纖維生物反映器：用途較廣，既可培養(yǎng)懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞，又可培養(yǎng)貼壁依賴(lài)性細(xì)胞，細(xì)胞的密度高，如果控制系統(tǒng)不受污染，能長(zhǎng)久運(yùn)轉(zhuǎn)。3、反映器及檢測(cè)；P114（1）溫度檢測(cè)元件：電阻溫度計(jì)；（2）PH：復(fù)合式參比電極（3）溶氧：極普電極或電流式覆膜電極第十節(jié)動(dòng)物細(xì)胞制藥的前景與展望1、動(dòng)物細(xì)胞制藥有哪些新進(jìn)展？P135（1）改善體現(xiàn)載體，提高體現(xiàn)水平和產(chǎn)量：①采用更強(qiáng)的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子②更加好的運(yùn)用擴(kuò)增系統(tǒng)或?qū)ふ腋唧w現(xiàn)位點(diǎn)③采用和改造更加好的宿主細(xì)胞（2）運(yùn)用代謝工程，改善培養(yǎng)工藝，減少生產(chǎn)成本：①采用代謝工程改造工程細(xì)胞②改善培養(yǎng)工藝，減少生產(chǎn)成本（3）克制細(xì)胞凋亡，延長(zhǎng)培養(yǎng)周期（4）采用糖基化工程，提高產(chǎn)品質(zhì)量（5）轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的研究（6）組織工程的研究2、代謝工程：采用基因工程的手段，使工程細(xì)胞增加或減少某種酶，改造它的代謝能力和途徑，使其減少對(duì)某些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需求，減少某些代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生和無(wú)害，以及控制工程細(xì)胞的增殖速度和制造產(chǎn)品的能力。P137第四章抗體制藥第一節(jié)概述P1431、抗體：即Ig，指能與對(duì)應(yīng)抗原特異性結(jié)合含有免疫功效的球蛋白。2、1975年Kohler和Milstein首先運(yùn)用B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)制備出單克隆抗體（McAb）。3、單克隆抗體：將抗體產(chǎn)生細(xì)胞與含有無(wú)限增殖能力的骨髓瘤細(xì)胞相融合，通過(guò)有限稀釋法及克隆化使雜交瘤細(xì)胞成為純一的單克隆細(xì)胞系而產(chǎn)生的特異性完全相似的高純度抗體。單克隆抗體有缺點(diǎn)：分子量過(guò)大；鼠源性抗體；因此要改造：減少單克隆抗體的免疫源性和減少其相對(duì)分子量。P144第二節(jié)單克隆抗體及其制備（重點(diǎn)）1、克隆化：指單個(gè)細(xì)胞通過(guò)無(wú)性繁殖而獲得細(xì)胞集團(tuán)的整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程。P1482、什么是單克隆抗體？它是如何制備的？P144（1）抗原與動(dòng)物免疫①制備高純度抗原：抗原能夠用化學(xué)合成，如精制地高辛。多數(shù)抗原物為混合物須經(jīng)免疫、篩選、克隆化。②用抗原免疫脾細(xì)胞的制備：有體內(nèi)免疫法和體外免疫法。體內(nèi)免疫就是將抗原注射到小鼠腹腔，使小鼠產(chǎn)生免疫反映，B細(xì)胞快速增殖；體外免疫小鼠脾細(xì)胞的懸浮液與抗原一起培養(yǎng)后，再分離脾細(xì)胞。（2）細(xì)胞融合與雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)①骨髓瘤細(xì)胞：和免疫動(dòng)物同源，現(xiàn)在慣用的骨髓瘤細(xì)胞系多來(lái)自BALB/c小鼠（最慣用）和LOU大鼠。②脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合：脾細(xì)胞（1×108）和骨髓瘤細(xì)胞（2×107）混合，在聚乙二醇誘導(dǎo)下融合2分鐘，然后用培養(yǎng)液將融合液緩慢稀釋。（慣用PEG相對(duì)分子量4000，濃度為40-50%，二甲基亞砜增加融合率）③選擇性培養(yǎng):選擇培養(yǎng)基為HAT培養(yǎng)液。次黃嘌呤(H)氨甲喋呤(A)胸腺嘧啶(T)配制。其上脾—瘤融合細(xì)胞能夠生長(zhǎng)，脾—脾、、瘤—瘤融合細(xì)胞死亡。（培養(yǎng)基中需要加入喂養(yǎng)細(xì)胞才干繁殖，慣用喂養(yǎng)細(xì)胞是小鼠腹腔巨噬細(xì)胞、脾細(xì)胞、胸腺細(xì)胞等）（3）篩選陽(yáng)性克隆與克隆化①篩選陽(yáng)性克隆慣用檢測(cè)辦法：免疫酶技術(shù)、免疫熒光技術(shù)、放射免疫技術(shù)等。②克隆化：有限稀釋法（將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)久的雜交瘤細(xì)胞用培養(yǎng)液作一定的稀釋后，按每孔1個(gè)細(xì)胞接種在培養(yǎng)皿中，細(xì)胞增值后成為單克隆細(xì)胞系。）和軟瓊脂法（將雜交瘤細(xì)胞稀釋到一定密度，然后與瓊脂混懸。