第10章經(jīng)典液相色譜法

經(jīng)典

液相色譜§1

LSC

§2

LLC§3ICE§4SCE§5TLC§6PC第10章

經(jīng)典液相色譜法包括經(jīng)典柱色譜法和平面色譜法，是在常壓下靠重力或毛細(xì)作用輸送流動(dòng)相的色譜方法。經(jīng)典色譜法與現(xiàn)代色譜法的區(qū)別主要在于輸送流動(dòng)相方式、固定相種類和規(guī)格、分離效能、分析速度和檢測(cè)靈敏度等方面。經(jīng)典液相色譜法設(shè)備簡(jiǎn)單，操作方便，分析速度快。在藥物研究、食品化學(xué)、環(huán)境化學(xué)、臨床化學(xué)、法檢分析及化學(xué)化工等領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用。特別是在天然藥物成分的鑒別、分離等方面發(fā)揮著獨(dú)特的作用，是中藥鑒別的主要方法之一。

第1節(jié)液-固吸附柱色譜法（LSC）

經(jīng)典的液—固吸附色譜（liquidsolidadsorptionchromatography，LSC）是以吸附劑為固定相，有機(jī)溶劑為流動(dòng)相，利用不同組分在吸附劑上吸附性能的差異，進(jìn)行分離分析的方法。

用于分離分析極性至弱極性的化合物，不適用于分離分析強(qiáng)極性的物質(zhì)。一、基本原理1．吸附與吸附平衡吸附是指溶質(zhì)分子與吸附劑分子之間所存在的某些化學(xué)作用力而被吸附在吸附劑的表面。吸附過(guò)程則是試樣中溶質(zhì)分子（X）與流動(dòng)相分子（Y）爭(zhēng)奪吸附劑表面活性中心的過(guò)程，即為競(jìng)爭(zhēng)吸附過(guò)程（圖10-1）。圖10-1吸附色譜示意圖m.流動(dòng)相a.吸附劑Xm.流動(dòng)相中溶質(zhì)分子Ym.流動(dòng)相分子X(jué)a.被吸附的溶質(zhì)分子

吸附平衡常數(shù):由于流動(dòng)相分子是大量的,所以[Ym]/[Ya]可視為常數(shù)。

∴（10-2）

為吸附劑的表面積，為流動(dòng)相的體積，Cs為溶質(zhì)在固定相的濃度，Cm為溶質(zhì)在流動(dòng)相中的濃度。吸附平衡常數(shù)K是與組分的性質(zhì)、吸附劑和流動(dòng)相的性質(zhì)與溫度有關(guān)的一個(gè)常數(shù)。

K值小，說(shuō)明該物質(zhì)被固定相吸附得不牢固，易被流動(dòng)相分子解吸附，在固定相中滯留時(shí)間短，在柱中移動(dòng)速率快，先流出色譜柱；若K值大，說(shuō)明該物質(zhì)被吸附得牢固，在固定相中滯留時(shí)間長(zhǎng)，移動(dòng)速率慢，后流出色譜柱，2吸附等溫線

一定溫度與壓力下,某組分在吸附劑表面吸附平衡,該組分在兩相中的濃度相關(guān)曲線。（1）線性吸附等溫線吸附平衡常數(shù)K為一定值時(shí)，則吸附等溫線為線型。即達(dá)到平衡時(shí)，組分在固定相中的濃度Cs與其在流動(dòng)相中的濃度Cm

成正比(Cs=KCm)，直線的斜率為K。線型吸附等溫線是理想的等溫線，同一種溶質(zhì)的平衡常數(shù)K與溶液的濃度無(wú)關(guān)，即K為一常數(shù)。組分流出速度不受濃度的影響，故在洗脫或展開(kāi)時(shí)，同一溶質(zhì)分子在柱內(nèi)具有相同的遷移速率，能得到左右對(duì)稱的流出曲線。如圖10-2A所示。（2）凸形吸附等溫線在絕大多數(shù)情況下，吸附等溫線都有些彎曲而呈現(xiàn)凸形吸附等溫線。其中主要原因之一是固體吸附劑表面的不均一性。例如硅膠表面上有幾種吸附能力不同的吸附中心——強(qiáng)的、較強(qiáng)的、弱的、極弱的

