生物技術制藥復習題

生物技術制藥復習題第一章緒論第一節(jié)生物技術的發(fā)展史1、生物技術：以生命科學為基礎，運用生物體的特性和功效，設計構建含有與其性狀的新物種或新品系，并與工程結合，運用這樣的新物種進行加工生產(chǎn)，為社會提供商品服務的一種綜合性技術體系。它的范疇：基因工程、細胞工程、酶工程、發(fā)酵工程、生化工程。基因工程是生物技術的核心。P12、蛋白質(zhì)工程第二代基因工程；海洋生物技術第三代生物技術P13、生物技術發(fā)展史：傳統(tǒng)、近代（抗生素、發(fā)酵罐）、當代（DNA重組）P31974年，Boyer和Cohen建立了DNA重組技術1975年，Koher和Milstein建立了單克隆抗體技術1982年，第一種基因工程藥品重組人胰島素被同意上市1989年，我國第一種基因工程藥品干擾素同意上市，中國的重組腺病毒-p53注射液成為石階上第一種正式同意的基因治療藥品。第二節(jié)生物技術藥品1、生物技術制藥：生物技術制藥：采用當代生物技術人為地發(fā)明某些條件，借助某些微生物、植物或動物來生產(chǎn)所需的醫(yī)藥品。P42、生物技術藥品：采用DNA重組技術活其它生物技術研制的蛋白質(zhì)或核酸類藥品。它與天然生化藥品、微生物藥品、海洋藥品和生物制品共同歸為生物藥品。3、當代生物藥品分為4類：重組DNA技術制造的基因重組多肽、蛋白質(zhì)類治療劑；基因藥品；天然藥品；合成與部分合成藥品。4、生物藥品按用途分為：治療藥品；防止藥品；診療藥品。5、生物技術藥品的特性：（1）分子構造復雜；（2）含有種屬特異性；（3）治療針對性強、療效高；（4）穩(wěn)定性差（5）基因穩(wěn)定性；（6）免疫原性；（7）體內(nèi)半衰期短；（8）受體效應；（9）多效性和網(wǎng)絡性效應；（10）檢查的特殊性。第三節(jié)生物技術制藥1、生物技術制藥的特性：高技術、高投入、長周期、高風險、高收益。P52、生物技術在制藥中的應用有哪些？P7（1）基因工程制藥：①開發(fā)基因工程藥品，如干擾素（IFN）、紅細胞生成素（EPO）等②基因工程疫苗，如乙肝基因工程疫苗③基因工程抗體，它能夠作為導向藥品的載體④基因診療與基因治療⑤應用基因工程技術建立新藥的篩選模型⑥應用極影工程激活素改良菌種，產(chǎn)生新的微生物藥品⑦改善藥品生產(chǎn)工藝⑧運用轉(zhuǎn)基因動、植物生產(chǎn)蛋白質(zhì)類藥品。（2）細胞工程制藥①單克隆抗體技術②動物細胞培養(yǎng)③植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)次級代謝產(chǎn)物。（3）酶工程制藥：酶與細胞的固定化及酶轉(zhuǎn)化制藥（4）發(fā)酵工程制藥：發(fā)酵工藝改善、新藥研制、菌種改造。第二章基因工程制藥第一節(jié)概述（略）第二節(jié)基因工程藥品的生產(chǎn)過程P151、基因工程技術：將重組對象的目的基因插入載體，拼接后轉(zhuǎn)入新的宿主細胞，構建成工程菌(或細胞），實現(xiàn)遺傳物質(zhì)的重新組合，并使目的基因在工程菌內(nèi)進行復制和體現(xiàn)的技術。2、基因工程藥品制造的重要程序（過程）（重點和背面幾節(jié)聯(lián)系起來）（1）目的基因的克?。ǚ蛛x目的基因）：通過逆轉(zhuǎn)錄、反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反映、化學合成辦法來制備cDNA，再通過核酸探針雜交或免疫反映來篩選目的基因（2）目的基因與載體連接構建DNA重組體：通過限制性內(nèi)切酶DNA連接酶等核酸酶，把目的基因組入載體的有關克隆位點，慣用的載體有質(zhì)粒載體和噬菌體載體（3）將DNA重組體轉(zhuǎn)入宿主菌構建工程菌：慣用的宿主菌有大腸桿菌、酵母菌等，先使宿主菌處在感受態(tài)，再通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導等方式把重組DNA導入宿主菌，以構建工程菌（4）工程菌發(fā)酵：提供適宜的培養(yǎng)基、反映器、控制好發(fā)酵過程中的多個參數(shù)，如溫度、PH、溶氧等，并通過升溫來誘導產(chǎn)物體現(xiàn)（5）目的基因體現(xiàn)產(chǎn)物的分離純化：通過固液分離、初步純化、高度純化、成品加工來制備產(chǎn)品；若是胞內(nèi)產(chǎn)物需要細胞破碎，若是包涵體則需要變性和復性（6）產(chǎn)品的檢查：檢測產(chǎn)品的質(zhì)量和性能。第三節(jié)目的基因的獲得1、運用基因工程生產(chǎn)蛋白質(zhì)或多肽需要得到其基因，制備目的基因慣用的辦法有哪些？P16（1）逆轉(zhuǎn)錄法以mRNA為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄的到cDNA，構建cDNA文庫，從cDNA文庫中篩選目的基因。由于RNA轉(zhuǎn)錄加工過程中，內(nèi)含子序列已被剪切掉，因此，cDNA文庫中無內(nèi)含子，適于在原核系統(tǒng)中體現(xiàn)。但是，cDNA只包含蛋白質(zhì)的構造基因部分，缺少有關的調(diào)控序列，因此在原核系統(tǒng)中體現(xiàn)，還需要根據(jù)體現(xiàn)載體的構造，配以對應的調(diào)控序列。（2）運用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反映制備基因（3）化學合成法：只合用于克隆小分子肽的基因2、運用逆轉(zhuǎn)錄法獲得目的基因的基本過程P16（1）mRNA的純化：從體現(xiàn)目的基因的細胞中提取總RNA，用寡聚脫氧胸苷（dT）纖維素柱從總RNA中提取純化mRNA。（2）cDNA的合成：以mRNA為模板，運用逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第一鏈，再用DNA聚合酶合成cDNA的雙鏈。（3）cDNA克隆：運用適宜的連接辦法，將產(chǎn)生的雙鏈cDNA片段插入到適宜的載體中。（4）構建cDNA文庫：將cDNA與載體連接的重組體轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，產(chǎn)生的克隆群體為cDNA文庫。（5）從cDNA文庫中篩選目的基因：得到cDNA文庫后，普通采用核酸探針雜交法和免疫反映鑒定法從數(shù)以萬計的DNA片段中篩選出目的基因。3、載體分為：體現(xiàn)型載體和非體現(xiàn)型載體。P17第四節(jié)基因體現(xiàn)1、基因體現(xiàn)：指構造基因在生物體中的轉(zhuǎn)錄、翻譯以及全部加工過程。P202、基因高效體現(xiàn)研究：指外源基因在某種細胞中的體現(xiàn)活動，即剪切下外源基因片段，拼接到另一種基因體現(xiàn)體系中，使其能獲得原生物活性又可高產(chǎn)的體現(xiàn)產(chǎn)物。P203、基因體現(xiàn)的微生物宿主細胞分為兩大類：P21第一類為原核細胞（慣用的有大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鏈霉菌等）；⑴大腸桿菌（現(xiàn)在仍是基因工程研究中采用最多的原核體現(xiàn)體系）：體現(xiàn)基因產(chǎn)物形式多樣，大腸桿菌中的體現(xiàn)不存在信號肽，產(chǎn)品多為胞內(nèi)產(chǎn)物，提取困難。因分泌能力局限性，真核蛋白質(zhì)常形成不溶性的包含體，體現(xiàn)產(chǎn)物需經(jīng)變性復性才恢復活性。蛋白質(zhì)不能糖基化。產(chǎn)物蛋白質(zhì)N端多出一種蛋氨酸殘基。其內(nèi)毒素很難除去。⑵枯草芽胞桿菌：分泌能力強，蛋白質(zhì)不形成包含體。產(chǎn)物蛋白質(zhì)不能糖基化。有很強的胞外蛋白酶對產(chǎn)物降解。⑶鏈霉菌：作為外源性基因體現(xiàn)受到重視。不致病、使用安全、分泌能力強、體現(xiàn)產(chǎn)物可糖基化。第二類為真核細胞（慣用的真核微生物有酵母、絲狀真菌等）⑴酵母：酵母菌是研究基因體現(xiàn)最有效的單細胞真核微生物。