在瓊脂中的細(xì)胞不能自由移動(dòng)，彼此互不相混，從而達(dá)成單細(xì)胞培養(yǎng)的目的）（4）雜交瘤細(xì)胞與抗體性狀的鑒定雜交瘤細(xì)胞鑒定：染色體分析。另外還檢測(cè)抗體特異性、純度、分子量等。（5）單克隆抗體的大量制備①體外培養(yǎng)法和體內(nèi)誘生法，多采用后者②體內(nèi)誘生法：降脂烷注射小鼠腹腔后再接種雜交瘤細(xì)胞，取腹水，離心，取上清。（6）單克隆抗體的純化依單抗IgG類(lèi)和亞類(lèi)不同，選多個(gè)不同的純化辦法。體內(nèi)誘生法單克隆抗體的純化辦法：①離心取上清，超濾，鹽析。②分離：凝膠過(guò)濾用于IgGIgM單抗純化；陰離子交換層析IgG單抗純化；親和層析IgG單抗純化。3、ELISA法：酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)，基本辦法是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體(聚苯乙烯微量反映板)表面，使酶標(biāo)記的抗原抗體反映在固相表面進(jìn)行，用洗滌法將液相中的游離成分洗除。原理：酶分子與抗體或抗抗體分子共價(jià)結(jié)合，此種結(jié)合不會(huì)變化抗體的免疫學(xué)特性，也不影響酶的生物學(xué)活性。此種酶標(biāo)記抗體可與吸附在固相載體上的抗原或抗體發(fā)生特異性結(jié)合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氫體由無(wú)色的還原型變成有色的氧化型，出現(xiàn)顏色反映。因此，可通過(guò)底物的顏色反映來(lái)鑒定有無(wú)對(duì)應(yīng)的免疫反映，顏色反映的深淺與標(biāo)本中對(duì)應(yīng)抗體或抗原的量呈正比。P147第三節(jié)基因工程抗體及其制備（即鼠源性單克隆抗體的改造）1、基因工程抗體：過(guò)

PCR

技術(shù)獲得抗體基因或抗體基因片段，與適宜載體重組后引入不同體現(xiàn)系統(tǒng)所產(chǎn)生的抗體，被廣泛應(yīng)用于疾病的臨床臨床診療、防止、治療及基礎(chǔ)理論研究等領(lǐng)域。

P1502、Ig分子構(gòu)造P150（1）由2條重鏈(簡(jiǎn)稱(chēng)H鏈)和2條輕鏈（簡(jiǎn)稱(chēng)L鏈）構(gòu)成"Y"字型構(gòu)造分子，鏈與鏈之間由一對(duì)或一對(duì)以上的二硫鍵互相連接（2）Ig分子氨基酸端L鏈的1/2與H鏈的1/4的氨基酸構(gòu)成及次序多變，構(gòu)成可變區(qū)(簡(jiǎn)稱(chēng)V區(qū))，V區(qū)中某些特定位置構(gòu)建抗體和抗原特異結(jié)合的核心部位，稱(chēng)為互補(bǔ)決定區(qū)（CDR）它賦于抗體以特異性。（3）羧基端L鏈的1/2與H鏈的134的氨基酸構(gòu)成及次序較恒定，構(gòu)成恒定區(qū)(簡(jiǎn)稱(chēng)C區(qū))，它決定Ig分子的異種抗原性。（4）L鏈有VL和CL連個(gè)功效區(qū)，H鏈有VH、CH1、CH2、CH3四個(gè)功效區(qū)，VL和VH的CDR區(qū)共同構(gòu)成一種抗原結(jié)合部位。3、基因工程抗體及其特性和制備辦法（P152圖4-4）（1）人鼠嵌合抗體：在基因水平上將鼠源單抗的H和L鏈可變區(qū)（V區(qū)）基因分離出來(lái)，分別與人Ig的H和L鏈的穩(wěn)定區(qū)（C）基因連接成人-鼠嵌合抗體的H和L鏈基因，再共轉(zhuǎn)染骨髓瘤細(xì)胞，就能體現(xiàn)完整人-鼠嵌合抗體。人IgC-小鼠IgV（2）改形抗體（CDR移植抗體）：用鼠源單抗的CDR序列替代人Ig分子中CDR序列，則可使人的Ig分子含有鼠源單抗的抗原結(jié)合特異性。可消除免疫源性。小鼠CDR替代人CDR（3）Fab抗體：重鏈V區(qū)及CH1功效區(qū)與整個(gè)輕鏈以二硫鍵形式連接而成，重要發(fā)揮抗體的抗原結(jié)合功效。Fab抗體只有完整IgG的1/3。（Fd：重鏈V區(qū)及CH1功效區(qū)）完整L鏈+重鏈V區(qū)+CH1功效區(qū)（4）Fv抗體：由VH和VL構(gòu)成的含有完整抗原結(jié)合位點(diǎn)的最小抗體片段；VH+VL（5）單鏈抗體：即scFv，由VH和VL通過(guò)連接肽（接頭）重組并體現(xiàn)而成的一種小分子抗體，其分子量。VH-多肽-VL（6）單域抗體：只有VH或VL一種功效構(gòu)造域，也能保持原單克隆抗體的特異性。其分子量?jī)H為整個(gè)Ig分子的1/12。VH或VL（7）最小識(shí)別單位：即MRU，只含有一種CDR多肽的抗體，也為超變區(qū)多肽。第四節(jié)多功效抗體及其制備1、雙功效抗體：bisFvs，即雙特異性單鏈抗體，（天然Ig是由兩個(gè)完全相似的VH和VL區(qū)域構(gòu)成，該區(qū)域是特異性識(shí)別并結(jié)合抗原的核心部位）經(jīng)人工設(shè)計(jì)構(gòu)建的雙特異性抗體由兩個(gè)不同的抗原結(jié)合位點(diǎn)構(gòu)成，可同時(shí)與兩種不同的抗原決定簇結(jié)合，并可將其偶連的藥品、酶或放射性核素等導(dǎo)向到靶部位，這種含有雙價(jià)雙特異性的抗體又稱(chēng)為雙功效抗體。P1552、多功效抗體：在scFv的基礎(chǔ)上，能夠把兩個(gè)或兩個(gè)以上的scFv重組在一起，由此可制備成多價(jià)小分子抗體即微型抗體（簡(jiǎn)稱(chēng)多價(jià)微抗）。