蛋白酪氨酸激酶的研究進(jìn)展

蛋白酪氨酸激酶的研究進(jìn)展

1syk的生物學(xué)特性1.1syk的結(jié)構(gòu)及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑蛋白質(zhì)酪氨酸激酶（ptk）是一套能夠誘導(dǎo)蛋白質(zhì)酪氨酸殘基磷酸的酶酸鹽，參與許多信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑，在控制細(xì)胞分化、復(fù)制和擴(kuò)散方面發(fā)揮重要作用。根據(jù)PTKs家族成員的細(xì)胞拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的不同,可將其分為受體型和非受體型。配體與PTKs受體的胞膜外區(qū)結(jié)合,激活其胞內(nèi)酪氨酸激酶區(qū)域,觸發(fā)特定的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。胞內(nèi)非受體型的PTKs作為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)成員,在配體結(jié)構(gòu)缺乏內(nèi)源性PTKs結(jié)構(gòu)的跨膜受體等許多方面發(fā)揮著重要作用。Syk是一種非受體酪氨酸激酶,其編碼基因?yàn)镾yk,位于人類染色體9q22,蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量為72×103,由629個(gè)氨基酸組成。采用RT-PCR技術(shù),從小鼠成熟的休眠期乳腺組織中分離的約200堿基的Syk基因片段,與大鼠的Syk基因有高度的同源性。用這一片段來篩選小鼠的cDNA文庫(kù),獲得了1個(gè)全長(zhǎng)為5350堿基的基因。SykcDNA有1個(gè)長(zhǎng)477堿基的5′端UTR,其后是一個(gè)編碼628個(gè)氨基酸蛋白的長(zhǎng)度為1884堿基的開放可讀框。該蛋白還有2個(gè)SH2結(jié)構(gòu)域、SH2(N)、SH2(C)和1個(gè)體現(xiàn)所有酪氨酸激酶的固有特性激酶區(qū)。該基因所表達(dá)的蛋白總體結(jié)構(gòu)特性與非受體PTKs中的Syk/ZAP70家庭成員相一致。小鼠和大鼠的Syk蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)有極高的同源性,其次是人類,最后是豬。激酶結(jié)構(gòu)域2個(gè)SH2結(jié)構(gòu)以及SH2(N)和SH2(C)之間的區(qū)域在種屬間非常保守,而N末端以及SH2(C)和激酶結(jié)構(gòu)域之間的序列中度保守。2個(gè)SH2結(jié)構(gòu)域僅有36%的同源性,這反映了在特異性結(jié)合磷酸化的酪氨酸方面可能存在的差異。Syk有Syk(L)和Syk(S)兩種表達(dá)形式。Syk(L)是Syk的全長(zhǎng)形式,Syk(S)比Syk(L)少23個(gè)氨基酸。Syk(L)在正常乳腺上皮和乳腺腫瘤中均表達(dá),而Syk(S)僅在乳腺腫瘤中表達(dá),不在正常的乳腺組織中表達(dá),提示Syk(S)與腫瘤的侵襲性相關(guān)。乳腺癌細(xì)胞重新表達(dá)Syk(L),可抑制其侵襲性,但重新表達(dá)Syk(S)不能抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲性,提示Syk(L)具有抑制腫瘤細(xì)胞侵襲性的功能。Syk是B細(xì)胞抗原受體(BCR)信號(hào)途徑的重要影響因子之一。BCR參與信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)是由3個(gè)非受體型酪氨酸激酶家族介導(dǎo):ZAP70家族(ZAP70,syk)、Src家族(Lyn、Fyn、Blk)和Tec家族(Btk、Ltk、Etk)。BCR激活后,依賴Syk的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)整B細(xì)胞克隆的表達(dá)、分化或凋亡。Syk是B細(xì)胞激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中最重要的激酶,該酶有2個(gè)SH2結(jié)構(gòu)域,因而成為免疫酪氨酸受體激活基序(ITAM)磷酸化招募的首選對(duì)象(圖1)。被招募的Syk立即成為Src作用的第2個(gè)靶目標(biāo),進(jìn)而啟動(dòng)B細(xì)胞活化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的3條主要途徑(磷脂酰肌醇途徑、MAP激酶相關(guān)途徑和磷酸肌醇3激酶途徑)。磷脂酶C(PLC)-γ2,磷脂酰肌醇3-激酶(PI3-K)是Syk酪氨酸磷酸化的關(guān)鍵底物。在B細(xì)胞內(nèi),Syk磷酸化PLC-γ2引起ERK和JNK激酶的級(jí)聯(lián)激活,而PI3-K被Syk磷酸化后介導(dǎo)Akt活化。Syk優(yōu)先磷酸化微管蛋白的α亞單位,該亞單位被認(rèn)為可以調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架微管蛋白使之作為組裝信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合體的支架。