其基因組小，世代時間短，有單倍體雙倍體兩種形式，繁殖快速，無毒性。能外分泌，產(chǎn)物可糖基化。已有不少真核基因成功體現(xiàn)⑵絲狀真菌：分泌能力強，能對的進行翻譯后加工（肽剪切糖基化）有成熟的發(fā)酵和后解決工藝。4、現(xiàn)在使用最廣泛的宿主菌是大腸桿菌和釀酒酵母。P225、大腸桿菌基因體現(xiàn)載體P23（1）pBV220系統(tǒng)pBV220系統(tǒng)國內(nèi)使用最多的載體,其構成：①來源于pUC8多克隆位點；②核糖體rrnB基因終止信號；③pBR322第4225～3735位；④pUC18第2066～680位；⑤λ噬菌體cIts857克制子基因及PR啟動子；⑥pRC23的PL啟動子及SD序列（2）pET系統(tǒng)6、影響目的基因在大腸桿菌中體現(xiàn)的因素P22外源基因體現(xiàn)產(chǎn)量與細胞濃度和細胞體現(xiàn)產(chǎn)量呈正有關。單個細胞產(chǎn)量取決于：（1）外源基因的劑量：普通來說細菌內(nèi)基因拷貝數(shù)增加，基因的體現(xiàn)產(chǎn)物也增加。（2）外源基因的體現(xiàn)效率①啟動子的強弱：啟動子是在轉(zhuǎn)錄水平上影響基因體現(xiàn)的因素。需要尋找強的啟動子。②核糖體結合位點的有效性：大腸桿菌核糖體結合位點對真核基因在細菌中的高效體現(xiàn)是十分重要的。③SD序列和起始密碼ATG的間距：體現(xiàn)非融合蛋白的核心是原核SD序列和真核起始密碼ATG之間的距離，距離過長過短都影響真核基因的體現(xiàn)。④密碼子構成：應選擇使用大腸桿菌偏愛的密碼子。（3）體現(xiàn)產(chǎn)物的穩(wěn)定性：（4）細胞的代謝負荷：必須使宿主細胞的代謝負荷不至過重，又能高效體現(xiàn)出外源基因產(chǎn)物。（5）工程菌的培養(yǎng)條件外源基因的高水平體現(xiàn)，不僅涉及宿主、載體和克隆基因三者之間的互有關系，并且與其所處的環(huán)境條件息息有關，必須進行優(yōu)化。7、真核基因在大腸桿菌中的體現(xiàn)形式P26⑴以融合蛋白的形式體現(xiàn)藥品基因以原核多肽和真核蛋白結合在一起稱融合蛋白。優(yōu)點：操作簡便，體現(xiàn)蛋白在菌體內(nèi)穩(wěn)定，易實現(xiàn)高效體現(xiàn)；缺點：只能作抗原用。⑵以非融合蛋白的形式體現(xiàn)藥品基因非融合蛋白指在大腸桿菌中體現(xiàn)的蛋白質(zhì)以真核蛋白的mRNA的AUG為起始，在其氨基端不含細菌多肽序列。優(yōu)點：保持原有蛋白活性；缺點：易被蛋白酶破壞。⑶分泌型體現(xiàn)藥品基因（外源基因融合到編碼原核蛋白信號肽序列的下游）優(yōu)點：在周質(zhì)中穩(wěn)定，有活性，不含蛋氨酸殘基；缺點：產(chǎn)量不高，信號肽不被切割。8、載體有關定義載體：在基因工程重組DNA技術中將DNA片段(目的基因)轉(zhuǎn)移至受體細胞的一種能自我復制的DNA分子?？寺≥d體：從病毒、質(zhì)?；蚋叩壬锛毎蝎@取的DNA作為載體，在其上插入適宜大小的外源DNA片段，將重組后的載體引入到宿主細胞中，并在宿主細胞中大量繁殖。體現(xiàn)載體：在克隆載體基本骨架的基礎上增加體現(xiàn)元件(如啟動子、RBS、終止子等)，是目的基因能夠體現(xiàn)的載體。穿梭載體：指含有兩個親緣關系不同的復制子，能在兩種不同的生物中復制的載體（例如既能在原核生物中復制,又能在真核生物中復制的載體）。9、載體的復制系列可分四類：P27（1）Yep類（酵母附加體質(zhì)粒）（2）YRp類（酵母復制型質(zhì)粒）（3）YCp類（酵母著絲粒質(zhì)粒）（4）YIp類（酵母整合型質(zhì)粒）10、影響目的基因在酵母菌中體現(xiàn)的因素⑴外源基因的拷貝數(shù)⑵外源基因的體現(xiàn)效率：①啟動子②分泌信號的效率③終止序列的影響⑶外源蛋白的糖基化⑷宿主菌株的影響：①菌體生長力強②菌體內(nèi)源蛋白酶要較弱③菌體性能穩(wěn)定④分泌能力強11、精確體現(xiàn)載體P28酵母載體有兩類：普通體現(xiàn)載體和精確體現(xiàn)載體。精確體現(xiàn)載體：規(guī)定在啟動子或前導肽編碼序列的適宜部位有內(nèi)切酶位點，以利于接入外源基因，并使它在體現(xiàn)和加工后氮末端氨基酸序列與天然產(chǎn)物相似，既無多出的氨基酸，也無缺失的氨基酸的克隆載體。第五節(jié)基因工程菌生長代謝的特點1、碳源物質(zhì)為細胞提供能量，當菌體生長所需能量不不大于菌體有氧代謝提供的能量時，菌體會產(chǎn)生乙酸，造成培養(yǎng)基的pH值下降，從而影響菌體的生長。適宜提高pH，可減少乙酸的克制作用；P31第六節(jié)基因工程菌的不穩(wěn)定性1、質(zhì)粒不穩(wěn)定分為那兩類？P32工程菌在傳代過程中經(jīng)常出現(xiàn)質(zhì)粒不穩(wěn)定的現(xiàn)象，質(zhì)粒不穩(wěn)定分為分裂不穩(wěn)定和構造不穩(wěn)定。質(zhì)粒的分裂不穩(wěn)定是指工程菌在分裂時出現(xiàn)一定比例的不含質(zhì)粒的子代菌的現(xiàn)象。與含質(zhì)粒菌產(chǎn)生不含質(zhì)粒子代菌的頻率；這兩種菌比數(shù)率差別的大小有關質(zhì)粒的構造不穩(wěn)定是指外源基因從質(zhì)粒上丟失或堿基重排、缺失所致工程菌性能的變化。基2、提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的辦法P33（1）選擇適宜的宿主菌：遺傳穩(wěn)定（2）選擇適宜的載體：高拷貝數(shù)；（3）選擇壓力：如加抗生素提高穩(wěn)定性；（4）分階段控制培養(yǎng)：先使菌體生長至一定密度；再誘導外源基因的體現(xiàn)（5）控制培養(yǎng)條件（6）固定化第八節(jié)重組工程菌的培養(yǎng)1、基因工程菌的培養(yǎng)方式P36（1）分批培養(yǎng)（2）補料分批培養(yǎng)：將種子接入發(fā)酵反映器中進行培養(yǎng),通過一段時間后間歇或持續(xù)地補加新鮮培養(yǎng)基，使菌體進一步生長的辦法。（3）持續(xù)培養(yǎng)（4）透析培養(yǎng)（5）固定化培養(yǎng)2、基因工程菌的培養(yǎng)工藝P37（1）培養(yǎng)基的影響（2）接種量的影響（3）溫度的影響（4）溶氧量的影響（5）誘導時機的影響（6）誘導體現(xiàn)程序的影響：普通在對數(shù)生長久或?qū)?shù)生長后期升溫誘導體現(xiàn)。（7）pH的影響：生長pH在6.8～7.4左右，后期外源蛋白的體現(xiàn)其最佳pH為6.0～6.5。第九節(jié)高密度發(fā)酵（1）高密度發(fā)酵：一種相對概念，普通指培養(yǎng)基中工程菌的菌體濃度在50gDCW/L以上，理論上的最高值可達200gDCW/L。（2）影響高密度發(fā)酵的因素：培養(yǎng)基；溶氧濃度；pH；溫度；代謝副產(chǎn)物（3）實現(xiàn)高密度發(fā)酵的辦法①發(fā)酵條件的改善a.培養(yǎng)基的選擇（普遍采用6g/L的甘油為碳源）；b.建立流加式培養(yǎng)的方式；c.提高供氧能力②構建出產(chǎn)乙酸能力低的工程化宿主菌a.阻斷乙酸產(chǎn)生的重要途徑；b.對碳代謝流進行分流；c.限制進入糖酵解途徑的碳代謝流；d.引入血紅蛋白基因③構建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌第十節(jié)基因工程藥品的分離純化1、體現(xiàn)的產(chǎn)物都是多肽或蛋白質(zhì)，它的制得含有下列特點：（1）體現(xiàn)產(chǎn)物在初始料中含量較低；（2）含有大量細胞及代謝產(chǎn)物；（3）體現(xiàn)產(chǎn)物穩(wěn)定性差，易失活變性；（4）體現(xiàn)產(chǎn)物的種類繁多、構造不一、活性各異；（5）對其質(zhì)量規(guī)定純度高、無菌、無熱原。2、分離純化的基本過程若是敘述題最佳對過程進行一定的介紹3、建立分離純化工藝的根據(jù)（1）含目的產(chǎn)物的起始料的特點基因工程菌的發(fā)酵產(chǎn)物其上游過程的多個因素對分離、純化工藝有影響。