P1573、抗體融合蛋白：抗體的一部分被非抗體序列替代，所形成的融合蛋白含有新的特性，稱(chēng)之為抗體融合蛋白。P158第五節(jié)抗體工程1、抗體工程：指運(yùn)用重組DNA和蛋白質(zhì)工程技術(shù)，對(duì)抗體基因進(jìn)行加工改造和重新裝配，經(jīng)轉(zhuǎn)染適宜的受體細(xì)胞后，體現(xiàn)抗體分子，或用細(xì)胞融合、化學(xué)修飾等辦法改造抗體分子的工程。P159現(xiàn)在普遍使用噬菌體作為抗體庫(kù)技術(shù)的載體。6．噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)基本辦法（過(guò)程）P159噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)：它是將體外克隆的抗體基因片段插入噬菌體載體，轉(zhuǎn)染工程細(xì)菌進(jìn)行體現(xiàn)，然后用抗原篩選即可獲得特異的單克隆噬菌體抗體?；具^(guò)程：噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)基本路線(xiàn)為用RT-PCR辦法擴(kuò)增抗體全套可變區(qū)基因（VH+VL），重組到噬菌體載體中，并通過(guò)與絲狀噬菌體的外殼蛋白形成融合蛋白，把Fab段或ScFv體現(xiàn)到噬菌體表面。通過(guò)“吸附－洗脫－擴(kuò)增”的富集過(guò)程，從中篩選出特異性抗體的可變區(qū)基因。（右圖）第六節(jié)抗體診療試劑一、三大類(lèi)抗體診療藥品：血清學(xué)鑒定用抗體制劑、免疫標(biāo)記技術(shù)用抗體制劑、體內(nèi)導(dǎo)向診療藥品。P161二、抗體診療藥品有哪些類(lèi)型？P1611.血清學(xué)鑒定用的抗體類(lèi)試劑（1）鑒定病原菌用的抗體試劑（2）乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）的反向被動(dòng)血凝診療試劑（3）妊娠診療試劑（4）抗ABO血型系統(tǒng)血清2、免疫標(biāo)記技術(shù)用的抗體類(lèi)試劑P164給抗體標(biāo)記放射性核素、熒光素或酶活性，能將抗原抗體反映放大，使常規(guī)不能觀(guān)察的反映得以顯現(xiàn)，可對(duì)微量抗原進(jìn)行定性定量測(cè)定，敏捷度提高。結(jié)合顯微鏡技術(shù)，還可對(duì)抗原物質(zhì)作出組織內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)的定位測(cè)定。（1）熒光抗體診療試劑：熒光抗體是用熒光色素,如異硫氰酸熒光素（FITC）、羅丹明（RB200）、藻紅素（PE）等標(biāo)記抗體蛋白，即成熒光抗體。用熒光抗體浸染含有抗原物質(zhì)的組織切片或細(xì)胞，熒光抗體就與抗原結(jié)合，在熒光顯微鏡下成為發(fā)光的可視物，從而達(dá)成診療和定位的目的。（2）免疫酶抗體診療試劑：酶標(biāo)診療試劑a、HBsAg(乙型肝炎表面抗原)酶標(biāo)診療試劑b、HBeAg(乙型肝炎e抗原)酶標(biāo)診療試劑c、HAVAg(甲型肝炎病毒抗原)酶標(biāo)診療試劑d、測(cè)定HIV（人免疫缺點(diǎn)病毒）抗原的酶標(biāo)診療試劑e、AFP（甲胎蛋白）酶標(biāo)診療試劑f、CEA（癌胚抗原）酶標(biāo)診療試劑（3）放射免疫用抗體診療試劑把放射性核素分析的高敏捷性與抗原抗體反映的特異性?xún)纱筇攸c(diǎn)結(jié)合起來(lái)建立的檢測(cè)技術(shù)。能測(cè)出ng/ml，甚至pg/ml水平的微量抗原物質(zhì)。慣用的標(biāo)記抗體試劑：a、HBsAg放射性核素標(biāo)記抗體診療試劑：125I標(biāo)記，敏捷度0.1ng/mlb、HBeAg放射性核素標(biāo)記抗體診療試劑：125I標(biāo)記，敏捷度0.1ng/mlc、HAV抗原放射性核素標(biāo)記抗體診療試劑：125I標(biāo)記d、AFP放射性核素標(biāo)記抗體診療試劑：125I標(biāo)記，敏捷度1~5ng/mle、CEA放射性核素標(biāo)記抗體診療試劑：125I標(biāo)記，敏捷度1ng/ml3、導(dǎo)向診療藥品由于腫瘤的特異性小分子抗體尚在研究之中，因此導(dǎo)向藥品尚未愛(ài)臨床廣泛應(yīng)用。三、CD單克隆抗體系列P169應(yīng)用以單克隆抗體鑒定為主的辦法，將來(lái)自不同實(shí)驗(yàn)室的單克隆抗體所識(shí)別的同一種白細(xì)胞分化抗原歸稱(chēng)為CD（clusterofdifferentiation）。人CD的編號(hào)已從CD1命名至CD247，大致分為13組。第七節(jié)抗體治療藥品1、抗體治療藥品有哪些？P173以抗體為載體的導(dǎo)向治療藥品，還不成熟。（1）放射性核素標(biāo)記的抗體治療藥品抗體作為放射性核素的導(dǎo)向載體，標(biāo)記操作簡(jiǎn)便用量小。放射性核素標(biāo)記的抗體對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷較大。