實時熒光定量法檢測血管內(nèi)皮生長因子c和血管內(nèi)皮生長因子受體-3mrna的表達

實時熒光定量法檢測血管內(nèi)皮生長因子c和血管內(nèi)皮生長因子受體-3mrna的表達

血管內(nèi)生長因子的聚集是糖蛋白，這對血液、血管生成、淋巴管生成和血管透射作用非常有效。血管內(nèi)皮生長因子受體-3(vascularendothelialgrowthfactorreceptor-3,VEGFR-3)在胚胎早期的血管內(nèi)皮細胞上廣泛表達,但在胚胎發(fā)育后期和出生后,僅限制性地表達在淋巴管內(nèi)皮細胞上。研究發(fā)現(xiàn),血管內(nèi)皮生長因子-C(vascularendothelialgrowthfactor-C,VEGF-C)有促進毛細管結(jié)構(gòu)形成作用,VEGF-C與VEGFR-3結(jié)合,兩者形成的自分泌途徑與腫瘤淋巴管生成關(guān)系密切,腫瘤細胞產(chǎn)生的VEGF-C通過VEGF-C、VEGFR-3自分泌途徑,引起VEGFR-3激活,促進淋巴管內(nèi)皮細胞的增生及新生淋巴管形成,最終導(dǎo)致淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。本研究自行建立實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(FQ-RT-PCR),并在此基礎(chǔ)上定量測定了食管癌患者癌組織及其癌旁組織VEGF-CmRNA、VEGFR-3mRNA表達水平。材料和方法一、病例選擇及資料來源2007年8月至2008年3月在第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長征醫(yī)院胸外科接受手術(shù)治療的原發(fā)性食管癌患者40例,男29例,女11例,年齡46～74歲,符合1990年《中國常見惡性腫瘤診治規(guī)范》原發(fā)性食管癌患者診斷標(biāo)準(zhǔn),臨床病理資料完整。食管癌TNM分期:0期+Ⅰ期5例,Ⅱ期25例(ⅡA期11例,ⅡB期14例),Ⅲ期10例;其中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移24例,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移16例;術(shù)前未接受任何放射和化學(xué)治療。手術(shù)后在食管癌組織原發(fā)灶取病理切片的同時,取癌組織及其癌旁組織(避開壞死、炎癥部位)置-70℃?zhèn)溆?。二、實時pcr、實時pcr、dnama組織總RNA抽提試劑盒、膠回收試劑盒、質(zhì)粒DNA抽提試劑盒(上海華舜公司),pMD18-T載體試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒、實時PCR試劑盒、DNAmarker(DL2000)(大連寶生物工程公司)。DU640紫外分光光度儀(美國Beckman公司),PTC-200擴增儀(Bio-rad公司),ABIPrism7000熒光定量分析儀(美國ABI公司)。三、vegfr-3基因表達依據(jù)GenBank收錄的VEGF-CmRNA全序列NM_005429與VEGFR-3mRNA全序列NM_002253,利用BeaconDesigner2.1軟件設(shè)計引物和探針,均由上海生工公司合成,序列見表1。四、總rna的純度組織總RNA提取按說明書操作,紫外分光光度儀檢測總RNA的純度(260與280nm波長處吸光度比值為1.66～2.15)和濃度。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明書合成cDNA,分裝后置-70℃保存?zhèn)溆谩Ｎ?、pcr反應(yīng)條件的確定PCR擴增體系50μL:PremixTaq25μL,cDNA2.5μL,上、下游引物(20μmol/L)各1μL,滅菌雙蒸水20.5μL,先設(shè)置梯度溫度進行PCR反應(yīng),以確定最適反應(yīng)溫度。VEGF-CmRNA和VEGFR-3mRNA反應(yīng)條件:預(yù)變性94℃2min;94℃30s,60℃30s,72℃1min,30個循環(huán);72℃延伸5min。六、重組質(zhì)粒pmd18-vegf-c和pmd18-vegfr-3的鑒定VEGF-C和VEGFR-3的PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳、膠回收、純化后,與pMD18-T載體連接,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細胞,抽提、純化重組質(zhì)粒pMD18-VEGF-C和pMD18-VEGFR-3,鑒定陽性克隆,測序證實該片段序列的準(zhǔn)確性。七、種標(biāo)準(zhǔn)模板反應(yīng)條件優(yōu)選將VEGF-C和VEGFR-3質(zhì)粒定值品分別用滅菌雙蒸水1∶10稀釋成108～102拷貝/μL系列濃度的模板。反應(yīng)體系50μL,其中上述不同稀釋度的2種標(biāo)準(zhǔn)模板1μL,PremixExTaq25μL,上、下游引物(20μmol/L)各lμL,ROXReferenceDye1μL,熒光探針溶液(10μmol/L)1μL,滅菌雙蒸水20μL。反應(yīng)條件:94℃10s預(yù)變性;94℃15s,60℃1min,40個循環(huán)。