涉及：①菌種的類型及其代謝特性。②原材料培養(yǎng)基的來源及其質(zhì)量。③生產(chǎn)工藝及條件。（2）物料中雜質(zhì)的種類和性質(zhì)。（3）目的產(chǎn)物特性。（4）產(chǎn)品質(zhì)量的規(guī)定4、細胞破碎與固液分離⑴細胞收集：離心法、膜分離法。⑵細胞破碎：機械破碎法、非機械破碎法；物理法、化學法、生物法⑶固液分離：離心、膜過濾、雙水相萃取5、細胞破碎的辦法；P47（1）物理辦法：勻漿法、珠磨法、超聲波法（2）化學法：滲入沖擊法（高滲+低滲）、增溶法（表面活性劑等）（3）生物法：酶溶法6、分離純化慣用的色譜分離辦法有那些？P50分離純化重要依賴色譜分離辦法。色譜技術是醫(yī)藥生物技術下游過程精制階段的慣用手段，其優(yōu)點是該法含有多個多樣的分離機制、設備簡樸、便于自動化控制和分離過程中無發(fā)熱等有害效應。色譜技術分為離子交換色譜、疏水色譜、反相色譜、親和色譜、凝膠過濾色譜、高壓液相色譜等。（1）離子交換層析P51離子交換介質(zhì)由三部分構成：（1）不溶性高分子聚合物—載體；（2）共價鍵結合于載體上活性基團或功效集團（3）與活性基團帶相反電荷平衡離子或反離子（決定是陰離子交換樹脂還是陽離子交換樹脂）如：酸性陽離子交換樹脂R-SO3H蛋白質(zhì)的等電點和表面電荷的分布重要影響離子交換的性能。它由平衡、上樣、洗脫（分為梯度洗脫和階段洗脫2種）、再生4個重要環(huán)節(jié)構成。（2）疏水層析P54運用蛋白質(zhì)分子表面上的疏水區(qū)域和介質(zhì)中的疏水基團之間的互相作用，無機鹽的存在能使互相作用力增強。流動相為pH6～8鹽水溶液。慣用的介質(zhì)是多聚糖（如瓊脂糖）和硅膠。（3）親和層析P4756親和層析是運用固定化配基與目的蛋白質(zhì)之間特異的生物親和力進行吸附，如抗體與抗原、受體與激素、酶與底物之間的作用。洗脫時分為特異性洗脫和非特異性洗脫。（4）凝膠過濾層析P59凝膠過濾是以含有大小一定的多孔性凝膠作為分離介質(zhì)，小分子能進入孔內(nèi)，在柱中緩慢移動，而大分子不能進入孔內(nèi)，快速移動，大分子量物質(zhì)先流出，小分子物質(zhì)后流出。運用這種移動差別可使大分子與小分子分開。7、用于分離純化的技術應滿足那些規(guī)定？P62(1)技術條件溫和，能保持目的產(chǎn)物的生物活性。(2)選擇性好，能從復雜的混合物中有效地將目的產(chǎn)物分離出來，達成較高純化倍數(shù)。(3)收率要高。(4)兩個技術之間不需要對物料加以解決或調(diào)節(jié)，這樣能夠減少工藝環(huán)節(jié)。(5)整個分離純化過程要快速，能夠滿足高生產(chǎn)率的規(guī)定。第十一節(jié)變性蛋白的復性1、外源基因在大腸桿菌中的高體現(xiàn)經(jīng)常造成包涵體的形成P632、包涵體：指細菌體現(xiàn)的蛋白在細胞內(nèi)凝集，形成無活性的固體顆粒。3、包涵體的分離和溶解P63（1）包涵體的分離：重組菌破碎后，離心得沉淀部分，再用低濃度變性劑（脲或鹽酸胍）、去垢劑（TritonX-100）、脫氧膽酸鈉洗滌。（2）包涵體溶解：般用強的變性劑如脲（6-8M）、鹽酸胍（6M），或用去垢劑，如SDS、正十六烷基三甲基銨氯化物等，溶解涵體蛋白質(zhì)。（3）包涵體復性：稀釋復性和透析復性；含二硫鍵的蛋白的復性；封閉蛋白的疏水蔟增進復性；凝膠過濾層析復性；小分子添加劑增進的復性；分子伴侶或折疊酶增進的復性；人工分子伴侶的復性第十二節(jié)基因工程藥品的質(zhì)量控制1、由基因重組技術所獲得的蛋白質(zhì)藥品產(chǎn)品進行鑒定時，常作那些項目分析？P68（1）肽圖分析肽圖分析是用酶法或化學法降解目的蛋白質(zhì)后，對生成的肽段進行的分離分析。它是一種可檢測蛋白質(zhì)一級構造中細微變化的最有效辦法，該技術敏捷高效的特點使其成為對基因工程藥品的分子構造和遺傳穩(wěn)定性進行評價和驗證的首選辦法。（2）氨基酸成分分析在氨基酸成分分析中，普通含50個左右的氨基酸殘基的蛋白質(zhì)的定量分析是靠近理論值的，即與序列分析成果一致。（3）部分氨基酸序列分析部分氨基酸序列分析（N端15個氨基酸）可作為重組蛋白質(zhì)和多肽的重要鑒定指標。（4）重組蛋白質(zhì)的濃度測定和分子量測定蛋白質(zhì)濃度測定辦法重要有凱氏定氮法、雙縮脲法、染料結合比色法、福林-酚法和紫外法等。蛋白質(zhì)分子量測定最慣用的辦法有凝膠過濾法和SDS法，凝膠過濾法是測定完整的蛋白質(zhì)分子量，而SDS法測定的是蛋白質(zhì)亞基的分子量。（5）蛋白質(zhì)二硫鍵分析二硫鍵和巰基與蛋白質(zhì)的生物活性親密有關，基因工程藥品產(chǎn)品的硫-硫鍵與否對的配對是一種重要問題。第三章動物細胞制藥第一節(jié)概述細胞工程：是指以細胞為對象，應用生命科學理論，借助工程學原理與技術，有目的地運用第二節(jié)動物細胞的形態(tài)和生理特點（重點）1、離體培養(yǎng)的動物細胞分為那些類型？P81動物細胞適應功效,形態(tài)各異。離體培養(yǎng)細胞分兩類：貼壁細胞；懸浮細胞（1）貼壁細胞生長須有貼附的支持物表面，本身分泌或培養(yǎng)基中提供的貼附因子才干在該表面上生長。兩種形態(tài)：成纖維細胞型和上皮細胞型（2）懸浮細胞：生長不依賴支持物表面，在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)生長。如淋巴細胞。（3）兼性貼壁細胞：生長不嚴格依賴支持物。如中國地鼠卵巢細胞，小鼠L929細胞。2、什么是接觸克制現(xiàn)象？P84當細胞在基質(zhì)上分裂增殖，逐步匯合成片時，即每個細胞與其周邊的細胞互相接觸時，細胞就停止增殖。此時若能保持充足的營養(yǎng)，細胞仍可存活相稱一段時間，但細胞密度不再增加，因此該現(xiàn)象又稱之謂接觸克制或密度依賴克制現(xiàn)象。一旦細胞轉(zhuǎn)化為異倍體后，該現(xiàn)象隨之消失，細胞可多層生長。細胞密度也就可大大增加。3、動物細胞的生理特點P83（1）細胞的分裂周期長動物細胞分裂所需的時間普通為12～48h，它不僅隨細胞種屬的不同而不同，就是同一種屬的，不同部位的細胞其所需的時間也不同。周期=間期+分裂期間期（G1+S+G2）分裂期（M）（2）細胞生長需貼附于基質(zhì)，并有接觸克制現(xiàn)象(3)正常二倍體細胞的生長壽命是有限的(4)動物細胞對周邊環(huán)境十分敏感。動物細胞對多個物理化學因素，如滲入壓，pH，離子濃度，剪切力，微量元素等的變化耐受力很弱。(5)動物細胞對培養(yǎng)基的規(guī)定高氨基酸、維生素，多個無機鹽和微量元素，細胞生長因子、貼壁因子。(6)動物細胞對蛋白質(zhì)的合成途徑和修飾功效與細菌不同動物細胞的蛋白質(zhì)合成除了在游離的核糖體上進行外，還在與糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上結合的核糖體上進行。（游離核糖體合成蛋白質(zhì)用于細胞質(zhì)基質(zhì)內(nèi)。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的核糖體合成蛋白質(zhì)是分泌的和膜中的整合蛋白多為糖蛋白。）3、動物細胞作為宿主細胞生產(chǎn)藥品的特點；P85（1）優(yōu)點：產(chǎn)品多分泌在胞外，收集純化方便，得到較完善的翻譯后修飾，特別是糖基化，因此與天然產(chǎn)品更一致，適于臨床（2）缺點：培養(yǎng)條件規(guī)定高，成本貴，產(chǎn)量低第三節(jié)生產(chǎn)用動物細胞的規(guī)定和獲得1、生產(chǎn)用動物細胞的種類及其特點P86用于生產(chǎn)的動物細胞有三類，即原代細胞、已建立的二倍體細胞系、以及可無限期傳代的轉(zhuǎn)化細胞系，以及用這些細胞進行融合和重組的工程細胞。(1)原代細胞原代細胞是直接取自動物組織、器官，通過分碎，消化而獲得的細胞懸液。用得最多的是雞胚細胞，原代兔腎或鼠腎細胞，以及血液的淋巴細胞。(2)二倍體細胞系原代細胞通過傳代、篩選、克隆，從而從多個細胞成分的組織中挑選，并純化出某種含有一定特性的細胞株。該細胞株仍含有“正?！