（2）抗癌藥品偶聯(lián)的抗體藥品①慣用的抗癌藥品氨甲喋呤（MTX）、阿霉素（ADM）、絲裂霉素（MMC）等。以人血漿白蛋白作為中間載體，可明顯提高每分子抗體所攜帶的MTX量，使體外細(xì)胞毒性體高二倍。②抗體類(lèi)藥品逆轉(zhuǎn)耐藥性（3）毒素偶聯(lián)的抗體藥品在導(dǎo)向藥品中，毒素和抗體的交聯(lián)物稱(chēng)為免疫毒素。①第一代免疫毒素是包含有A、B鏈完整毒素和抗體的交聯(lián)物，其中B鏈非特異性結(jié)合，使其僅在體外應(yīng)用。②第二代免疫毒素是運(yùn)用抗體或抗體片段與毒素的A鏈或與A鏈相似的單鏈核糖體失活蛋白的結(jié)合物。因避免了第一代免疫毒素的非特異性，故能在體內(nèi)有一定的抗腫瘤作用。③第三代免疫毒素重組免疫毒素用基因克隆辦法改造毒素基因和小分子抗體基因重組體現(xiàn)。特異性好、穩(wěn)定性強(qiáng)、滲入性佳、免疫源性低、可大量制備。（3）免疫毒素的臨床應(yīng)用治療腫瘤、本身免疫病，并能克復(fù)組織移植排斥反映，可單獨(dú)給藥也可包裹在脂質(zhì)體及其它微粒中給藥。第五章植物細(xì)胞制藥第一節(jié)基本概念1、植物細(xì)胞的全能性。P177植物體中任何一種含有完整細(xì)胞核（完整染色體組）的細(xì)胞，在一定條件下都能夠重新再分化形成原來(lái)的個(gè)體。第二節(jié)植物細(xì)胞工程發(fā)展簡(jiǎn)史（略）第三節(jié)植物細(xì)胞的形態(tài)及生理特性1、植物細(xì)胞是由細(xì)胞壁、原生質(zhì)體、后含物三大部分構(gòu)成P1812、細(xì)胞壁、質(zhì)體、液泡三部分是植物細(xì)胞特有的構(gòu)造，動(dòng)物細(xì)胞沒(méi)有3、植物培養(yǎng)細(xì)胞重量的增加重要取決于對(duì)數(shù)期，而次級(jí)代謝產(chǎn)物的積累重要在穩(wěn)定時(shí)（植物細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)期：延遲期、加速期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定時(shí)四個(gè)時(shí)期）4、植物培養(yǎng)細(xì)胞的生理特性;P183（1）生長(zhǎng)階段特性延遲期：細(xì)胞數(shù)量不變，核酸及蛋白合成較快加速期：最大生長(zhǎng)久，最大細(xì)胞濃度對(duì)數(shù)期：細(xì)胞數(shù)呈對(duì)數(shù)增加穩(wěn)定時(shí)：細(xì)胞高液泡化，非常脆弱（2）植物細(xì)胞與動(dòng)物細(xì)胞、微生物細(xì)胞比較特性哺乳動(dòng)物細(xì)胞植物細(xì)胞微生物細(xì)胞大?。é蘭）10~10010~1001~10生長(zhǎng)懸浮、貼壁懸浮懸浮營(yíng)養(yǎng)規(guī)定很復(fù)雜較復(fù)雜很簡(jiǎn)樸生長(zhǎng)速度（倍增時(shí)間：h）慢；15~100慢；20~120快；0.5~5細(xì)胞分化有有限分化無(wú)環(huán)境影響非常敏感敏感普通細(xì)胞壁無(wú)有有產(chǎn)物存在部位胞內(nèi)或胞外胞內(nèi)或胞外胞內(nèi)或胞外產(chǎn)物濃度低低高含水量-約90約75供氧需求1~2520~30100~1000產(chǎn)物種類(lèi)疫苗、單抗、酶、生長(zhǎng)因子、激素、免疫調(diào)節(jié)劑酶、天然色素、天然有機(jī)化合物等發(fā)酵食品、抗生素、有機(jī)化合物、酶等第四節(jié)植物細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)1、植物材料的準(zhǔn)備；P185植物組織培養(yǎng)的外植體必須是無(wú)雜菌材料。植物組織培養(yǎng)時(shí)表面解決的慣用滅菌劑是次氯酸鈣、次氯酸鈉、氯化汞。2、植物細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基構(gòu)成P186（1）無(wú)機(jī)鹽：①大量元素：N,S,P,K,Mg,Ca,Cl,Na②微量元素：Fe,Mn,Zn,Cu,Co,Ni等（2）碳源：糖類(lèi)，肌醇等；也可直接通過(guò)光合作用吸取CO2（3）植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)P189①生長(zhǎng)素類(lèi):吲哚乙酸（IAA）、②分裂素：6-芐基腺嘌呤（6-BA）植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)物的生長(zhǎng)重要取決于生長(zhǎng)素和分裂素的比例。高濃度生長(zhǎng)素和低濃度分裂素刺激細(xì)胞分裂，而低濃度生長(zhǎng)素和高濃度分裂素刺激細(xì)胞生長(zhǎng)。（植物激素：指植物代謝過(guò)程中形成的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，在極低濃度（<1M）時(shí)即能調(diào)節(jié)植物的生育過(guò)程，并能從合成部位轉(zhuǎn)運(yùn)到作用部位而發(fā)揮作用。植物激素是現(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)植物組織中能夠形成5種植物激素，即生長(zhǎng)素、分裂素、赤霉素、脫落酸和乙烯。）