同一溶質(zhì)分子總是先占據(jù)強(qiáng)的吸附中心，兩者之間作用力強(qiáng)，溶質(zhì)分子被吸附得牢，吸附平衡常數(shù)K值大，遷移速率慢；后占據(jù)弱的吸附中心，兩者之間作用力弱，吸附平衡常數(shù)K值小，遷移速率快，并依此類推。顯然，同一溶質(zhì)分子具有不同的吸附平衡常數(shù)K，即具有不同的遷移速率。在溶質(zhì)分子集中的區(qū)域，吸附劑的所有吸附中心達(dá)到吸附飽和，K值小，遷移速率快，先流出色譜柱；在溶質(zhì)分子稀少的區(qū)域，由于僅僅占據(jù)了強(qiáng)吸附中心，K值大，遷移速率慢，后流出色譜柱。從而導(dǎo)致流出曲線前沿陡峭，后沿拖尾，形成拖尾峰，且保留時(shí)間亦隨樣品量的增加而減小。如圖10-2B所示。（3）凹形：由于進(jìn)樣量較大，影響了固定相的物理性質(zhì)。隨溶質(zhì)量的增加,Cs/Cm增加，所以呈凹形。吸附等溫柱內(nèi)溶質(zhì)濃度分布柱內(nèi)溶質(zhì)濃度的分布曲線流出曲線保留時(shí)間與進(jìn)樣量的關(guān)系拖尾峰的出現(xiàn)對(duì)以下產(chǎn)生了不利的影響：①利用峰面積進(jìn)行定量時(shí)峰面積的積分精度和重現(xiàn)性。②利用峰高定量時(shí)檢測(cè)的靈敏度。③定性分析時(shí)保留值與物質(zhì)性質(zhì)的相關(guān)性。④組分之間相互分離的程度。因此應(yīng)盡量避免色譜峰的拖尾?？朔姆椒ㄊ牵簻p小進(jìn)樣量或樣品的濃度，即利用凸形吸附等溫線的直線部分，從而得到左右對(duì)稱的流出曲線。二、吸附劑對(duì)吸附劑的要求：(1)表面積大，具有一定的吸附能力。(2)不應(yīng)與流動(dòng)相發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。(3)粒度要細(xì)，一般要150目。1.吸附劑：常用的有：氧化鋁、聚酰胺、硅膠等。酸性pH=5～4

分離酸性物質(zhì).如氨基酸(1)中性pH=7.5氧化鋁

分離生物堿.如揮發(fā)油,甾體等堿性pH=9～10

分離堿性.如生物堿(2)硅膠:吸附能力稍弱于氧化鋁,用于分離弱酸與中性物(如有機(jī)酸、氨基酸、甾體等)。硅醇基是使硅膠有一定吸附能力的活性基團(tuán)。

三種存在形式:

吸附能力：Ⅲ>Ⅰ>Ⅱ活性大?。孩?gt;Ⅰ>Ⅱ(3)聚酰胺:由酰胺聚合而成的高分子物質(zhì)。

其吸附原理利用分子內(nèi)酰胺基和羰基。

酰胺基中的羰基與酚類、黃酮類、酚類中的羥基或羧基形成氫鍵；

酰胺基中的氨基與醌類、硝基類中的醌基、硝基形成氫鍵而產(chǎn)生吸附作用。不同的化合物，由于活性基團(tuán)的種類、數(shù)目與位置的不同，形成氫鍵的能力不同，而實(shí)現(xiàn)分離。對(duì)位間位取代基均能形成氫鍵的,吸附力增大。鄰位基團(tuán)間能形成分子內(nèi)氫鍵的,吸附力減小。芳香核具有較多共軛鍵時(shí),吸附力增大。（4）大孔吸附樹(shù)脂大孔吸附樹(shù)脂是一種不含交換基團(tuán)，具有大孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高分子吸附劑。粒度多為20-60目。理化性質(zhì)穩(wěn)定，不溶于酸、堿及有機(jī)溶劑。大孔樹(shù)脂可分為非極性和中等極性兩類，在水溶液中吸附力較強(qiáng)且有良好的吸附選擇性，而在有機(jī)溶劑中吸附能力較弱。大孔吸附樹(shù)脂主要用于水溶性化合物的分離純化，近年來(lái)多用于皂苷及其它苷類化合物與水溶性雜質(zhì)的分離。也可間接用于水溶液的濃縮，從水溶液中吸附有效成分。硅膠含水量（%）氧化鋁含水量（%）活度級(jí)別051525380361015ⅠⅡⅢⅣⅤ表10-1硅膠、氧化鋁的含水量與活度級(jí)別的關(guān)系2.吸附劑的活性：氧化鋁、硅膠的吸附力的大小,還與其含水量有較大的關(guān)系：注意:吸附劑的吸附活性(能力)與活度級(jí)別的相反關(guān)系活度級(jí)數(shù)含水量活性吸附能力小少大強(qiáng)大多小弱