奔毎奶攸c，普通均從動物的胚胎組織中獲取。(3)轉(zhuǎn)化細胞這類細胞是通過某個轉(zhuǎn)化過程形成的，它經(jīng)常由于染色體的斷裂變成了異倍體，從而失去了“正常”細胞的特點，而獲得了無限增殖的能力。由于轉(zhuǎn)化的細胞含有無限生命力，并且經(jīng)常倍增時間較短，對培養(yǎng)條件和生長因子等規(guī)定較低，故更適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的需要。(4)其它：融合細胞系（物理法如高壓電場和化學法如仙臺病毒、聚乙二醇）和重組工程細胞系2、真核細胞基因體現(xiàn)載體的構建，使用的載體有兩類：（1）病毒載體：牛痘病毒、腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、桿狀病毒；（2）質(zhì)粒載體：穿梭質(zhì)粒載體P883、重組DNA導入動物細胞的慣用辦法：融正當、化學法、物理法、病毒法，最慣用磷酸鈣沉淀法、電穿孔法P894、生產(chǎn)用的工程細胞必須建立兩個細胞庫：原始細胞庫（MCB）、生產(chǎn)用細胞庫（MWCB）或工作細胞庫（WCB）P91第四節(jié)動物細胞的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基1、動物細胞的培養(yǎng)條件P92(1)器材的清洗和消毒①器材的清洗:浸泡、刷洗、泡酸、沖洗②器材的消毒滅菌:物理消毒/化學消毒(2)水質(zhì):電阻值不不大于18MΩ,去熱原。(3)pH:7.2～7.4(4)滲入壓:290～300mOsm/kg(5)溫度:哺乳動物37±0.5C；(6)空氣:氧的飽和質(zhì)60%,氧分壓4～0.7kPa2、培養(yǎng)動物細胞的培養(yǎng)基的種類和構成P95動物細胞培養(yǎng)基大致能夠分成三類：天然培養(yǎng)基，合成培養(yǎng)基和無血清培養(yǎng)基。（1）天然培養(yǎng)基：血清、羊水、腹水等,成分復雜、成分不穩(wěn)定（2）合成培養(yǎng)基：成分明確、大量供應，DME、MEM、DMEM等（第一種合成培養(yǎng)基是199培養(yǎng)基；①氨基酸：12種必需氨基酸+谷氨酰胺②維生素：形成輔基和輔酶③糖類：能源，用葡萄糖和谷氨酰胺④無機鹽：維持滲入壓⑤其它成分：核酸前體和氧化還原劑如谷胱甘肽⑥添加5%～10%小牛血清：作用是提供生長因子和激素；提供貼附因子和伸展因子；提供結合蛋白；提供必需脂肪酸和微量元素（3）無血清培養(yǎng)基：無血清培基的優(yōu)點以下：①提高了細胞培養(yǎng)的可重復性，避免了由于血清批間差別的影響。②減少了由血清帶來病毒、霉菌和支原體等微生物污染的危險。③供應充足，穩(wěn)定。④細胞產(chǎn)品易于純化。⑤避免了血清中某些因素對有些細胞的毒性。⑥減少了血清中蛋白對某些生物測定的干擾，便于對實驗成果的分析。（簡答題時候能夠不寫優(yōu)點）無血清培養(yǎng)基加入添加劑：生長因子和激素（胰島素）；結合蛋白（鉄傳遞蛋白和白蛋白）；貼附因子和伸展因子（膠原等）；有利細胞生長的因子和元素（谷胱甘肽）動物細胞培養(yǎng)的基本辦法1、細胞傳代；P101原代培養(yǎng)形成的單層細胞匯合后來，需要進行分離培養(yǎng)，否則細胞會因生成空間局限性或由于細胞密度過大引發(fā)營養(yǎng)枯竭，都將影響細胞的生長，這一程序常稱為傳代或傳代培養(yǎng)。傳代辦法：（1）懸浮細胞：加生長液，然后分種（2）貼壁生長細胞傳代：采用酶消化法傳代。慣用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。第六節(jié)動物細胞大量培養(yǎng)辦法和操作方式1、動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)的辦法P103（1）懸浮培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)即讓細胞自由地懸浮于培養(yǎng)基內(nèi)生長增殖。優(yōu)點是操作簡便，培養(yǎng)條件比較均一，傳質(zhì)和傳氧較好，容易擴大培養(yǎng)規(guī)模，不僅細胞體積較小，較難采用灌流培養(yǎng)，因此細胞密度普通較低。（現(xiàn)在在生產(chǎn)中用于懸浮培養(yǎng)的設備重要是通氣攪拌罐式生物反映器和氣升式生物反映器。）2．貼壁培養(yǎng)貼壁培養(yǎng)是必須讓細胞貼附在某種基質(zhì)上，細胞才干生長繁殖的培養(yǎng)辦法。較容易采用灌流培養(yǎng)的方式使細胞達成高密度。但操作比較麻煩，需要適宜的貼附材料和足夠的面積，培養(yǎng)條件不易均一，傳質(zhì)和傳氧較差。3．貼壁—懸浮培養(yǎng)①微載體培養(yǎng)：可發(fā)明相稱大的貼附面積供細胞貼附生長增殖，載體的體積很小，比重較輕，在輕度攪拌下即可攜帶細胞自由地懸浮在培養(yǎng)基內(nèi)。②包埋和微囊培養(yǎng)：包埋和微囊培養(yǎng)培養(yǎng)細胞不是貼附在載體表面，而是被包埋或包裹在凝膠載體或微囊內(nèi)。包埋或包裹在載體或微囊內(nèi)的細胞可獲得保護，避免了剪切力的損害；能夠獲得較高的細胞密度；可采用多個生物反映器進行大規(guī)模培養(yǎng)。（現(xiàn)在最普遍的是瓊脂糖和海藻酸鈣凝膠）③結團培養(yǎng)：結團培養(yǎng)的實質(zhì)是用細胞本身作為基質(zhì)，互相貼附后，再用懸浮的辦法進行培養(yǎng)，因此它也是一種貼附—懸浮培養(yǎng)。該培養(yǎng)辦法操作簡便，節(jié)省了微載體的成本。2、動物細胞培養(yǎng)的操作方式；P106動物細胞培養(yǎng)的操作方式普通可分為分批式、加料—分批或流加式、半持續(xù)式、持續(xù)式和灌流式。（1）分批式操作（一種是將細胞和培養(yǎng)基一次性加入反映器內(nèi)進行培養(yǎng)，此后細胞不停增加，產(chǎn)物不停形成和積累。最后將條件培養(yǎng)基，即經(jīng)培養(yǎng)已含有細胞產(chǎn)物的培養(yǎng)基，或連同細胞一并取出，培養(yǎng)結束。另一種是先將細胞和培養(yǎng)基加入反映器，待細胞生長至一定密度后，往反映器內(nèi)加入誘導劑或病毒等，經(jīng)一段時間作用后，將反映物取出。）（2）半持續(xù)式操作（該方式是當細胞和培養(yǎng)基一起加入反映器后，在細胞增加和產(chǎn)物形成過程中，每間隔一段時間，取出部分培養(yǎng)物，或單純是條件培養(yǎng)基，或連同細胞、載體一起，然后補充同樣數(shù)量的新鮮培養(yǎng)基，或另加新鮮載體，繼續(xù)培養(yǎng)。該操作方式在動物細胞培養(yǎng)和藥品生產(chǎn)中被廣泛采用。）（3）灌流式操作（該方式是當細胞和培養(yǎng)基一起加入反映器后，在細胞增加和產(chǎn)物形成過程中，不停地將部分條件培養(yǎng)基取出，同時不停地補充新鮮培養(yǎng)基。它與持續(xù)式操作不同處，在于取出部分條件培養(yǎng)基時，絕大部分細胞仍保存在反映器內(nèi)，而持續(xù)式培養(yǎng)則同時也取出部分細胞。）括號部分的內(nèi)容重在理解第七節(jié)動物細胞生物反映器1、動物細胞生物反映器必需含有的基本規(guī)定；P107（1）一切材料，對細胞必須無毒性。（2）含有良好的傳質(zhì)、傳熱和混合的性能。（3）密封性能良好（4）對多個物理化學參數(shù)能自動檢測、調(diào)節(jié)和高精度控制（5）可長久持續(xù)運轉(zhuǎn)（6）容器內(nèi)面光滑，無死角（7）拆裝、連接和清潔方便，能耐高壓蒸汽消毒，便于操作維修。設備成本盡量低。2、動物細胞生物反映器的類型及特點；P108（1）攪拌罐式生物反映器（現(xiàn)在最廣泛應用的動物細胞反映器）：靠攪拌槳提供液相攪拌的動力，它有較大的操作范疇、良好的混合性和濃度均勻性（2）氣升式生物反映器：其特點是構造簡樸，操作方便。