八、egfr-3定值品40例患者食管癌組織及其癌旁組織cDNA與不同稀釋度的VEGF-C和VEGFR-3定值品按上述反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進行擴增。根據(jù)擴增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算出各標(biāo)本VEGF-C、VEGFR-3基因表達的拷貝數(shù),除以該標(biāo)本總RNA量,即為單位質(zhì)量的基因拷貝數(shù)(拷貝/μg總RNA)。九、cvcv用SPSS11.5統(tǒng)計分析軟件計算均值、變異系數(shù)(CV);2組間比較分析采用Mann-WhitneyU非參數(shù)檢驗方法,2指標(biāo)相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析方法,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果一、產(chǎn)品電泳如vegf-c和vegfr-3cda取5μL擴增產(chǎn)物行1%瓊脂糖凝膠電泳。可分別觀察到151bp特異性擴增條帶,與預(yù)期的大小一致,見圖1。二、vegf-mcna和vegfr-3mna標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制將不同稀釋度的定值品同時進行定量PCR檢測,所得循環(huán)閾值(Ct)與其對應(yīng)定量模板的對數(shù)作圖,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,見圖2、3。VEGF-CmRNA和VEGFR-3mRNA標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)(r)均≥0.990。VEGF-C線性方程為Y=-2.680X+42.07;VEGFR-3線性方程為Y=-3.350X+47.44。三、高、低濃度標(biāo)本測定的批內(nèi)cv選擇VEGF-CmRNA和VEGFR-3mRNA高濃度標(biāo)本和低濃度標(biāo)本,當(dāng)日分別重復(fù)測定10次,分別得到高、低濃度標(biāo)本測定的批內(nèi)CV;同樣將此2份標(biāo)本連續(xù)測定6d,分別得到高、低濃度標(biāo)本測定的批間CV,見表2。四、癌癥患者及其周邊組織的vegf-cmrra和vegfr-3mnma的研究食管癌患者癌組織及其癌旁組織中VEGF-CmRNA和VEGFR-3mRNA表達水平見表3。1.癌旁組織與癌旁組織vegfr-3mrna表達比較mRNA在食管癌患者癌組織和癌旁組織中的表達食管癌患者癌組織VEGF-CmRNA表達水平顯著高于癌旁組織(P<0.001),而癌組織與癌旁組織VEGFR-3mRNA的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。在食管癌組織和癌旁組織中,VEGF-CmRNA與VEGFR-3mRNA的表達水平均呈顯著正相關(guān)(r值分別為0.838和0.815,P均<0.001)。2.vegf-mcna和vegfr-3mna表達水平比較mRNA在食管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組與未轉(zhuǎn)移組的癌組織及其癌旁組織中的表達食管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組癌組織和癌旁組織VEGF-CmRNA和VEGFR-3mRNA水平分別顯著高于淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移組(P均<0.001);2組的癌組織VEGF-CmRNA表達水平均顯著高于癌旁組織(P<0.001);2組的癌組織與癌旁組織之間VEGFR-3mRNA表達水平的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。3.vegfr-3mrna表達水平的季節(jié)變化mRNA在食管癌患者癌組織的表達水平與臨床病理分期的關(guān)系VEGF-CmRNA的表達水平在ⅡA期與ⅡB期、ⅡA期與Ⅲ期間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.01),在0期+Ⅰ期+Ⅱ期與Ⅲ期間差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。VEGFR-3mRNA的表達水平在ⅡA期與ⅡB期、ⅡA期與Ⅲ期間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.001﹚,在ⅡA期+ⅡB期與Ⅲ期、0期+Ⅰ期+Ⅱ期與Ⅲ期間VEGFR-3mRNA的表達水平差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P分別<0.05和<0.01)。VEGF-CmRNA和VEGFR-3mRNA的表達水平與食管癌臨床病理分期有密切關(guān)系,尤其在食管癌早期與中晚期間差異顯著。vegf-c和vegfr-3對肺癌腫瘤細胞淋巴管誘導(dǎo)的作用機制我國是世界上食管癌發(fā)病率和死亡率最高的國家之一,食管癌的發(fā)病機制尚未完全闡明,早期主要通過淋巴轉(zhuǎn)移,晚期可經(jīng)血行轉(zhuǎn)移。部分中晚期食管癌患者伴有淋巴轉(zhuǎn)移,療效不佳,預(yù)后較差,生存率下降。因此研究癌細胞淋巴管轉(zhuǎn)移機制,尋找提示淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的分子標(biāo)志物有著重要意義。