（4）氮源：蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物或多個(gè)氨基酸。（5）維生素：B族維生素、生物素、肌醇。3、植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的辦法及特點(diǎn)；P191（1）大規(guī)模植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)①成批培養(yǎng)法（分批）：最適于植物細(xì)胞培養(yǎng)的反映器是氣升式反映器將培養(yǎng)基一次性加入反映器中，接種、培養(yǎng)一定時(shí)間后收獲細(xì)胞的操作方式②半持續(xù)培養(yǎng)：在反映器中投料和接種培養(yǎng)一段時(shí)間后，將部分培養(yǎng)液和新鮮培養(yǎng)基進(jìn)行家換。③持續(xù)培養(yǎng)：運(yùn)用持續(xù)培養(yǎng)反映器，在投料和接種培養(yǎng)一段時(shí)間后，以一定速度持續(xù)采集細(xì)胞和培養(yǎng)液，并以同樣速度供應(yīng)新鮮配演技以使細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境維持穩(wěn)定。（2）固定化培養(yǎng)將細(xì)胞固定在固定化反映器上（內(nèi)），放入新鮮培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，或持續(xù)流入新鮮培養(yǎng)基，進(jìn)行持續(xù)培養(yǎng)及收集產(chǎn)物，因?qū)⒓?xì)胞固定，易于獲得高密度細(xì)胞群體及維持細(xì)胞間物理化學(xué)梯度，易于細(xì)胞組織化，易于控制條件和獲得較高含量次級(jí)代謝產(chǎn)物。第五節(jié)影響植物次級(jí)代謝產(chǎn)物激積累的因素1、影響植物次級(jí)代謝產(chǎn)物積累的因素有哪些？P192（1）生物條件：外植體、季節(jié)、休眠、分化等（2）物理?xiàng)l件：溫度、光（強(qiáng)度、時(shí)間、光質(zhì)）、通氣、PH和滲入壓（3）化學(xué)條件：無(wú)機(jī)鹽、碳源、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、維生素、氨基酸、核酸、抗生素、天然物質(zhì)、前體等（4）工業(yè)培養(yǎng)條件：培養(yǎng)罐類(lèi)型、通氣、攪拌、培養(yǎng)辦法等2、重要影響因素P193（一）外植體選擇：不同外植體的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物，其最大次級(jí)代謝產(chǎn)物的累積時(shí)間各異。（二）培養(yǎng)條件的影響（1）內(nèi)在因素①接種和誘導(dǎo)：次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)率與外肢體的大小、細(xì)胞密度與營(yíng)養(yǎng)成分有關(guān)②培養(yǎng)基的基本構(gòu)成：培養(yǎng)基的多個(gè)成分是愈傷組織和懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的物質(zhì)基礎(chǔ)，特別是穩(wěn)定時(shí)的次級(jí)代謝產(chǎn)物的積累。（磷、氮；銅是次級(jí)代謝產(chǎn)物積累的必要元素）③碳源：糖是使用最廣、作用最強(qiáng)的碳源，對(duì)次級(jí)代謝產(chǎn)物影響重要取決于使用的糖種類(lèi)、糖濃度及另首先級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成過(guò)程。④植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑：不同植物激素及其不同組合形式均可明顯影響次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生。⑤O2和PH：植物細(xì)胞正常呼吸需要氧氣，因此需要供氧；普通最利于培養(yǎng)植物細(xì)胞的PH在5~6⑥滲出物：其它代謝產(chǎn)物也會(huì)影響產(chǎn)物產(chǎn)量（2）外在因素①溫度:代謝產(chǎn)物產(chǎn)生最佳溫度是20~28℃；②攪拌頻率：適宜③培養(yǎng)容器④光：光照時(shí)間、光質(zhì)、強(qiáng)度都有影響（三）兩步法培養(yǎng)：第一步使用適合細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基（生長(zhǎng)培養(yǎng)基），第二步使用適合次級(jí)代謝產(chǎn)物合成的培養(yǎng)基（生產(chǎn)培養(yǎng)基）。P197第六節(jié)植物細(xì)胞培養(yǎng)的生物反映器1、植物細(xì)胞反映器的選擇取決于：生產(chǎn)細(xì)胞的密度、通氣量、提供的營(yíng)養(yǎng)成分的分散程度。P1992、植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的生物反映器P201（1）機(jī)械攪拌式生物反映器：反映器內(nèi)溫度、PH、溶氧及營(yíng)養(yǎng)物物濃度易控制。