（3）固定床式生物反映器：構造簡樸、裝填材料無毒且利于細胞貼壁，剪切力小的特點（4）流化床式生物反映器：可持續(xù)操作（5）袋式或膜式生物反映器：可取出某些有害代謝物（6）中空纖維生物反映器：用途較廣，既可培養(yǎng)懸浮生長的細胞，又可培養(yǎng)貼壁依賴性細胞，細胞的密度高，如果控制系統(tǒng)不受污染，能長久運轉(zhuǎn)。3、反映器及檢測；P114（1）溫度檢測元件：電阻溫度計；（2）PH：復合式參比電極（3）溶氧：極普電極或電流式覆膜電極第十節(jié)動物細胞制藥的前景與展望1、動物細胞制藥有哪些新進展？P135（1）改善體現(xiàn)載體，提高體現(xiàn)水平和產(chǎn)量：①采用更強的啟動子和增強子②更加好的運用擴增系統(tǒng)或?qū)ふ腋唧w現(xiàn)位點③采用和改造更加好的宿主細胞（2）運用代謝工程，改善培養(yǎng)工藝，減少生產(chǎn)成本：①采用代謝工程改造工程細胞②改善培養(yǎng)工藝，減少生產(chǎn)成本（3）克制細胞凋亡，延長培養(yǎng)周期（4）采用糖基化工程，提高產(chǎn)品質(zhì)量（5）轉(zhuǎn)基因動物的研究（6）組織工程的研究2、代謝工程：采用基因工程的手段，使工程細胞增加或減少某種酶，改造它的代謝能力和途徑，使其減少對某些營養(yǎng)物質(zhì)的需求，減少某些代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生和無害，以及控制工程細胞的增殖速度和制造產(chǎn)品的能力。P137第四章抗體制藥第一節(jié)概述P1431、抗體：即Ig，指能與對應抗原特異性結合含有免疫功效的球蛋白。2、1975年Kohler和Milstein首先運用B淋巴細胞雜交瘤技術制備出單克隆抗體（McAb）。3、單克隆抗體：將抗體產(chǎn)生細胞與含有無限增殖能力的骨髓瘤細胞相融合，通過有限稀釋法及克隆化使雜交瘤細胞成為純一的單克隆細胞系而產(chǎn)生的特異性完全相似的高純度抗體。單克隆抗體有缺點：分子量過大；鼠源性抗體；因此要改造：減少單克隆抗體的免疫源性和減少其相對分子量。P144第二節(jié)單克隆抗體及其制備（重點）1、克隆化：指單個細胞通過無性繁殖而獲得細胞集團的整個培養(yǎng)過程。P1482、什么是單克隆抗體？它是如何制備的？P144（1）抗原與動物免疫①制備高純度抗原：抗原能夠用化學合成，如精制地高辛。多數(shù)抗原物為混合物須經(jīng)免疫、篩選、克隆化。②用抗原免疫脾細胞的制備：有體內(nèi)免疫法和體外免疫法。體內(nèi)免疫就是將抗原注射到小鼠腹腔，使小鼠產(chǎn)生免疫反映，B細胞快速增殖；體外免疫小鼠脾細胞的懸浮液與抗原一起培養(yǎng)后，再分離脾細胞。（2）細胞融合與雜交瘤細胞的選擇性培養(yǎng)①骨髓瘤細胞：和免疫動物同源，現(xiàn)在慣用的骨髓瘤細胞系多來自BALB/c小鼠（最慣用）和LOU大鼠。②脾細胞和骨髓瘤細胞融合：脾細胞（1×108）和骨髓瘤細胞（2×107）混合，在聚乙二醇誘導下融合2分鐘，然后用培養(yǎng)液將融合液緩慢稀釋。（慣用PEG相對分子量4000，濃度為40-50%，二甲基亞砜增加融合率）③選擇性培養(yǎng):選擇培養(yǎng)基為HAT培養(yǎng)液。次黃嘌呤(H)氨甲喋呤(A)胸腺嘧啶(T)配制。其上脾—瘤融合細胞能夠生長，脾—脾、、瘤—瘤融合細胞死亡。（培養(yǎng)基中需要加入喂養(yǎng)細胞才干繁殖，慣用喂養(yǎng)細胞是小鼠腹腔巨噬細胞、脾細胞、胸腺細胞等）（3）篩選陽性克隆與克隆化①篩選陽性克隆慣用檢測辦法：免疫酶技術、免疫熒光技術、放射免疫技術等。②克隆化：有限稀釋法（將對數(shù)生長久的雜交瘤細胞用培養(yǎng)液作一定的稀釋后，按每孔1個細胞接種在培養(yǎng)皿中，細胞增值后成為單克隆細胞系。）和軟瓊脂法（將雜交瘤細胞稀釋到一定密度，然后與瓊脂混懸。在瓊脂中的細胞不能自由移動，彼此互不相混，從而達成單細胞培養(yǎng)的目的）（4）雜交瘤細胞與抗體性狀的鑒定雜交瘤細胞鑒定：染色體分析。另外還檢測抗體特異性、純度、分子量等。（5）單克隆抗體的大量制備①體外培養(yǎng)法和體內(nèi)誘生法，多采用后者②體內(nèi)誘生法：降脂烷注射小鼠腹腔后再接種雜交瘤細胞，取腹水，離心，取上清。（6）單克隆抗體的純化依單抗IgG類和亞類不同，選多個不同的純化辦法。體內(nèi)誘生法單克隆抗體的純化辦法：①離心取上清，超濾，鹽析。②分離：凝膠過濾用于IgGIgM單抗純化；陰離子交換層析IgG單抗純化；親和層析IgG單抗純化。3、ELISA法：酶聯(lián)免疫吸附實驗，基本辦法是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體(聚苯乙烯微量反映板)表面，使酶標記的抗原抗體反映在固相表面進行，用洗滌法將液相中的游離成分洗除。原理：酶分子與抗體或抗抗體分子共價結合，此種結合不會變化抗體的免疫學特性，也不影響酶的生物學活性。此種酶標記抗體可與吸附在固相載體上的抗原或抗體發(fā)生特異性結合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氫體由無色的還原型變成有色的氧化型，出現(xiàn)顏色反映。因此，可通過底物的顏色反映來鑒定有無對應的免疫反映，顏色反映的深淺與標本中對應抗體或抗原的量呈正比。P147第三節(jié)基因工程抗體及其制備（即鼠源性單克隆抗體的改造）1、基因工程抗體：過

PCR

技術獲得抗體基因或抗體基因片段，與適宜載體重組后引入不同體現(xiàn)系統(tǒng)所產(chǎn)生的抗體，被廣泛應用于疾病的臨床臨床診療、防止、治療及基礎理論研究等領域。

P1502、Ig分子構造P150（1）由2條重鏈(簡稱H鏈)和2條輕鏈（簡稱L鏈）構成"Y"字型構造分子，鏈與鏈之間由一對或一對以上的二硫鍵互相連接（2）Ig分子氨基酸端L鏈的1/2與H鏈的1/4的氨基酸構成及次序多變，構成可變區(qū)(簡稱V區(qū))，V區(qū)中某些特定位置構建抗體和抗原特異結合的核心部位，稱為互補決定區(qū)（CDR）它賦于抗體以特異性。（3）羧基端L鏈的1/2與H鏈的134的氨基酸構成及次序較恒定，構成恒定區(qū)(簡稱C區(qū))，它決定Ig分子的異種抗原性。（4）L鏈有VL和CL連個功效區(qū)，H鏈有VH、CH1、CH2、CH3四個功效區(qū)，VL和VH的CDR區(qū)共同構成一種抗原結合部位。3、基因工程抗體及其特性和制備辦法（P152圖4-4）（1）人鼠嵌合抗體：在基因水平上將鼠源單抗的H和L鏈可變區(qū)（V區(qū)）基因分離出來，分別與人Ig的H和L鏈的穩(wěn)定區(qū)（C）基因連接成人-鼠嵌合抗體的H和L鏈基因，再共轉(zhuǎn)染骨髓瘤細胞，就能體現(xiàn)完整人-鼠嵌合抗體。人IgC-小鼠IgV（2）改形抗體（CDR移植抗體）：用鼠源單抗的CDR序列替代人Ig分子中CDR序列，則可使人的Ig分子含有鼠源單抗的抗原結合特異性?？上庖咴葱?。小鼠CDR替代人CDR（3）Fab抗體：重鏈V區(qū)及CH1功效區(qū)與整個輕鏈以二硫鍵形式連接而成，重要發(fā)揮抗體的抗原結合功效。Fab抗體只有完整IgG的1/3。（Fd：重鏈V區(qū)及CH1功效區(qū)）完整L鏈+重鏈V區(qū)+CH1功效區(qū)（4）Fv抗體：由VH和VL構成的含有完整抗原結合位點的最小抗體片段；VH+VL（5）單鏈抗體：即scFv，由VH和VL通過連接肽（接頭）重組并體現(xiàn)而成的一種小分子抗體，其分子量。VH-多肽-VL（6）單域抗體：只有VH或VL一種功效構造域，也能保持原單克隆抗體的特異性。其分子量僅為整個Ig分子的1/12。VH或VL（7）最小識別單位：即MRU，只含有一種CDR多肽的抗體，也為超變區(qū)多肽。第四節(jié)多功效抗體及其制備1、雙功效抗體：bisFvs，即雙特異性單鏈抗體，（天然Ig是由兩個完全相似的VH和VL區(qū)域構成，該區(qū)域是特異性識別并結合抗原的核心部位）經(jīng)人工設計構建的雙特異性抗體由兩個不同的抗原結合位點構成，可同時與兩種不同的抗原決定簇結合，并可將其偶連的藥品、酶或放射性核素等導向到靶部位，這種含有雙價雙特異性的抗體又稱為雙功效抗體。P1552、多功效抗體：在scFv的基礎上，能夠把兩個或兩個以上的scFv重組在一起，由此可制備成多價小分子抗體即微型抗體（簡稱多價微抗）。