VEGF家族是一組分泌型糖蛋白,對造血、血管生成、淋巴管生成和血管通透性均有調(diào)節(jié)作用,與許多生理病理過程相關(guān)。VEGF-C由Joukou等于1996年從人類前列腺癌細胞中克隆純化,人VEGF-C基因位于染色體4q34,編碼相對分子質(zhì)量為4690、含419個氨基酸殘基的蛋白,有促進毛細管結(jié)構(gòu)形成作用,在人體心臟、胎盤、骨骼肌、卵巢、小腸等組織中均有弱表達。VEGFR-3是VEGF-C的受體之一,由Aprelikova等于1992年從人的胚胎和白血病細胞cDNA文庫中克隆得到,位于染色體5q33～q35,編碼相對分子質(zhì)量為180000的糖基化單鏈跨膜蛋白,是胚胎期胚胎血管形成的必需因素,在血管和淋巴管內(nèi)皮細胞都有分布,成年后僅限表達于淋巴內(nèi)皮細胞。目前比較一致的觀點是,VEGFR-3不僅是淋巴管內(nèi)皮細胞的特異性標(biāo)志物,而且也是淋巴管生成的調(diào)節(jié)因子。腫瘤細胞能產(chǎn)生大量VEGF-C,并可通過VEGF-C和VEGFR-3自分泌或旁分泌途徑與受體VEGFR-3結(jié)合,引起VEGFR-3的激活,使受體自身磷酸化,細胞有絲分裂增加,誘導(dǎo)淋巴管內(nèi)皮細胞增殖,從而使淋巴管擴張或增生,形成新生的淋巴管,腫瘤外周淋巴管數(shù)量增加,管腔擴張,區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率增高,從而明確了VEGF-C和VEGFR-3在腫瘤的淋巴管生成和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過程中的重要作用,淋巴轉(zhuǎn)移在食管癌中的特殊地位決定了食管癌可以作為研究VEGF-C和VEGFR-3與腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移機制的良好載體。本研究發(fā)現(xiàn)VEGF-C主要表達在食管癌組織中,癌組織VEGF-CmRNA表達水平均顯著高于癌旁組織(P均<0.001);本研究同時發(fā)現(xiàn)不論在食管癌組織還是癌旁組織中VEGF-C與VEGFR-3呈明顯的正相關(guān)(r值分別為0.838和0.815,P均<0.001),顯示VEGF-C與VEGFR-3呈同步增長可能是腫瘤細胞產(chǎn)生的大量VEGF-C與VEGFR-3結(jié)合后,激活VEGFR-3,致使VEGFR-3表達也隨之增加之故,這與Arinaga等的報道一致。本研究結(jié)果表明,轉(zhuǎn)移組的食管癌組織和癌旁組織中VEGF-C和VEGFR-3與未轉(zhuǎn)移組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.001),提示VEGF-C與VEGFR-3與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間關(guān)系密切,與Saintigny等的結(jié)果一致;VEGF-C與VEGFR-3系統(tǒng)促進食管癌淋巴轉(zhuǎn)移的作用可能與以下機制有關(guān):(1)食管癌細胞產(chǎn)生VEGF-C與淋巴管內(nèi)皮細胞上VEGFR-3受體結(jié)合,刺激淋巴管內(nèi)皮細胞增殖,形成新生淋巴管及增加淋巴管通透性,導(dǎo)致食管癌組織和癌旁組織中淋巴管密度增高,為腫瘤細胞的淋巴管轉(zhuǎn)移創(chuàng)造有利條件;(2)相對于血管系統(tǒng)而言,淋巴管更有利于腫瘤細胞的擴散、存活及轉(zhuǎn)移;(3)VEGF-C可能改變了表達于淋巴管內(nèi)皮細胞的黏附分子和原有淋巴管功能,使之對腫瘤細胞的趨化性、淋巴管侵入和播散變得活躍;(4)VEGF-C不僅可促進癌組織和癌旁組織內(nèi)形成新生淋巴管,而且可促進原有淋巴管增生,管徑增加,并誘導(dǎo)淋巴管間及淋巴管與血管相互融合,從而促進淋巴轉(zhuǎn)移。既往的研究認(rèn)為腫瘤組織中不存在淋巴管,這難以解釋腫瘤的淋巴管轉(zhuǎn)移。Mihaela等和Veikkola等應(yīng)用基因轉(zhuǎn)染方法,使乳腺癌細胞表達VEGF-C,然后將其接種于裸鼠,證實VEGF-C可誘導(dǎo)腫瘤內(nèi)淋巴管的新生。腫瘤組織染色切片中分布有許多小的淋巴管,而對照鼠的腫瘤中淋巴管僅深入腫瘤約2mm,前者淋巴管密度約為后者的4.6倍,VEGFR-3的表達也相應(yīng)的增加,且這種增生的淋巴管中常包含腫瘤細胞。在腫瘤組織及腫瘤周圍包膜區(qū)存在集束狀或分散的淋巴管,這種淋巴管的分布較正常皮膚的淋巴管致密。本研究顯示,2組VEGFR-3mRNA在癌組織和癌旁組織表達水平相近,提示腫瘤及其周圍組織均有VEGFR-3參與淋巴管的生成。我們在研究中注意到,VEGF-CmRNA和VEGFR-3mRNA不僅在轉(zhuǎn)移組癌組織中升高,而且在部分未轉(zhuǎn)移組癌組織中升高,并高于轉(zhuǎn)移組癌組織中最低水平,這一發(fā)現(xiàn)提示在病理陰性的組織內(nèi)可能已經(jīng)發(fā)生了分子轉(zhuǎn)移行為或者說有微淋巴管的生成和微淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在。有研究發(fā)現(xiàn),VEGF-C有促進毛細管結(jié)構(gòu)形成作用,VEGF-C除與VEGFR-3結(jié)合外,還可與結(jié)合力較低的VEGFR-2結(jié)合,