所以，加熱除水，活性提高，吸附力加強(qiáng)。加一定水，活性下降，吸附力減弱。

活化：105～110℃加熱除水為活化。脫活：加一定水份，降低活性。三、色譜條件的選擇由于吸附劑的種類有限，因此，當(dāng)被分離物質(zhì)、吸附劑種類一定時(shí)，分離成敗的關(guān)鍵取決于流動(dòng)相的選擇

流動(dòng)相又稱洗脫劑、展開(kāi)劑或移動(dòng)相。要求:1.純度高2.穩(wěn)定(對(duì)樣品和吸附劑不反應(yīng))3.對(duì)樣品溶解度大4.粘度小(易洗脫)。1.被分離物質(zhì)的極性被分離物質(zhì)的極性越大,被吸附劑吸附得越牢!常見(jiàn)的化合物極性大小順序:

烷烴<烯烴<醚類<硝基化合物<二甲胺<脂類<酮類

<醛類<硫醇<胺類<酰胺<醇類<酚類<羧酸類被分離物質(zhì)的極性與結(jié)構(gòu)的關(guān)系(1)基本母核相同,基團(tuán)極性愈大,分子極性愈大?；灸负讼嗤?極性基團(tuán)數(shù)目愈多,分子極性愈大。

(2)分子雙鍵多,吸附力↑,共軛度↑,吸附性↑

。(3)空間排列,影響極性。

如：2.吸附劑的活性:

吸附劑的活性↑大，對(duì)被測(cè)組分的吸附能力↑強(qiáng)

被分離物質(zhì)的極性吸附劑活性大應(yīng)選→小防吸附太牢,難洗脫小應(yīng)選→大防tR太小,不易分離

3.流動(dòng)相:流動(dòng)相極性↑大，對(duì)被測(cè)組分的洗脫能力↑大常用流動(dòng)相極性強(qiáng)弱順序:石油醚<環(huán)己烷<四氯化碳<苯<甲苯幾<乙醚<氯仿<醋酸乙酯<正丁醇<丙醇<乙醇、甲醇<水

被分離物質(zhì)的極性吸附劑活性流動(dòng)相極性

大小大小大小

以上三方面只是一般性原則,至于使用哪種,要由實(shí)驗(yàn)來(lái)摸索。流動(dòng)相選擇靈活性很大,往往可用一元,配兩元或三元

。也可采用梯度洗脫等技術(shù)。圖10-3

化合物極性\吸附劑活度和洗脫劑極性間的關(guān)系四、操作方法

1．色譜柱的制備

內(nèi)徑與柱長(zhǎng)的比例，一般在1:10～20之間.

顆粒大小一般應(yīng)在100~200目

樣品重量:氧化鋁重量=1:20~50，對(duì)于難分離化合物，氧化鋁用量可增加至100~200倍；

硅膠作固定相其比例一般為1:30~60，如為難分離化合物，可高達(dá)1:500~1000。(1)玻璃柱干法裝柱濕法裝柱

（2）尼龍柱2．加樣與洗脫

加樣的方法有三種：①試樣配成濃溶液，用吸管輕輕沿管壁加入柱內(nèi)，然后加流動(dòng)相洗脫。②③用一塊比色譜柱內(nèi)徑略小的圓形濾紙吸附試樣溶液，待溶劑揮發(fā)后，加入柱內(nèi)，然后加流動(dòng)相洗脫。洗脫時(shí),應(yīng)連續(xù)不斷地加入洗脫劑，切勿斷流。

