小鼠肝癌細胞淋巴轉(zhuǎn)移潛能與shrna表達的關(guān)系

小鼠肝癌細胞淋巴轉(zhuǎn)移潛能與shrna表達的關(guān)系

肝腫瘤（hc）轉(zhuǎn)移是肝腫瘤患者預(yù)后不佳的主要原因。近年來,本課題組一直致力于肝癌淋巴轉(zhuǎn)移分子機制的研究。本實驗采用的細胞株為Hca-F(高轉(zhuǎn)移株)和Hca-P(低轉(zhuǎn)移株),是來源于同一親本,遺傳背景相似,但淋巴轉(zhuǎn)移潛能不同的小鼠肝癌細胞株,是研究肝癌淋巴轉(zhuǎn)移較為理想的動物模型。c-JunN端激酶(c-JunN-terminalkinase,JNK)是本課題組經(jīng)過篩選得到的介于Hca-F和Hca-P之間的差異基因之一,同時在蛋白質(zhì)表達水平差異也具有顯著性。目前JNK與腫瘤轉(zhuǎn)移方面的研究較少,國內(nèi)外尚無JNK與肝癌淋巴轉(zhuǎn)移關(guān)系的研究報道。為探討JNK與肝癌細胞株Hca-F淋巴轉(zhuǎn)移潛能的關(guān)系,本研究采用RNA干擾技術(shù)獲得抑制JNK基因表達的shRNA(smallhairpinRNA)序列,建立JNK表達穩(wěn)定下調(diào)的Hca-F細胞株,研究JNK表達下調(diào)后對肝癌細胞株遷移和侵襲能力的影響。1材料和方法1.1分離株,體重u,體重為1032g,材料為7.2%;近交系615小鼠,雄性,4～6周齡,體重18～22g,由大連醫(yī)科大學(xué)病理教研室繁育并提供。小鼠肝癌淋巴高轉(zhuǎn)移細胞株Hca-F由本教研室建立并保存。1.2實驗儀器和儀器LifeExpressPCR儀(大和公司,日本),紫外分光光度計HP8453(HP公司,德國),凝膠圖像分析系統(tǒng)BioSenSC300(上海山富科學(xué)儀器有限公司),低溫高速離心機Biofuge28RS(Heraeus公司,德國),恒溫水浴箱ModelDK-8D(上海森信實驗儀器有限公司),恒溫搖床(江蘇太倉科教儀器有限公司)。pSilencer質(zhì)粒(上海之江生物公司),Trizol、引物(Invitrogen公司),逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV、Taq酶(Promega公司),瓊脂糖(Biowest公司),DNAMarkerDL2000、限制性內(nèi)切酶及T4DNA連接酶(Takara公司),3s柱式質(zhì)粒抽提試劑盒(上海申能博采生物技術(shù)有限公司),Plasmidminikit(Qiagen公司),瓊脂糖DNA回收試劑盒(WatsonBiotech公司),胰化蛋白胨、酵母提取物(Oxoid公司),Tween-20、麗春紅、一抗anti-JNK及二抗Donkeyanti-mouse(SantaCruz公司),CellLysis、Supersignalwestfemtokit(Pierce公司),ECM、Fibronectin(Sigma公司),Transwell(ComingCoring公司)。1.3ctagctagctagctagctagctgaatctgaatctgictagctg/tgaatctctctctctctctctctctctctctctctctctctgaatctgaatctciptagctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctgaatctgaatctciptagctcipt發(fā)力依據(jù)GenBank中小鼠JNK基因序列(NM016700.3)設(shè)計shRNA靶序列,合成3條shRNA的DNA模板的兩條單鏈,分別命名為shRNA-1、shRNA-2和shRNA-3shRNA-1:5′-GATCCGCGCGCCTACCGAGAA-CTATTCAAGAGATAGTTCTCGGTAGGCGCG-CTTTTTGGAAA-3′,5′-AGCTTTTCCAAAAA-AGCGCGCCTACCGAGAACTATCTCTTGAAT-AGTTCTCGGTAGGCGCGCG-3′;shRNA-2:5′-G-ATCCGCAGGCCTAAATACGCTGGATTCAAG-AGATCCAGCGTATTTAGGCCTGTTTTTTGG-AAA-3′,5′-AGCTTTTCCAAAAAACAGGCCT-AAATACGCTGGATCTCTTGAATCCAGCGTA-TTTAGGCCTGCG-3′;shRNA-3:5′-GATCCG-TGATTCAGATGGAGTTAGATTCAAGAGAT-CTAACTCCATCTGAATCATTTTTTGGAAA-3′,5′-AGCTTTTCCAAAAAATGATTCAGATGG-AGTTAGATCTCTTGAATCTAACTCCATCTG-AATCACG-3′。