最終激活各自的轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核,與基因啟動(dòng)子區(qū)域中各種順式作用元件或DNA小盒結(jié)合,使相應(yīng)的基因發(fā)生轉(zhuǎn)錄激活和產(chǎn)物表達(dá)。1.2侵性乳腺癌syk表達(dá)缺失Syk在所有的造血細(xì)胞中表達(dá),在其他的非造血細(xì)胞中也可檢測(cè)到Syk的表達(dá),如在小鼠的許多器官如脾臟、心臟、乳腺、胸腺和許多淋巴細(xì)胞系中高表達(dá)。Takano等認(rèn)為,Syk基因是一種候選抑癌基因,其表達(dá)產(chǎn)物Syk的缺失會(huì)致免疫細(xì)胞發(fā)育,成熟障礙,重者會(huì)導(dǎo)致重癥聯(lián)合免疫缺陷病(severecombinedimmunodeficiency,SCID),由于機(jī)體免疫細(xì)胞的成熟障礙,機(jī)體的免疫監(jiān)測(cè)會(huì)下降,從而對(duì)突變和異常增生的細(xì)胞失去免疫力,導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。Coopman等研究發(fā)現(xiàn),Syk是促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞生長(zhǎng)的強(qiáng)力因子,在正常的乳腺腺體和上皮組織及非侵襲性乳腺癌細(xì)胞中很容易檢測(cè)到Syk的表達(dá)和而在侵襲性乳腺癌細(xì)胞中則表達(dá)降低或缺失。Syk蛋白在非侵襲性乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)可被催化激活,因?yàn)閺倪@些細(xì)胞中分離出來的Syk可在體外的酶試驗(yàn)中自磷酸化。正常乳腺組織和乳腺癌組織的原位雜交實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了Syk在正常乳腺上皮和正常乳腺上皮細(xì)胞株MCF10A中表達(dá),在原位癌中表達(dá)受抑制,而在侵襲性乳腺癌中表達(dá)缺失。Thompson等報(bào)道,人乳腺癌細(xì)胞株如MDA-MB-468、BT474、MCF7和SKBr3中Syk高表達(dá),而在Hs578T和MA-MB-436中低表達(dá),在BT549和MDA-MB-231、MDA-MB-435等細(xì)胞株中則檢測(cè)不到。只有在典型惡性表現(xiàn)(高轉(zhuǎn)移性和侵襲性)的乳腺細(xì)胞株中Syk表達(dá)缺乏。ZAP270酪氨酸激酶和Syk有高度的氨基酸序列同源性,但卻不能在乳腺癌細(xì)胞株中檢測(cè)到。這些結(jié)果表明,Syk表達(dá)的缺失可能與正常乳腺組織向惡性型發(fā)展有關(guān)。在胃癌和白血病等非上皮細(xì)胞腫瘤研究也發(fā)現(xiàn)Syk基因與腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移相關(guān)。宋玉琴等的研究證實(shí),Syk的缺失可能與胰腺癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移有關(guān)。2乳腺癌syk基因轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的基本生物學(xué)特征,同時(shí)也是臨床上絕大多數(shù)腫瘤患者的致死因素。研究表明,Syk在腫瘤(包括胰腺癌)的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和淋巴管生成中的作用開始受到人們的重視,但其信號(hào)傳導(dǎo)通路尚不清楚。Abtahian等報(bào)道,在胚胎時(shí)期Syk/slp-76信號(hào)途徑對(duì)淋巴管發(fā)育及淋巴管和血管系統(tǒng)的分離有重要作用,Syk/slp-76的缺陷導(dǎo)致血管擴(kuò)張、扭曲、數(shù)量增多及淋巴管表面標(biāo)志表達(dá)增加,并形成淋巴和血液的異常分流。Carter等認(rèn)為,Syk與HER-2/neu是一對(duì)功能相反的抑癌/癌基因,HER-2/neu的過度表達(dá)可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的收縮,從而使腫瘤細(xì)胞易于穿過血管屏障,易于發(fā)生轉(zhuǎn)移,而Syk可作為腫瘤的抑制劑,可以抑制HER-2/neu收縮血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用。Ji研究發(fā)現(xiàn),淋巴內(nèi)皮細(xì)胞在細(xì)胞外基質(zhì)中的生長(zhǎng)、遷移和形成管道均依靠Syk/SLP76、VEGF-C/D/VEGFR-3和Prox-1的相互作用。Sebzda等報(bào)道,循環(huán)內(nèi)皮前體細(xì)胞(CEPs)表達(dá)Syk,在攜帶淋巴標(biāo)記(LYVE、VEGFR3)的CEPs產(chǎn)生過程中需要Syk的參與。