P1573、抗體融合蛋白：抗體的一部分被非抗體序列替代，所形成的融合蛋白含有新的特性，稱之為抗體融合蛋白。P158第五節(jié)抗體工程1、抗體工程：指運用重組DNA和蛋白質(zhì)工程技術，對抗體基因進行加工改造和重新裝配，經(jīng)轉(zhuǎn)染適宜的受體細胞后，體現(xiàn)抗體分子，或用細胞融合、化學修飾等辦法改造抗體分子的工程。P159現(xiàn)在普遍使用噬菌體作為抗體庫技術的載體。6．噬菌體抗體庫技術基本辦法（過程）P159噬菌體抗體庫技術：它是將體外克隆的抗體基因片段插入噬菌體載體，轉(zhuǎn)染工程細菌進行體現(xiàn)，然后用抗原篩選即可獲得特異的單克隆噬菌體抗體?；具^程：噬菌體抗體庫技術基本路線為用RT-PCR辦法擴增抗體全套可變區(qū)基因（VH+VL），重組到噬菌體載體中，并通過與絲狀噬菌體的外殼蛋白形成融合蛋白，把Fab段或ScFv體現(xiàn)到噬菌體表面。通過“吸附－洗脫－擴增”的富集過程，從中篩選出特異性抗體的可變區(qū)基因。（右圖）第六節(jié)抗體診療試劑一、三大類抗體診療藥品：血清學鑒定用抗體制劑、免疫標記技術用抗體制劑、體內(nèi)導向診療藥品。P161二、抗體診療藥品有哪些類型？P1611.血清學鑒定用的抗體類試劑（1）鑒定病原菌用的抗體試劑（2）乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）的反向被動血凝診療試劑（3）妊娠診療試劑（4）抗ABO血型系統(tǒng)血清2、免疫標記技術用的抗體類試劑P164給抗體標記放射性核素、熒光素或酶活性，能將抗原抗體反映放大，使常規(guī)不能觀察的反映得以顯現(xiàn)，可對微量抗原進行定性定量測定，敏捷度提高。結合顯微鏡技術，還可對抗原物質(zhì)作出組織內(nèi)或細胞內(nèi)的定位測定。（1）熒光抗體診療試劑：熒光抗體是用熒光色素,如異硫氰酸熒光素（FITC）、羅丹明（RB200）、藻紅素（PE）等標記抗體蛋白，即成熒光抗體。用熒光抗體浸染含有抗原物質(zhì)的組織切片或細胞，熒光抗體就與抗原結合，在熒光顯微鏡下成為發(fā)光的可視物，從而達成診療和定位的目的。（2）免疫酶抗體診療試劑：酶標診療試劑a、HBsAg(乙型肝炎表面抗原)酶標診療試劑b、HBeAg(乙型肝炎e抗原)酶標診療試劑c、HAVAg(甲型肝炎病毒抗原)酶標診療試劑d、測定HIV（人免疫缺點病毒）抗原的酶標診療試劑e、AFP（甲胎蛋白）酶標診療試劑f、CEA（癌胚抗原）酶標診療試劑（3）放射免疫用抗體診療試劑把放射性核素分析的高敏捷性與抗原抗體反映的特異性兩大特點結合起來建立的檢測技術。能測出ng/ml，甚至pg/ml水平的微量抗原物質(zhì)。慣用的標記抗體試劑：a、HBsAg放射性核素標記抗體診療試劑：125I標記，敏捷度0.1ng/mlb、HBeAg放射性核素標記抗體診療試劑：125I標記，敏捷度0.1ng/mlc、HAV抗原放射性核素標記抗體診療試劑：125I標記d、AFP放射性核素標記抗體診療試劑：125I標記，敏捷度1~5ng/mle、CEA放射性核素標記抗體診療試劑：125I標記，敏捷度1ng/ml3、導向診療藥品由于腫瘤的特異性小分子抗體尚在研究之中，因此導向藥品尚未愛臨床廣泛應用。三、CD單克隆抗體系列P169應用以單克隆抗體鑒定為主的辦法，將來自不同實驗室的單克隆抗體所識別的同一種白細胞分化抗原歸稱為CD（clusterofdifferentiation）。人CD的編號已從CD1命名至CD247，大致分為13組。第七節(jié)抗體治療藥品1、抗體治療藥品有哪些？P173以抗體為載體的導向治療藥品，還不成熟。（1）放射性核素標記的抗體治療藥品抗體作為放射性核素的導向載體，標記操作簡便用量小。放射性核素標記的抗體對腫瘤細胞殺傷較大。（2）抗癌藥品偶聯(lián)的抗體藥品①慣用的抗癌藥品氨甲喋呤（MTX）、阿霉素（ADM）、絲裂霉素（MMC）等。以人血漿白蛋白作為中間載體，可明顯提高每分子抗體所攜帶的MTX量，使體外細胞毒性體高二倍。②抗體類藥品逆轉(zhuǎn)耐藥性（3）毒素偶聯(lián)的抗體藥品在導向藥品中，毒素和抗體的交聯(lián)物稱為免疫毒素。①第一代免疫毒素是包含有A、B鏈完整毒素和抗體的交聯(lián)物，其中B鏈非特異性結合，使其僅在體外應用。②第二代免疫毒素是運用抗體或抗體片段與毒素的A鏈或與A鏈相似的單鏈核糖體失活蛋白的結合物。因避免了第一代免疫毒素的非特異性，故能在體內(nèi)有一定的抗腫瘤作用。③第三代免疫毒素重組免疫毒素用基因克隆辦法改造毒素基因和小分子抗體基因重組體現(xiàn)。特異性好、穩(wěn)定性強、滲入性佳、免疫源性低、可大量制備。（3）免疫毒素的臨床應用治療腫瘤、本身免疫病，并能克復組織移植排斥反映，可單獨給藥也可包裹在脂質(zhì)體及其它微粒中給藥。第五章植物細胞制藥第一節(jié)基本概念1、植物細胞的全能性。P177植物體中任何一種含有完整細胞核（完整染色體組）的細胞，在一定條件下都能夠重新再分化形成原來的個體。第二節(jié)植物細胞工程發(fā)展簡史（略）第三節(jié)植物細胞的形態(tài)及生理特性1、植物細胞是由細胞壁、原生質(zhì)體、后含物三大部分構成P1812、細胞壁、質(zhì)體、液泡三部分是植物細胞特有的構造，動物細胞沒有3、植物培養(yǎng)細胞重量的增加重要取決于對數(shù)期，而次級代謝產(chǎn)物的積累重要在穩(wěn)定時（植物細胞培養(yǎng)時期：延遲期、加速期、對數(shù)期、穩(wěn)定時四個時期）4、植物培養(yǎng)細胞的生理特性;P183（1）生長階段特性延遲期：細胞數(shù)量不變，核酸及蛋白合成較快加速期：最大生長久，最大細胞濃度對數(shù)期：細胞數(shù)呈對數(shù)增加穩(wěn)定時：細胞高液泡化，非常脆弱（2）植物細胞與動物細胞、微生物細胞比較特性哺乳動物細胞植物細胞微生物細胞大?。é蘭）10~10010~1001~10生長懸浮、貼壁懸浮懸浮營養(yǎng)規(guī)定很復雜較復雜很簡樸生長速度（倍增時間：h）慢；15~100慢；20~120快；0.5~5細胞分化有有限分化無環(huán)境影響非常敏感敏感普通細胞壁無有有產(chǎn)物存在部位胞內(nèi)或胞外胞內(nèi)或胞外胞內(nèi)或胞外產(chǎn)物濃度低低高含水量-約90約75供氧需求1~2520~30100~1000產(chǎn)物種類疫苗、單抗、酶、生長因子、激素、免疫調(diào)節(jié)劑酶、天然色素、天然有機化合物等發(fā)酵食品、抗生素、有機化合物、酶等第四節(jié)植物細胞培養(yǎng)的基本技術1、植物材料的準備；P185植物組織培養(yǎng)的外植體必須是無雜菌材料。植物組織培養(yǎng)時表面解決的慣用滅菌劑是次氯酸鈣、次氯酸鈉、氯化汞。2、植物細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基構成P186（1）無機鹽：①大量元素：N,S,P,K,Mg,Ca,Cl,Na②微量元素：Fe,Mn,Zn,Cu,Co,Ni等（2）碳源：糖類，肌醇等；也可直接通過光合作用吸取CO2（3）植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)P189①生長素類:吲哚乙酸（IAA）、②分裂素：6-芐基腺嘌呤（6-BA）植物組織和細胞培養(yǎng)物的生長重要取決于生長素和分裂素的比例。高濃度生長素和低濃度分裂素刺激細胞分裂，而低濃度生長素和高濃度分裂素刺激細胞生長。（植物激素：指植物代謝過程中形成的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，在極低濃度（<1M）時即能調(diào)節(jié)植物的生育過程，并能從合成部位轉(zhuǎn)運到作用部位而發(fā)揮作用。植物激素是現(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)植物組織中能夠形成5種植物激素，即生長素、分裂素、赤霉素、脫落酸和乙烯。）（4）氮源：蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物或多個氨基酸。（5）維生素：B族維生素、生物素、肌醇。