無關(guān)序列及所有引物由上海之江生物公司設(shè)計合成。1.4dna質(zhì)粒的制備將1μLpsilencer質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH-5α宿主菌感受態(tài)細胞,挑2個克隆,37℃搖菌過夜。參照北京博大泰克生物技術(shù)有限公司3s柱式質(zhì)粒抽提試劑盒說明書抽提psilencer質(zhì)粒。將psilencer質(zhì)粒進行雙酶切,經(jīng)1.2%瓊脂糖電泳,切膠回收,回收操作參照博大泰克瓊脂糖DNA回收試劑盒說明書。shRNA合成序列的退火:合成序列用TEbuffer(pH=7.5)溶解,濃度為100μmol·L-1,分別取對應(yīng)上下游按1∶1混勻,使終濃度為50μmol·L-1。按下列參數(shù)退火:95℃、30s,72℃、2min,37℃、2min,25℃、2min,冰上保存。經(jīng)T4DNA連接酶連接的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH-5α宿主菌感受態(tài)細胞,挑克隆,37℃搖菌過夜。質(zhì)粒的抽提具體操作參照Qiagen公司Plasmidminikit試劑盒說明書。重組質(zhì)粒測序鑒定:采用通用引物M13F(5′-GTTTTCCCA-GTCACGAC-3′)進行序列測定與比對。1.53無血清rpmi172狀態(tài)良好的Hca-F細胞,用無血清RPMI1640培養(yǎng)基重懸細胞,鋪6孔板,106個/孔,每孔400μL細胞懸液。各取25μL質(zhì)粒(pSilencer-shRNA及pSilencer)加入275μL無血清RPMI1640培養(yǎng)基中,靜置5min。同時取10μLLipofectamine2000加入290μL無血清RPMI1640培養(yǎng)基中,靜置5min。將以上兩種液體輕輕混勻,室溫靜置20min,使脂質(zhì)體包裹質(zhì)粒。輕輕混勻轉(zhuǎn)染液體,慢慢滴入孔中,輕輕晃動6孔板后放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)6h。換完全培養(yǎng)基(即含10%FBS),繼續(xù)培養(yǎng)24h后,換含400mg·L-1G418的完全培養(yǎng)基篩選。15d左右大部分細胞死亡,將尚存活的細胞轉(zhuǎn)移至細胞瓶中用含400mg·L-1G418完全培養(yǎng)基培養(yǎng),傳代并凍存。1.6rt-pcr反應(yīng)分別對shRNA-1、shRNA-2、shRNA-3、無關(guān)序列以及未轉(zhuǎn)染5組細胞進行RNA提取、RT-PCR反應(yīng),RT-PCR產(chǎn)物進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳并拍照分析。采用凝膠圖像分析系統(tǒng)BioSenSC300進行光密度值分析,獲得JNKmRNA及GAPDH光密度值(A值),JNKmRNAA值/GAPDHA值表示JNKmRNA表達水平,比值越大,表達水平越高。1.7jken蛋白表達水平采用Westernblotting檢測上述各組細胞中JNK蛋白表達水平,在凝膠成像系統(tǒng)上進行掃描分析,獲得JNK蛋白A值和內(nèi)參β-actinA值,JNK蛋白A值/β-actinA值表示JNK蛋白表達水平,比值越大,表達水平越高。1.8細胞穿膜細胞數(shù)檢測于Transwell小室上室內(nèi)分別加入100μL重懸于0.1%BSA-無血清1640培養(yǎng)液的未轉(zhuǎn)染對照組、無關(guān)序列組及實驗組3組細胞(細胞濃度為2×105·mL-1),小室下室加500μL含10%FBS、10mg·L-1Fibronectin的RPMI-1640培養(yǎng)基,置37℃、5%CO2中培養(yǎng)24h。取出Transwell小室,用棉簽擦去上室面的細胞,然后用下室培養(yǎng)基吹打下室面數(shù)次,使下室面的細胞(若有)掉落入下室培養(yǎng)基中。每組細胞在鏡下計細胞數(shù),每組設(shè)3個復(fù)孔,取平均值。實驗重復(fù)3次。計算穿膜細胞數(shù)。侵襲實驗除了在Transwell上室膜內(nèi)側(cè)加入30μLMatrigel(原液1g·L-1,用無血清1640培養(yǎng)液按1∶2稀釋)外,其余步驟同上。1.9統(tǒng)計處理采用SPSS12.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析,穿膜細胞數(shù)用xˉ±sxˉ±s表示,組間比較采用t檢驗。