Mahabeleshwar等研究認(rèn)為,Syk通過抑制PI3-k的活性,從而抑制腫瘤細(xì)胞的分裂和核因子NF-κB調(diào)節(jié)的尿激酶型-纖溶酶激活物(u-PA)的激活分泌,而過去研究證實(shí)u-PA的激活分泌與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移相關(guān)。眾多研究證實(shí),乳腺癌、胃癌、結(jié)直腸癌和胰腺癌細(xì)胞中,有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤的SykmRNA的表達(dá)率和表達(dá)水平遠(yuǎn)低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組,這表明SykmRNA的表達(dá)缺失可能與這些腫瘤的淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)。Chakraborty等通過研究乳腺癌細(xì)胞系、移植瘤和人乳腺癌組織標(biāo)本發(fā)現(xiàn),乏氧/有氧可導(dǎo)致MCF-7細(xì)胞VEGF的表達(dá)顯著增加,MCF-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染wtSyk和mutSyk后再暴露于乏氧/有氧環(huán)境中,Westernblots檢測(cè)發(fā)現(xiàn),wtSyk而不是mutSyk可以逆轉(zhuǎn)VEGF的表達(dá),mutSyk可以使VEGF過表達(dá)。Syk激酶活性和完整的SykSH2位點(diǎn)對(duì)于抑制細(xì)胞的侵襲性生長(zhǎng)都是必需的,然而,Syk連接區(qū)的自磷酸化位點(diǎn)(Y348F)的突變并不影響Syk抑制侵襲性生長(zhǎng)的功能。許多證據(jù)都支持依賴Syk的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在乳腺癌變過程中的作用。1)將野生型的Syk轉(zhuǎn)染Syk陰性的乳腺癌細(xì)胞株中,可以明顯地抑制無胸腺小鼠的腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。相反,缺乏激酶的Syk在Syk陽性的乳腺癌細(xì)胞株中的過度表達(dá),可以顯著地提高癌癥的發(fā)生和生長(zhǎng)。通過導(dǎo)入Syk而抑制腫瘤生長(zhǎng),可造成明顯的異常有絲分裂和細(xì)胞因子的產(chǎn)生。2)定位于人類染色體9q22上的Syk的等位基因的缺失與早期乳腺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。3)在小鼠中敲除Syk的負(fù)調(diào)節(jié)因子c-Cbl會(huì)導(dǎo)致乳腺上皮的增生。近年來的研究認(rèn)為,Syk亦是胰腺癌的腫瘤抑制基因,其表達(dá)缺失與胰腺癌的發(fā)生轉(zhuǎn)移相關(guān),但其缺失的原因仍未清楚。Murphy等剔除小鼠的Syk基因?qū)е滦∈笠认俳M織的增生惡變。將野生型Syk基因?qū)隨yk缺失的胰腺癌細(xì)胞株,可明顯抑制胰腺癌細(xì)胞株在裸鼠的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。陳明霞等研究證實(shí),Syk基因啟動(dòng)子甲基化是導(dǎo)致基因失活的原因之一,Syk基因啟動(dòng)子甲基化與胰腺癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移相關(guān)。Wang等研究報(bào)道,Syk細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄過程是Syk抑制腫瘤功能的限速步驟,mutSyk激活了轉(zhuǎn)錄因子Sp1和Sp1介導(dǎo)的FRA1轉(zhuǎn)錄過程,進(jìn)而使相應(yīng)的基因發(fā)生轉(zhuǎn)錄激活和產(chǎn)物表達(dá)。Chakraborty等發(fā)現(xiàn),MCF-細(xì)胞中,Syk/Lck通過Sp1途徑引起VEGF的表達(dá)顯著增加。Sp1是序列特異性的DNA結(jié)合蛋白,可調(diào)控某些啟動(dòng)子中富含GC序列的細(xì)胞和病毒基因的轉(zhuǎn)錄過程。對(duì)許多可調(diào)控腫瘤細(xì)胞生存、生長(zhǎng)和血管生成的基因而言,Sp1是一個(gè)重要和必需的轉(zhuǎn)錄因子。Sp1的異常表達(dá)和活化,可通過促進(jìn)相關(guān)腫瘤生長(zhǎng)因子和血管生成基因表達(dá)等機(jī)制,營(yíng)造適宜腫瘤生長(zhǎng)的局部微環(huán)境,正向調(diào)節(jié)腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移潛能和血管生成?，F(xiàn)較為明確可受Sp1蛋白調(diào)節(jié)的基因有成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體1、類上皮生長(zhǎng)因子受體、類胰島素生長(zhǎng)因子受體1、類胰島素生長(zhǎng)因子