3、植物細胞大規(guī)模培養(yǎng)的辦法及特點；P191（1）大規(guī)模植物細胞懸浮培養(yǎng)①成批培養(yǎng)法（分批）：最適于植物細胞培養(yǎng)的反映器是氣升式反映器將培養(yǎng)基一次性加入反映器中，接種、培養(yǎng)一定時間后收獲細胞的操作方式②半持續(xù)培養(yǎng)：在反映器中投料和接種培養(yǎng)一段時間后，將部分培養(yǎng)液和新鮮培養(yǎng)基進行家換。③持續(xù)培養(yǎng)：運用持續(xù)培養(yǎng)反映器，在投料和接種培養(yǎng)一段時間后，以一定速度持續(xù)采集細胞和培養(yǎng)液，并以同樣速度供應新鮮配演技以使細胞生長環(huán)境維持穩(wěn)定。（2）固定化培養(yǎng)將細胞固定在固定化反映器上（內(nèi)），放入新鮮培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，或持續(xù)流入新鮮培養(yǎng)基，進行持續(xù)培養(yǎng)及收集產(chǎn)物，因?qū)⒓毎潭?，易于獲得高密度細胞群體及維持細胞間物理化學梯度，易于細胞組織化，易于控制條件和獲得較高含量次級代謝產(chǎn)物。第五節(jié)影響植物次級代謝產(chǎn)物激積累的因素1、影響植物次級代謝產(chǎn)物積累的因素有哪些？P192（1）生物條件：外植體、季節(jié)、休眠、分化等（2）物理條件：溫度、光（強度、時間、光質(zhì)）、通氣、PH和滲入壓（3）化學條件：無機鹽、碳源、生長調(diào)節(jié)劑、維生素、氨基酸、核酸、抗生素、天然物質(zhì)、前體等（4）工業(yè)培養(yǎng)條件：培養(yǎng)罐類型、通氣、攪拌、培養(yǎng)辦法等2、重要影響因素P193（一）外植體選擇：不同外植體的懸浮細胞培養(yǎng)物，其最大次級代謝產(chǎn)物的累積時間各異。（二）培養(yǎng)條件的影響（1）內(nèi)在因素①接種和誘導：次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)率與外肢體的大小、細胞密度與營養(yǎng)成分有關②培養(yǎng)基的基本構成：培養(yǎng)基的多個成分是愈傷組織和懸浮培養(yǎng)細胞的物質(zhì)基礎，特別是穩(wěn)定時的次級代謝產(chǎn)物的積累。（磷、氮；銅是次級代謝產(chǎn)物積累的必要元素）③碳源：糖是使用最廣、作用最強的碳源，對次級代謝產(chǎn)物影響重要取決于使用的糖種類、糖濃度及另首先級代謝產(chǎn)物的生物合成過程。④植物生長調(diào)節(jié)劑：不同植物激素及其不同組合形式均可明顯影響次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生。⑤O2和PH：植物細胞正常呼吸需要氧氣，因此需要供氧；普通最利于培養(yǎng)植物細胞的PH在5~6⑥滲出物：其它代謝產(chǎn)物也會影響產(chǎn)物產(chǎn)量（2）外在因素①溫度:代謝產(chǎn)物產(chǎn)生最佳溫度是20~28℃；②攪拌頻率：適宜③培養(yǎng)容器④光：光照時間、光質(zhì)、強度都有影響（三）兩步法培養(yǎng)：第一步使用適合細胞生長的培養(yǎng)基（生長培養(yǎng)基），第二步使用適合次級代謝產(chǎn)物合成的培養(yǎng)基（生產(chǎn)培養(yǎng)基）。P197第六節(jié)植物細胞培養(yǎng)的生物反映器1、植物細胞反映器的選擇取決于：生產(chǎn)細胞的密度、通氣量、提供的營養(yǎng)成分的分散程度。P1992、植物細胞大規(guī)模培養(yǎng)的生物反映器P201（1）機械攪拌式生物反映器：反映器內(nèi)溫度、PH、溶氧及營養(yǎng)物物濃度易控制。（2）鼓泡塔生物反映器：沒有運動部件，操作不易染菌，有較高的熱量和質(zhì)量傳遞，容易放大，但是流動形式難以擬定，混合不均。（3）氣升式生物反映器：低剪切力，混合與氧傳遞效果好，運動部件不易染菌，操作費用低，但是高密度培養(yǎng)時候混合不夠均勻。（4）轉(zhuǎn)鼓式生物反映器：比較適合高密度培養(yǎng)，但是難于大規(guī)模操作，放大困難。（5）固定化細胞生物反映器：細胞可長時間重復使用，保護細胞免受剪切力，以實現(xiàn)高密度培養(yǎng)，有助于次級代謝產(chǎn)物合成，易于持續(xù)化操作。第七節(jié)進展與展望1、植物細胞培養(yǎng)有哪些新進展？P204（1）誘導子在植物細胞工程中的應用：運用誘導子進行有目的次級代謝產(chǎn)物調(diào)控及生物合成。（誘導子：植物抗毒素是在植物防御系統(tǒng)內(nèi)能對抗微生物攻打的某些次級代謝產(chǎn)物，觸發(fā)形成植物抗毒素信號的物質(zhì)稱為誘導子。誘導子有兩種分類，一種是根據(jù)在細胞內(nèi)或細胞外形成而將其分為內(nèi)源性誘導子和外源性誘導子；另一種是根據(jù)其來源分為生物誘導子和非生物誘導子。）（2）前提飼喂（3）兩相法培養(yǎng)：水相培養(yǎng)的基礎上，加入固相或疏水相，形成兩相培養(yǎng)系統(tǒng)，從而達成收集分泌物的目的。（4）轉(zhuǎn)基因技術（5）植物生物轉(zhuǎn)化技術與生物制藥：生物轉(zhuǎn)化既能夠生產(chǎn)新的化合物，又能夠改造已有化合物、增加目的產(chǎn)物產(chǎn)量。（生物轉(zhuǎn)化：運用離體培養(yǎng)細胞或器官及細胞器等對外源化合物進行構造修飾而獲得有價值產(chǎn)物的生理生化反映）第六章酶工程制藥第一節(jié)概述1、酶工程：從應用的目的出發(fā)研究酶、應用酶的特異催化性能，并通過工程化將對應原料轉(zhuǎn)化成有用物質(zhì)的技術。P2162、酶工程重要研究內(nèi)容是什么？P216（1）酶的分離、提純、大批量生產(chǎn)及新酶的應用開發(fā)。（2）酶和細胞的固定化及酶反映器的研究。（3）酶生產(chǎn)中基因工程的應用及遺傳修飾酶的研究。（4）酶的分子改造與化學修飾、以及酶的構造與功效之間關系的研究（5）有機相中酶反映的研究。（6）酶的克制劑、激活劑的開發(fā)和應用研究。（7）抗體酶、核酸酶的研究。（8）模擬酶、合成酶及酶分子的人工設計、合成的研究。3、現(xiàn)在工業(yè)上應用的酶大多采用微生物發(fā)酵法來生產(chǎn)。P2174、應用最廣泛的產(chǎn)酶菌：大腸桿菌、枯草桿菌、啤酒酵母、曲霉（黑曲霉和黃曲霉）。P2185、酶法檢測可分為：單酶反映、多酶偶聯(lián)反映、酶標免疫反映。P218第二節(jié)酶和細胞固定化1、固定化酶的特點和優(yōu)點各是什么？P219（1）固定化酶：限制或固定于特定空間位置的酶。（2）固定化酶的特點：既含有生物催化劑的功效，又含有固相催化劑特性。（3）優(yōu)點：①可多次使用；②反映后，酶底物產(chǎn)物易分開，產(chǎn)物中無殘留酶，易純化，產(chǎn)品質(zhì)量高；③反映條件易控制；④酶的運用效率高；⑤比水溶性酶更適合于多酶反映。缺點：①酶活力有損失②成本增加③只適應可溶性第五，且小分子底物④胞內(nèi)酶需分離純化⑤與完整菌相比不適宜多酶反映。2、固定化細胞的特點和優(yōu)缺點各是什么？P225（1）固定化細胞：將細胞限制或定位于特定空間位置的辦法。（2）特點：有細胞特性，現(xiàn)有生物催化劑功效，又有固相催化劑特點。（3）優(yōu)點：①不必進行酶的分離純化②保持酶的原始狀態(tài)，酶回收率高；③比固定化酶穩(wěn)定性高；④細胞內(nèi)酶附助因子可再生；⑤細胞本身含多酶體系；⑥抗污染能力強缺點：①副產(chǎn)物多②細胞的壁、膜和載體都存在擴散限制作用③載體的空隙大小影響高分子底物的通透性3、酶和細胞的固定化辦法P220（1）載體結正當：將酶結合于不溶性載體上的固定化辦法①物理吸附法：用物理辦法將酶吸附于不溶性載體（如活性炭等）上的固定化辦法。②離子結正當：酶通過離子鍵結合于含有離子交換基的水不溶性載體上。③共價結正當：酶以共價鍵結合于載體上。即將酶分子上非活性部位功效團與載體表面反映基團進行共價結合的辦法。（2）交聯(lián)法：用雙功效或多功效試劑使酶與酶或細胞與細胞之間交聯(lián)的辦法。