2結(jié)果2.1質(zhì)粒的制備參照Plasmidminikit試劑盒說明書抽提得到psilencer-shRNA-1、psilencer-shRNA-2及psilencer-shRNA-3質(zhì)粒(圖1)。采用通用引物M13F,3個表達載體中所含3條shRNA序列被正確檢測出,靶序列與GenBank中序列一致。2.2j濱水處理對jk表達的影響在mRNA水平檢測3條shRNA對JNK基因表達的抑制作用,以GAPDH作為內(nèi)參,shRNA-1、shRNA-2、shRNA-3、無關(guān)序列以及未轉(zhuǎn)染組JNKmRNA表達水平分別為0.920、0.559、0.961、1.052及0.986,shRNA-2在轉(zhuǎn)染后抑制JNK表達的作用強于shRNA-1、shRNA-3、無關(guān)序列組及未轉(zhuǎn)染對照組(P<0.01),其他各組組間比較差異無顯著性(P>0.05),見圖2。2.3小鼠hca-2細胞jnn蛋白表達水平檢測shRNA-1、shRNA-2、shRNA-3、無關(guān)序列以和未轉(zhuǎn)染組JNK蛋白表達分別為0.5884、0.3056、0.5266、0.5516和0.5576,shRNA-2轉(zhuǎn)染組Hca-F細胞JNK蛋白表達明顯低于shRNA-1、shRNA-3、無關(guān)序列組和未轉(zhuǎn)染組(P<0.01),其他各組組間比較差異無顯著性(P>0.05),見圖3。2.4細胞粒徑和夯實率Hca-F-shRNA-2組與未轉(zhuǎn)染組、無關(guān)序列組比較,平均穿膜細胞數(shù)明顯減少(P<0.05),未轉(zhuǎn)染組與無關(guān)序列組比較差異無顯著性(P>0.05),表明細胞遷移能力和侵襲能力均明顯降低,見表1。3shrna表達載體JNK位于重要的細胞信號傳導(dǎo)通路黏著斑通路上,是一種能夠特異性磷酸化c-Jun的蛋白激酶,是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinasepathway,MAPK)家族的主要成員之一。有研究表明,JNK通路的激活與腫瘤的發(fā)生及進展密切相關(guān)。在肝癌研究方面,Suzuki等對注射錳及行肝切除術(shù)的大鼠研究表明,肝切除術(shù)及錳均可激活JNK而上調(diào)p53、P21和c-Jun的表達誘導(dǎo)肝細胞的凋亡,可能起著抑制肝癌發(fā)生的作用。但有研究認為,JNK的激活可促進細胞的增殖癌變,因而促進肝癌的發(fā)生。由此可見,有關(guān)JNK在肝癌中作用的研究結(jié)果存在較大分歧。在人類組織細胞中也有JNK同源基因,因此研究小鼠肝癌JNK與淋巴轉(zhuǎn)移的關(guān)系,對人類肝癌淋巴轉(zhuǎn)移具有重要意義。RNA干擾(RNAi)是指通過反義RNA與正鏈RNA形成雙鏈RNA從而特異性地抑制靶基因的現(xiàn)象,通過人為地引入與內(nèi)源靶基因相同序列的雙鏈RNA(dsRNA),誘導(dǎo)內(nèi)源靶基因的mRNA降解,達到阻止基因表達的目的。作為一種RNAi技術(shù),shRNA由RNA聚合酶Ⅲ啟動子表達的方式被廣泛用于穩(wěn)定沉默某種基因表達。pSilencerTM3.1-H1neo質(zhì)粒采用的H1啟動子屬于RNA聚合酶Ⅲ啟動子之一,能夠通過體內(nèi)轉(zhuǎn)錄的方式指導(dǎo)合成發(fā)夾狀雙鏈RNA分子,誘導(dǎo)基因特異性沉默。pSilencer3.1載體具有諸多優(yōu)點:具有抗新霉素的特性;包含一條特殊設(shè)計的GAPDHsiRNA插入序列可被用作陽性對照及一個環(huán)形的陰性對照載體,可以表達人、鼠、兔基因組的任何已知的限制性同源序列;1×DNA退火解決方案也方便處理DNA寡核苷酸用于與載體連接。因此,本研究選擇了pSilencerTM3.1-H1neo質(zhì)粒用于構(gòu)建shRNA的表達載體,結(jié)果表明獲得了較為滿意的效果。細胞遷移和侵襲實驗是在體外評價細胞遷移和侵襲能力的經(jīng)典實驗。本文作者應(yīng)用該實驗來評價JNK表達下調(diào)后對Hca-F細胞遷移和侵襲能力的影響。本實驗結(jié)果表明,在Hca-F中沉默JNK表達之后,其遷移和侵襲能力均顯著下降,提示JNK可以調(diào)節(jié)肝癌細胞的遷移和侵襲行為。有研究表明,JNK的活化是細胞遷移所必需的,并且影響細胞黏附:①位于JNK通路上游的、能夠激活JNK的信號分子,如MEK激酶1和MKK4對于細胞遷移是必需的;②應(yīng)用JNK的化學(xué)阻斷劑SP600125抑制JNK的表達后,可以致使多種細胞的遷移能力下降,其中包括魚的角膜細胞、大鼠膀胱腫瘤上皮細胞(NBT-Ⅱ)、人皮膚成纖維細胞、小鼠胚胎成纖維細胞以及主動脈血管平滑肌細胞等;③應(yīng)用基因敲除技術(shù)證實,JNK在劃痕修復(fù)實驗中