（2）鼓泡塔生物反映器：沒(méi)有運(yùn)動(dòng)部件，操作不易染菌，有較高的熱量和質(zhì)量傳遞，容易放大，但是流動(dòng)形式難以擬定，混合不均。（3）氣升式生物反映器：低剪切力，混合與氧傳遞效果好，運(yùn)動(dòng)部件不易染菌，操作費(fèi)用低，但是高密度培養(yǎng)時(shí)候混合不夠均勻。（4）轉(zhuǎn)鼓式生物反映器：比較適合高密度培養(yǎng)，但是難于大規(guī)模操作，放大困難。（5）固定化細(xì)胞生物反映器：細(xì)胞可長(zhǎng)時(shí)間重復(fù)使用，保護(hù)細(xì)胞免受剪切力，以實(shí)現(xiàn)高密度培養(yǎng)，有助于次級(jí)代謝產(chǎn)物合成，易于持續(xù)化操作。第七節(jié)進(jìn)展與展望1、植物細(xì)胞培養(yǎng)有哪些新進(jìn)展？P204（1）誘導(dǎo)子在植物細(xì)胞工程中的應(yīng)用：運(yùn)用誘導(dǎo)子進(jìn)行有目的次級(jí)代謝產(chǎn)物調(diào)控及生物合成。（誘導(dǎo)子：植物抗毒素是在植物防御系統(tǒng)內(nèi)能對(duì)抗微生物攻打的某些次級(jí)代謝產(chǎn)物，觸發(fā)形成植物抗毒素信號(hào)的物質(zhì)稱(chēng)為誘導(dǎo)子。誘導(dǎo)子有兩種分類(lèi)，一種是根據(jù)在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外形成而將其分為內(nèi)源性誘導(dǎo)子和外源性誘導(dǎo)子；另一種是根據(jù)其來(lái)源分為生物誘導(dǎo)子和非生物誘導(dǎo)子。）（2）前提飼喂（3）兩相法培養(yǎng)：水相培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，加入固相或疏水相，形成兩相培養(yǎng)系統(tǒng)，從而達(dá)成收集分泌物的目的。（4）轉(zhuǎn)基因技術(shù)（5）植物生物轉(zhuǎn)化技術(shù)與生物制藥：生物轉(zhuǎn)化既能夠生產(chǎn)新的化合物，又能夠改造已有化合物、增加目的產(chǎn)物產(chǎn)量。（生物轉(zhuǎn)化：運(yùn)用離體培養(yǎng)細(xì)胞或器官及細(xì)胞器等對(duì)外源化合物進(jìn)行構(gòu)造修飾而獲得有價(jià)值產(chǎn)物的生理生化反映）第六章酶工程制藥第一節(jié)概述1、酶工程：從應(yīng)用的目的出發(fā)研究酶、應(yīng)用酶的特異催化性能，并通過(guò)工程化將對(duì)應(yīng)原料轉(zhuǎn)化成有用物質(zhì)的技術(shù)。P2162、酶工程重要研究?jī)?nèi)容是什么？P216（1）酶的分離、提純、大批量生產(chǎn)及新酶的應(yīng)用開(kāi)發(fā)。（2）酶和細(xì)胞的固定化及酶反映器的研究。（3）酶生產(chǎn)中基因工程的應(yīng)用及遺傳修飾酶的研究。（4）酶的分子改造與化學(xué)修飾、以及酶的構(gòu)造與功效之間關(guān)系的研究（5）有機(jī)相中酶反映的研究。（6）酶的克制劑、激活劑的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用研究。（7）抗體酶、核酸酶的研究。（8）模擬酶、合成酶及酶分子的人工設(shè)計(jì)、合成的研究。3、現(xiàn)在工業(yè)上應(yīng)用的酶大多采用微生物發(fā)酵法來(lái)生產(chǎn)。P2174、應(yīng)用最廣泛的產(chǎn)酶菌：大腸桿菌、枯草桿菌、啤酒酵母、曲霉（黑曲霉和黃曲霉）。P2185、酶法檢測(cè)可分為：?jiǎn)蚊阜从?、多酶偶?lián)反映、酶標(biāo)免疫反映。P218第二節(jié)酶和細(xì)胞固定化1、固定化酶的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)各是什么？P219（1）固定化酶：限制或固定于特定空間位置的酶。（2）固定化酶的特點(diǎn)：既含有生物催化劑的功效，又含有固相催化劑特性。（3）優(yōu)點(diǎn)：①可多次使用；②反映后，酶底物產(chǎn)物易分開(kāi)，產(chǎn)物中無(wú)殘留酶，易純化，產(chǎn)品質(zhì)量高；③反映條件易控制；④酶的運(yùn)用效率高；⑤比水溶性酶更適合于多酶反映。缺點(diǎn)：①酶活力有損失②成本增加③只適應(yīng)可溶性第五，且小分子底物④胞內(nèi)酶需分離純化⑤與完整菌相比不適宜多酶反映。2、固定化細(xì)胞的特點(diǎn)和優(yōu)缺點(diǎn)各是什么？P225（1）固定化細(xì)胞：將細(xì)胞限制或定位于特定空間位置的辦法。（2）特點(diǎn)：有細(xì)胞特性，現(xiàn)有生物催化劑功效，又有固相催化劑特點(diǎn)。（3）優(yōu)點(diǎn)：①不必進(jìn)行酶的分離純化②保持酶的原始狀態(tài)，酶回收率高；③比固定化酶穩(wěn)定性高；④細(xì)胞內(nèi)酶附助因子可再生；⑤細(xì)胞本身含多酶體系；⑥抗污染能力強(qiáng)缺點(diǎn)：①副產(chǎn)物多②細(xì)胞的壁、膜和載體都存在擴(kuò)散限制作用③載體的空隙大小影響高分子底物的通透性3、酶和細(xì)胞的固定化辦法P220（1）載體結(jié)正當(dāng)：將酶結(jié)合于不溶性載體上的固定化辦法①物理吸附法：用物理辦法將酶吸附于不溶性載體（如活性炭等）上的固定化辦法。