交聯(lián)法又分：交聯(lián)酶法、酶與輔助蛋白交聯(lián)法、吸附交聯(lián)法和載體交聯(lián)法。慣用的交聯(lián)劑：戊二醛、雙重氮聯(lián)苯胺-2、2-二磺酸、1,5-二氟-2,4-二硝基苯。（3）包埋法：①網(wǎng)格型：將酶或細胞包埋在高分子凝膠細微網(wǎng)格中。慣用合成高分子化合物有聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、光敏樹脂。天然高分子化合物有淀粉、明膠、膠原、海藻膠、角叉菜膠。多用于固定化細胞。②微囊型：將酶或細胞包埋在高分子半透膜中。普通為直徑幾微米到幾百微米的球狀體。（4）無載體法（選擇性熱變性法）：在適宜溫度下解決使細胞膜蛋白變性，但酶不變性使酶固定于細胞內(nèi)。此法只合用于細胞固定化。4、固定化酶的性質(zhì)（變化）P228（1）酶活力的變化：酶通過固定化之后活力大都下降。（2）酶穩(wěn)定性的變化：涉及對溫度、pH、蛋白酶變性劑和克制劑的耐受程度。固定化后，穩(wěn)定性提高，有效壽命延長。其因素是限制了酶分子之間的互相作用，制止了其自溶，增加了酶構型的牢固程度。（3）酶學特性的變化①底物專一性：對底物的專一性下降。②最適pH：最適pH可能變大，也可能變?。虎圩钸m溫度：普通升高。因素是固定化后空間構造更為穩(wěn)定。④米氏常數(shù)(Km)：Km值均發(fā)生變化，有的增加很小，有的增加很大，但不會變小。⑤最大反映速度（Vm）：變化很小或不變。6、固定化酶活力測定辦法：分批測定法和持續(xù)測定法。P231第三節(jié)固定化酶和固定化細胞的反映器1、反映器的類型和特點P232（1）間歇式攪拌罐反映器：用于游離酶反映后隨即放料。（2）持續(xù)流動攪拌罐反映器：持續(xù)進料、持續(xù)出料（3）填充床反映器：固定化酶填充于床層內(nèi)。反映器內(nèi)的流體的流動形態(tài)為平推流形。底物以恒定流速通過反映床。（4）流化床反映器：底物以足夠大的流速向上通過固定化酶床層，使固體顆粒處在流化狀態(tài)，達成混合的目的。（5）循環(huán)反映器：部分反映液流出和新加入底物流入液混合，在進入反映床進行循環(huán)。（6）持續(xù)流動攪拌罐-超濾膜反映器（7）其它反映器第四節(jié)酶的人工模擬1、人工模擬酶：根據(jù)酶的作用原理，用多個辦法人為制造的都有酶性質(zhì)的催化劑。它們普通含有高效和高適應性的特點，在構造上相對天然酶簡樸。P2352、主-客體化學和超分子化學是酶人工模擬的重要理論基礎。P2363、模擬酶的分類P236（1）根據(jù)Kirby分類法：單純酶模型、機理酶模型、單純合成的酶樣化合物（2）主-客體酶模型：主-客體酶（環(huán)糊精CD）、膠束酶模型、肽酶、、分子印跡酶模型、半合成酶4、何謂分子印跡？分子印跡的應用范疇有哪些？P238分子印跡：指制備對某一特定分子含有選擇性的聚合物的過程，該特定分子稱為印跡分子或模板。分子印跡的應用范疇有：①分子印跡聚合物可作為裁剪分離物質(zhì)的材料，如手性藥品的分離，也能夠分離大分子物質(zhì)。②在酶技術和有機合成中，分子印跡聚合物可作為模擬抗體，模擬酶或含有催化活性的聚合物。③分子印跡聚合物還可在生物傳感器的構建中作為傳感器，這種聚合物可作為普通使用的生物材料的替代物。第五節(jié)酶的化學修飾1、為什么要對酶進行化學修飾?P242酶作為生物催化劑，其高效性和專一性是其它催化劑所無法比擬的。但是，酶是蛋白質(zhì)，存在其異體蛋白的抗原性、受蛋白酶水解和克制劑作用、在體內(nèi)半衰期短等缺點，嚴重影響使用效果。工業(yè)用酶經(jīng)常由于酶蛋白抗酸、堿、有機溶劑變性及抗熱失活能力差，容易受產(chǎn)物和克制劑的克制，工業(yè)反映規(guī)定的pH和溫度不總在酶反映的最適pH和最適溫度范疇內(nèi)，底物不溶于水或酶的Km值過高等弱點，限制了酶制劑的應用范疇。酶的化學修飾就是對酶在分子水平上用化學辦法進行改造，從而提高酶的穩(wěn)定性、解除酶的抗原性、變化酶學性質(zhì)、擴大酶的應用范疇。2、酶化學修飾：通過化學辦法對酶分子的主鏈進行切割、剪接和側(cè)鏈基團的化學修飾改造，以變化其理化性質(zhì)和生物活性。P2423、化學修飾的目的：人為地變化天然酶的某些性質(zhì)，發(fā)明天然酶所不含有的某些優(yōu)良特性甚至發(fā)明出新活性，來擴大酶的應用領域，增進生物技術的發(fā)展。①提高生物活性②增強在不良環(huán)境（非生理條件）中的穩(wěn)定性③針對異體反映，減少生物識別能力。4、酶化學修飾的辦法P243（1）酶的表面化學修飾①大分子修飾：可溶性大分子，如PEG、葡聚糖等通過共價鍵連接（其中分子量500-0的PEG使用最廣）；②小分子修飾：小分子對其活性部位或側(cè)鏈基團修飾，如氨基葡萄糖等；③交聯(lián)修飾：雙功效試劑如戊二醛等將酶分子之間、亞基之間或分子內(nèi)不同肽鏈部位進行共價交聯(lián)；④固定化修飾：酶共價連接惰性載體（2）酶分子內(nèi)部修飾①非催化活性基團修飾：變化酶對特殊底物的束縛能力；②蛋白主鏈修飾；③催化活性基團修飾；④與輔助因子有關的修飾⑤肽鏈延伸后修飾（3）結合定點突變的化學修飾：得到新的酶制劑5、修飾酶的特性；P244⑴熱穩(wěn)定性提高；⑵抗各類失活因子能力提高；⑶抗原性消除；⑷體內(nèi)半衰期延長；⑸最適變化；⑹酶學性質(zhì)變化：Km會增大，專一性變化等；⑺對組織分布能力變化第六節(jié)酶工程研究的進展（有機相酶反映、核酶和脫氧核酶、抗體酶）1、有機相酶反映的定義及其優(yōu)點是什么？P247（1）有機相酶反映是指酶在含有有機溶劑存在的介質(zhì)中所進行的催化反映。（2）有機相酶反映的優(yōu)點：①增加疏水性底物或產(chǎn)物的溶解度；②熱力學平衡向合成方向移動，如酯合成、肽合成等；③可克制有水參加的副反映；④酶不溶于有機介質(zhì)，易于回收再運用；⑤容易從低沸點的溶劑中分離純化產(chǎn)物；⑥酶的熱穩(wěn)定性提高，pH的適應性擴大；⑦無微生物污染；⑧能測定某些在水介質(zhì)中不能測定的常數(shù)；⑨固定化酶辦法簡樸，能夠只沉淀在載體表面。2、有機相酶反映的溶劑體系各是什么？如何選擇溶劑體系和有機溶劑的種類？P248按照溶劑體系的構成和特點，現(xiàn)在有機相酶反映重要有4種溶劑體系。（1）水—水溶性溶劑均相體系：由水和水溶性有機溶劑互相溶解而形成的均一體系。（2）水—水不溶性溶劑兩相體系：有機溶劑在水中的溶解度盡量小。在該體系中，規(guī)定底物在水和有機溶劑中的溶解度盡量大，而產(chǎn)物在水中的溶解度要小。（3）反相膠團體系：由兩性化合物在占優(yōu)勢的有機相中形成的一系列包圍水滴的體系。（4）單相有機溶劑體系：在該體系中，不存在單獨的水相，只含極微量的水，即在酶分子周邊存在著一層水分子膜，以維持催化反映所必需的構象。選擇溶劑體系和有機溶劑的種類要根據(jù)酶的性質(zhì)、底物和產(chǎn)物的溶解度及反映器的型式等具體狀況而定。3、核酶：（1）剪切性核酶：錘頭型核酶、發(fā)夾型、丁型肝炎病毒（HDV）核酶、蛋白質(zhì)-RNA復合酶（RNaseP）（2）剪接型核酶：Ⅰ內(nèi)含子、Ⅱ內(nèi)含子；P2504、抗體酶：一種新型人工酶制劑，是一種含有催化功效的抗體分子，在其可變區(qū)賦予了酶的屬性。它是運用當代生物學與化學的理論與技術交叉研究的成果，是抗體的高度選擇性和酶的高效催化能力巧妙結合的產(chǎn)物。P252第七章發(fā)酵工程制藥第一節(jié)概述1、發(fā)酵工程：微生物工程，運用微生物制造工業(yè)原料與工業(yè)產(chǎn)品并提供服務的技術。P2592、發(fā)酵工程發(fā)展4個階段：發(fā)酵工程發(fā)展4個階段：（1）20世紀前，傳統(tǒng)發(fā)酵（酒、醋等）（2）1900-1940，揭示發(fā)酵本質(zhì)-微生物引發(fā)，誕生許多新的發(fā)酵產(chǎn)品（甘油、丙酮等），純培養(yǎng)技術；（3）發(fā)酵大發(fā)展，青霉素工業(yè)推動發(fā)酵，深層培養(yǎng)技術；重要標志有：抗生素、氨基酸、核酸、甾體的微生物轉(zhuǎn)化（4）基因工程應用于發(fā)酵；P2