蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)服務(wù)(張立巖)

蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)服務(wù)

張立iozhangliyan@126.comMainContent蛋白質(zhì)組學(xué)研究蛋白質(zhì)N-末端測序質(zhì)譜分析1.20世紀(jì)中后期，生命科學(xué)研究進(jìn)入了分子生物學(xué)時代。2.隨著人類基因組全序列測定，生命科學(xué)跨入了后基因組時代。

mRNA的表達(dá)情況不能直接反應(yīng)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平蛋白質(zhì)動態(tài)修飾、加工、轉(zhuǎn)運定位、結(jié)構(gòu)形成、代謝等，均無法從基因組水平上的研究獲知蛋白質(zhì)構(gòu)象病更難于只靠DNA序列來解釋3.蛋白質(zhì)才能動態(tài)反映生物系統(tǒng)所處的狀態(tài)。

20世紀(jì)90年代中期，國際上萌發(fā)了蛋白質(zhì)組學(xué)。產(chǎn)生背景蛋白質(zhì)組學(xué)概念是一個基因組所表達(dá)的所有蛋白質(zhì)(動態(tài))基因組學(xué)(結(jié)構(gòu))蛋白質(zhì)組學(xué)(功能)澳大利亞Macquarie大學(xué)的Wasinger和Williams等于1995年在意大利的錫耶納(Siena)召開的雙向電泳會議上首次提出轉(zhuǎn)錄、表達(dá)、加工、修飾、運輸（時空）蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics):

整體性:分析細(xì)胞內(nèi)全部蛋白質(zhì)組成成份動態(tài)性:表達(dá)水平與修飾狀態(tài)

(不同細(xì)胞、組織、生理條件和發(fā)育階段)

系統(tǒng)性:蛋白質(zhì)之間的相互作用

揭示生物學(xué)行為(疾病過程和藥物效應(yīng))基因表達(dá)調(diào)控機制蛋白質(zhì)組學(xué)內(nèi)容表達(dá)研究:SAGE和基因芯片.拼接和修飾(mRNA)

功能研究

:1/3序列功能未知

修飾研究:磷酸化和糖基化等翻譯后修飾(信號誘導(dǎo))

定位和區(qū)域化:亞細(xì)胞定位提供蛋白調(diào)控新機制蛋白質(zhì)間相互作用:表達(dá)調(diào)控蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用領(lǐng)域1：蛋白質(zhì)分離和純化

1DESDS電泳(分子量)2DE

等電聚焦電泳(等電點)SDS電泳(分子量)

激光捕獲顯微切割（LMD）

技術(shù)平臺考馬斯亮蘭染色銀染熒光染色

從組織切片中將不同類型的細(xì)胞精確分離蛋白質(zhì)分離

1-DE:

分子量

2-DE:

等電點分子量等電點（pI)IPG膠條2DE分子量SDS－PAGE2DE質(zhì)譜技術(shù)(massspectrometry,MS)

MALDI-TOF-MS技術(shù)

ESI-MS技術(shù)

MS/MS技術(shù)技術(shù)平臺

N-末端測序

Edman降解法2:蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的鑒定3:數(shù)據(jù)庫分析鑒定蛋白質(zhì)技術(shù)路線蛋白質(zhì)N-末端測序PITC：異硫氰酸苯酯,偶聯(lián)劑PTC肽：苯氨基硫甲酰肽H＋：無水強酸TFA，三氟乙酸PTC氨基酸：2－苯胺基噻唑啉酮氨酸PTH氨基酸：乙內(nèi)?；搅螂灏彼釒讉€概念基本原理Edman化學(xué)降解法苯氨基硫甲酰（PTC）衍生物三甲胺水溶液Edman化學(xué)降解法三氟乙酸氨基酸殘基的噻唑啉酮苯胺衍生物Edman化學(xué)降解法HPLC分離鑒定穩(wěn)定的苯乙內(nèi)酰硫脲（PTH）衍生物標(biāo)準(zhǔn)PTH氨基酸蛋白質(zhì)N末端測序報告形式標(biāo)準(zhǔn)PTH氨基酸第一個氨基酸第二個氨基酸第三個氨基酸蛋白質(zhì)N末端測序報告形式Edman降解的最大優(yōu)越性是在水解除去末端標(biāo)記的氨基酸殘基時，不會破壞余下的多肽鏈應(yīng)用領(lǐng)域蛋白質(zhì)的鑒定(科研)基因工程多肽藥物申報(新藥開發(fā))ABI492cLC型蛋白測序儀反應(yīng)效率高:該儀器擁有專用于PVDF膜測序的特制反應(yīng)室，使其測序條件得到進(jìn)一步的優(yōu)化，可使反應(yīng)效率達(dá)到98％以上。靈敏度高:利用毛細(xì)管進(jìn)樣和細(xì)徑的HPLC柱對PTH氨基酸進(jìn)行分離，可測定濃度低至fmol的蛋白，實現(xiàn)“可見即可測”的夢想。準(zhǔn)確:因為可直接利用PVDF膜上的樣品進(jìn)行測序，相當(dāng)于獲得了PAGE純化的樣品，解決了雜質(zhì)對蛋白質(zhì)測序的干擾問題，可獲得準(zhǔn)確的肽段序列。ABI492cLC型蛋白測序儀優(yōu)勢:蛋白質(zhì)N末端測序劣處蛋白質(zhì)N端封閉

乙?；?甲?；蚪构劝滨；鶊F等氨基酸修飾質(zhì)譜分析質(zhì)譜分析原理通過電離源將蛋白質(zhì)分子轉(zhuǎn)化為氣相離子，然后利用質(zhì)譜分析儀的電場、磁場將具有特定質(zhì)量與電荷比值(Ｍ/Ｚ值)的蛋白質(zhì)離子分離開來，經(jīng)過離子檢測器收集分離的離子，確定離子的Ｍ/Ｚ值，分析鑒定未知蛋白質(zhì)。軟性離子化電噴霧離子化(ESI)

基質(zhì)輔助激光解吸離子化(MALDI)將分析物分散在基質(zhì)分子中并形成晶體，當(dāng)用激光照射晶體時，由于基質(zhì)分子經(jīng)輻射所吸收的能量，導(dǎo)致能量蓄積并迅速產(chǎn)熱，從而使基質(zhì)晶體升華，致使基質(zhì)和分析物膨脹并進(jìn)入氣相。MALDI所產(chǎn)生的質(zhì)譜圖多為單電荷離子，因而質(zhì)譜圖中的離子與多肽和蛋白質(zhì)的質(zhì)量有一一對應(yīng)關(guān)系。MALDI-TOF-MS工作原理機械構(gòu)造MALDI-TOF-MS工作原理LaserMatrix&sample+++++升華TOF(TimeofFlight):無電場飛行管的飛行時間DetectorIonSource20-25kV時間飛行質(zhì)譜檢測原理TOF(TimeofFlight):飛行時間.帶單電荷的不同大小分子量的多肽片段同時激發(fā)FlightTube:

無電場飛行管Detector多肽片段分離:小分子量多肽片段飛行速度高,飛行時間短大分子量多肽片段飛行速度慢,飛行時間長時間飛行質(zhì)譜檢測原理IonSou