②離子結(jié)正當(dāng)：酶通過(guò)離子鍵結(jié)合于含有離子交換基的水不溶性載體上。③共價(jià)結(jié)正當(dāng)：酶以共價(jià)鍵結(jié)合于載體上。即將酶分子上非活性部位功效團(tuán)與載體表面反映基團(tuán)進(jìn)行共價(jià)結(jié)合的辦法。（2）交聯(lián)法：用雙功效或多功效試劑使酶與酶或細(xì)胞與細(xì)胞之間交聯(lián)的辦法。交聯(lián)法又分：交聯(lián)酶法、酶與輔助蛋白交聯(lián)法、吸附交聯(lián)法和載體交聯(lián)法。慣用的交聯(lián)劑：戊二醛、雙重氮聯(lián)苯胺-2、2-二磺酸、1,5-二氟-2,4-二硝基苯。（3）包埋法：①網(wǎng)格型：將酶或細(xì)胞包埋在高分子凝膠細(xì)微網(wǎng)格中。慣用合成高分子化合物有聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、光敏樹(shù)脂。天然高分子化合物有淀粉、明膠、膠原、海藻膠、角叉菜膠。多用于固定化細(xì)胞。②微囊型：將酶或細(xì)胞包埋在高分子半透膜中。普通為直徑幾微米到幾百微米的球狀體。（4）無(wú)載體法（選擇性熱變性法）：在適宜溫度下解決使細(xì)胞膜蛋白變性，但酶不變性使酶固定于細(xì)胞內(nèi)。此法只合用于細(xì)胞固定化。4、固定化酶的性質(zhì)（變化）P228（1）酶活力的變化：酶通過(guò)固定化之后活力大都下降。（2）酶穩(wěn)定性的變化：涉及對(duì)溫度、pH、蛋白酶變性劑和克制劑的耐受程度。固定化后，穩(wěn)定性提高，有效壽命延長(zhǎng)。其因素是限制了酶分子之間的互相作用，制止了其自溶，增加了酶構(gòu)型的牢固程度。（3）酶學(xué)特性的變化①底物專(zhuān)一性：對(duì)底物的專(zhuān)一性下降。②最適pH：最適pH可能變大，也可能變??；③最適溫度：普通升高。因素是固定化后空間構(gòu)造更為穩(wěn)定。④米氏常數(shù)(Km)：Km值均發(fā)生變化，有的增加很小，有的增加很大，但不會(huì)變小。⑤最大反映速度（Vm）：變化很小或不變。6、固定化酶活力測(cè)定辦法：分批測(cè)定法和持續(xù)測(cè)定法。P231第三節(jié)固定化酶和固定化細(xì)胞的反映器1、反映器的類(lèi)型和特點(diǎn)P232（1）間歇式攪拌罐反映器：用于游離酶反映后隨即放料。（2）持續(xù)流動(dòng)攪拌罐反映器：持續(xù)進(jìn)料、持續(xù)出料（3）填充床反映器：固定化酶填充于床層內(nèi)。反映器內(nèi)的流體的流動(dòng)形態(tài)為平推流形。底物以恒定流速通過(guò)反映床。（4）流化床反映器：底物以足夠大的流速向上通過(guò)固定化酶床層，使固體顆粒處在流化狀態(tài)，達(dá)成混合的目的。（5）循環(huán)反映器：部分反映液流出和新加入底物流入液混合，在進(jìn)入反映床進(jìn)行循環(huán)。（6）持續(xù)流動(dòng)攪拌罐-超濾膜反映器（7）其它反映器第四節(jié)酶的人工模擬1、人工模擬酶：根據(jù)酶的作用原理，用多個(gè)辦法人為制造的都有酶性質(zhì)的催化劑。它們普通含有高效和高適應(yīng)性的特點(diǎn)，在構(gòu)造上相對(duì)天然酶簡(jiǎn)樸。P2352、主-客體化學(xué)和超分子化學(xué)是酶人工模擬的重要理論基礎(chǔ)。P2363、模擬酶的分類(lèi)P236（1）根據(jù)Kirby分類(lèi)法：?jiǎn)渭兠改Ｐ?、機(jī)理酶模型、單純合成的酶樣化合物（2）主-客體酶模型：主-客體酶（環(huán)糊精CD）、膠束酶模型、肽酶、、分子印跡酶模型、半合成酶4、何謂分子印跡？分子印跡的應(yīng)用范疇有哪些？P238分子印跡：指制備對(duì)某一特定分子含有選擇性的聚合物的過(guò)程，該特定分子稱(chēng)為印跡分子或模板。分子印跡的應(yīng)用范疇有：①分子印跡聚合物可作為裁剪分離物質(zhì)的材料，如手性藥品的分離，也能夠分離大分子物質(zhì)。②在酶技術(shù)和有機(jī)合成中，分子印跡聚合物可作為模擬抗體，模擬酶或含有催化活性的聚合物。③分子印跡聚合物還可在生物傳感器的構(gòu)建中作為傳感器，這種聚合物可作為普通使用的生物材料的替代物。第五節(jié)酶的化學(xué)修飾1、為什么要對(duì)酶進(jìn)行化學(xué)修飾?P242酶作為生物催化劑，其高效性和專(zhuān)一性是其它催化劑所無(wú)法比擬的。但是，酶是蛋白質(zhì)，存在其異體蛋白的抗原性、受蛋白酶水解和克制劑作用、在體內(nèi)半衰期短等缺點(diǎn)，嚴(yán)重影響使用效果。工業(yè)用酶經(jīng)常由于酶蛋白抗酸、堿、有機(jī)溶劑變性及抗熱失活能力差，容易受產(chǎn)物和克制劑的克制，工業(yè)反映規(guī)定的pH和溫度不總在酶反映的最適pH和最適溫度范疇內(nèi)，底物不溶于水或酶的Km值過(guò)高等弱點(diǎn)，限制了酶制劑的應(yīng)用范疇。酶的化學(xué)修飾就是對(duì)酶在分子水平上用化學(xué)辦法進(jìn)行改造，從而提高酶的穩(wěn)定性、解除酶的抗原性、變化酶學(xué)性質(zhì)、擴(kuò)大酶的應(yīng)用范疇。2、酶化學(xué)修飾：通過(guò)化學(xué)辦法對(duì)酶分子的主鏈進(jìn)行切割、剪接和側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾改造，以變化其理化性質(zhì)和生物活性。P2423、化學(xué)修飾的目的：人為地變化天然酶的某些性質(zhì)，發(fā)明天然酶所不含有的某些優(yōu)良特性甚至發(fā)明出新活性，來(lái)擴(kuò)大酶的應(yīng)用領(lǐng)域，增進(jìn)生物技術(shù)的發(fā)展。①提高生物活性②增強(qiáng)在不良環(huán)境（非生理?xiàng)l件）中的穩(wěn)定性③針對(duì)異體反映，減少生物識(shí)別能力。4、酶化學(xué)修飾的辦法P243（1）酶的表面化學(xué)修飾①大分子修飾：可溶性大分子，如PEG、葡聚糖等通過(guò)共價(jià)鍵連接（其中分子量500-0的PEG使用最廣）；②小分子修飾：小分子對(duì)其活性部位或側(cè)鏈基團(tuán)修飾，如氨基葡萄糖等；③交聯(lián)修飾：雙功效試劑如戊二醛等將酶分子之間、亞基之間或分子內(nèi)不同肽鏈部位進(jìn)行共價(jià)交聯(lián)；④固定化修飾：酶共價(jià)連接惰性載體（2）酶分子內(nèi)部修飾①非催化活性基團(tuán)修飾：變化酶對(duì)特殊底物的束縛能力；②蛋白主鏈修飾；③催化活性基團(tuán)修飾；④與輔助因子有關(guān)的修飾⑤肽鏈延伸后修飾（3）結(jié)合定點(diǎn)突變的化學(xué)修飾：得到新的酶制劑5、修飾酶的特性；P244⑴熱穩(wěn)定性提高；⑵抗各類(lèi)失活因子能力提高；⑶抗原性消除；⑷體內(nèi)半衰期延長(zhǎng)；⑸最適變化；⑹酶學(xué)性質(zhì)變化：Km會(huì)增大，專(zhuān)一性變化等；⑺對(duì)組織分布能力變化第六節(jié)酶工程研究的進(jìn)展（有機(jī)相酶反映、核酶和脫氧核酶、抗體酶）1、有機(jī)相酶反映的定義及其優(yōu)點(diǎn)是什么？P247（1）有機(jī)相酶反映是指酶在含有有機(jī)溶劑存在的介質(zhì)中所進(jìn)行的催化反映。（2）有機(jī)相酶反映的優(yōu)點(diǎn)：①增加疏水性底物或產(chǎn)物的溶解度；②熱力學(xué)平衡向合成方向移動(dòng)，如酯合成、肽合成等；③可克制有水參加的副反映；④酶不溶于有機(jī)介質(zhì)，易于回收再運(yùn)用；⑤容易從低沸點(diǎn)的溶劑中分離純化產(chǎn)物；⑥酶的熱穩(wěn)定性提高，pH的適應(yīng)性擴(kuò)大；⑦無(wú)微生物污染；⑧能測(cè)定某些在水介質(zhì)中不能測(cè)定的常數(shù)；⑨固定化酶辦法簡(jiǎn)樸，能夠只沉淀在載體表面。2、有機(jī)相酶反映的溶劑體系各是什么？如何選擇溶劑體系和有機(jī)溶劑的種類(lèi)？P248按照溶劑體系的構(gòu)成和特點(diǎn)，現(xiàn)在有機(jī)相酶反映重要有4種溶劑體系。（1）水—水溶性溶劑均相體系：由水和水溶性有機(jī)溶劑互相溶解而形成的均一體系。（2）水—水不溶性溶劑兩相體系：有機(jī)溶劑在水中的溶解度盡量小。在該體系中，規(guī)定底物在水和有機(jī)溶劑中的溶解度盡量大，而產(chǎn)物在水中的溶解度要小。（3）反相膠團(tuán)體系：由兩性化合物在占優(yōu)勢(shì)的有機(jī)相中形成的一系列包圍水滴的體系。（4）單相有機(jī)溶劑體系：在該體系中，不存在單獨(dú)的水相，只含極微量的水，即在酶分子周邊存在著一層水分子膜，以維持催化反映所必需的構(gòu)象。選擇溶劑體系和有機(jī)溶劑的種類(lèi)要根據(jù)酶的性質(zhì)、底物和產(chǎn)物的溶解度及反映器的型式等具體狀況而定。3、核酶：（1）剪切性核酶：錘頭型核酶、發(fā)夾型、丁型肝炎病毒（HDV）核酶、蛋白質(zhì)-RNA復(fù)合酶（RNaseP）（2）剪接型核酶：Ⅰ內(nèi)含子、Ⅱ內(nèi)含子；P2504、抗體酶：一種新型人工酶制劑，是一種含有催化功效的抗體分子，在其可變區(qū)賦予了酶的屬性。它是運(yùn)用當(dāng)代生物學(xué)與化學(xué)的理論與技術(shù)交叉研究的成果，是抗體的高度選擇性和酶的高效催化能力巧妙結(jié)合的產(chǎn)物。P252第七章發(fā)酵工程制藥第一節(jié)概述1、發(fā)酵工程：微生物工程，運(yùn)用微生物制造工業(yè)原料與工業(yè)產(chǎn)品并提供服務(wù)的技術(shù)。P2592、發(fā)酵工程發(fā)展4個(gè)階段：發(fā)酵工程發(fā)展4個(gè)階段：（1）20世紀(jì)前，傳統(tǒng)發(fā)酵（酒、醋等）（2）1900-1940，揭示發(fā)酵本質(zhì)-微生物引發(fā)，誕生許多新的發(fā)酵產(chǎn)品（甘油、丙酮等），純培養(yǎng)技術(shù)；（3）發(fā)酵大發(fā)展，青霉素工業(yè)推動(dòng)發(fā)酵，深層培養(yǎng)技術(shù)；重要標(biāo)志有：抗生素、氨基酸、核酸、甾體的微生物轉(zhuǎn)化（4）基因工程應(yīng)用于發(fā)酵；P2