并調(diào)節(jié)一定的流速。3．檢出可以通過(guò)分段收集流出液，采用相應(yīng)的物理和化學(xué)方法進(jìn)行檢出。對(duì)有色混合物，很容易觀察化合物的分離情況，對(duì)無(wú)色物質(zhì)，可用紫外光觀察熒光色帶而檢出。也可用熒光吸附劑，通過(guò)熒光熄滅定位。

第2節(jié)液～液分配柱色譜法（LLC）1940年英國(guó)人Maritin(馬丁),Sngger(辛格)分配色譜獲諾貝爾獎(jiǎng)金。1952年兩人再度合作,發(fā)明氣相色譜。經(jīng)典的液—液分配色譜(liquidliquidpartitionchromatography，LLC)是將某種溶劑（固定液）涂布在多孔微粒的表面或紙纖維上，形成一層液膜，構(gòu)成固定相。多孔微?；蚣埨w維稱為支持劑(solidsupport)或載體(carrier)、擔(dān)體。一、基本原理:

有些強(qiáng)極性化合物,能被吸附劑強(qiáng)烈吸附,即使使用洗脫能力很強(qiáng)的流動(dòng)相也難推動(dòng),從而使吸附色譜無(wú)法分離。為克服之，發(fā)明了液—液色譜。利用混合物中各組分在兩相中溶解度不同而達(dá)到分離。

K=Cs/Cm二、載體載體(擔(dān)體):惰性物質(zhì),要有較大的表面積(起負(fù)載固定液的作用)。有硅膠、纖濰素、硅藻土等三、固定液及其選擇正相分配色譜，其固定相的極性大于流動(dòng)相，即以強(qiáng)極性溶劑作為固定液，以弱極性的有機(jī)溶劑作為流動(dòng)相；

反相分配色譜，其固定液具有較小的極性，而流動(dòng)相則極性較大。正相反相固定相極性大小流動(dòng)相極性小大適于分離的物質(zhì)極性物質(zhì)中等極性至非極性的物質(zhì)流出順序極性小的組分先流出柱極性大的組分先流出正相色譜與反相色譜的比較在正相分配色譜法中，固定液有水、各種緩沖溶液、稀硫酸、甲醇、甲酰胺或丙二醇等強(qiáng)極性溶劑，以及它們的混合液.在反相分配色譜中，常以硅油、液體石蠟等極性較小的有機(jī)溶劑作為固定液，而以水、水溶液或與水混溶的有機(jī)溶劑為流動(dòng)相。四、流動(dòng)相及其選擇一般正相色譜法常用的流動(dòng)相有石油醚、醇類、酮類、酯類、鹵代烷類、苯等或它們的混合物。

反相色譜法常用的流動(dòng)相則為正相色譜法中的固定液如水、各種水溶液(包括酸、堿、鹽及緩沖液)或低級(jí)醇類等。注意點(diǎn)：流動(dòng)相在使用之前，必須先用固定相飽和,以防固定相流失五、操作方法

1．固定液的涂布與裝柱裝柱前，首先將固定液與載體混合。如果用硅膠、纖維素等作載體時(shí)，可直接稱出一定量的載體，再加入一定比例的固定液，混勻后即可裝柱。

2．加樣和洗脫第3節(jié).離子交換色譜固定相:離子交換樹(shù)脂流動(dòng)相:水溶液或緩沖液分離機(jī)制:差速遷移分離對(duì)象:離子化合物(一)樹(shù)脂分類:具有網(wǎng)狀立體結(jié)構(gòu)的高分子聚合物。

聯(lián)上酸性基團(tuán)：陽(yáng)離子交換樹(shù)脂（-SO3H,-COOH等）聯(lián)上堿性基團(tuán)：陰離子交換樹(shù)脂（-NH2,-NHR等）陽(yáng)離子交換反應(yīng)：(樹(shù)脂可反復(fù)使用,用HCL浸泡,沖洗)陰離子交換反應(yīng)：

(陰離子樹(shù)脂的再生,用適當(dāng)?shù)膲A液浸泡)nRSO3H+Mn+交換洗脫(RSO3)nM+nH+用NaOH滴定H+，由耗V求X%(樹(shù)脂再生)N(CH3)3+OH

-R+Cl

-交換洗脫N(CH3)3+Cl

-R+OH

-用酸液滴定可求X%H+(二)樹(shù)脂的性能:

1.交聯(lián)度:交換樹(shù)脂中,交聯(lián)劑(二乙烯苯)的含量為交聯(lián)度,以重量百分比表示。

交聯(lián)度網(wǎng)眼交換體積大的離子大小慢不易進(jìn)入小大快大小離子均可進(jìn)入陽(yáng)離子交換樹(shù)脂一般交聯(lián)度8%(常用)陰離子交換樹(shù)脂一般交聯(lián)度4%2.交換容量:

每克樹(shù)脂能參加交換反應(yīng)的活性基團(tuán)數(shù)。單位:mmol/g;mmol/ml3.粒度:以溶漲態(tài)所能通過(guò)篩孔來(lái)表示。10～50目—交換水用;100～200目—分析用。(三)離子交換平衡常數(shù):

1.[A+]r、[B+]r分別表示樹(shù)脂中A、B離子的濃度;[A+]、[B+]分別表示水液中A、B離子的濃度;若

KB/A>1,說(shuō)明B+較牢地結(jié)合在樹(shù)脂上

KB/A<1,說(shuō)明A+較牢地結(jié)合在樹(shù)脂上所以KB/A說(shuō)明了樹(shù)脂對(duì)A+、

B+兩種離子選擇性交換的能力,故也稱之為選擇性系數(shù)。KB/A

↑,B與樹(shù)脂結(jié)合能力強(qiáng),洗脫慢,tR

↑。2.選擇性系數(shù)與分配系數(shù)的關(guān)系:

即:分配系數(shù)不同是離子交換分離的先決條件。

要求：固定相→離子交換樹(shù)脂流動(dòng)相→水為溶劑的緩沖溶液被分離組分→離子型的有機(jī)物或無(wú)機(jī)物分離機(jī)制見(jiàn)圖示分離機(jī)制：

依據(jù)被測(cè)組分與離子交換劑交換能力（親和力）不同而實(shí)現(xiàn)分離第4節(jié)空間排阻柱色譜法（SEC）

空間排阻色譜(stericexclusionchromatography，SEC)是20世紀(jì)60年代發(fā)展起來(lái)的一種色譜分離方法，又稱為：凝膠色譜法(gelchromatography)

分子排阻色譜法(molecularexclusionchromatography)分子篩色譜法(molecularsievechromatography)尺寸排阻色譜法(sizeexclusionchmmatography)。該色譜法根據(jù)流動(dòng)相的不同又可分為兩類：以有機(jī)溶劑為流動(dòng)相者，稱為凝膠滲透色譜法(gelpermeationchromatography，GPC)；以水溶液為流動(dòng)相者，稱為凝膠過(guò)濾色譜法(gelfiltrationchromatography，GFC)。主要用于大分子物質(zhì)如蛋白質(zhì)、多糖等的分離。一、基本原理

以凝膠（有機(jī)高分子的多孔聚合物）作為固定相，有機(jī)溶劑或水溶液作為流動(dòng)相，利用樣品中不同組分的分子尺寸的差異以實(shí)現(xiàn)混合物的分離。分離機(jī)制：利用被測(cè)組分分子大小不同、在固定相上選擇性滲透實(shí)現(xiàn)分離.要求：固定相→多孔性凝膠流動(dòng)相→水——凝膠過(guò)濾色譜流動(dòng)相→有機(jī)溶劑——凝膠滲透色譜分離機(jī)制見(jiàn)圖示滲透系數(shù)

注：Kp僅取決于待測(cè)分子尺寸和凝膠孔徑大小，與流動(dòng)相的性質(zhì)無(wú)關(guān)第5節(jié)薄層色譜法TLC

操作流程:鋪板—活化—點(diǎn)樣—飽和—展開(kāi)—顯色—定性,定量。

一.基本原理:

1.分離過(guò)程

將混合組分的試液,點(diǎn)在鋪了吸附劑的玻璃板一端,在密閉容器中用適當(dāng)?shù)娜軇?展開(kāi)劑、流動(dòng)相)展開(kāi),各組分不斷地被吸附,解吸附…隨展開(kāi)劑前移,利用吸附劑對(duì)不同組分的吸附力(吸附常數(shù))不同,產(chǎn)生差速遷移,而達(dá)到分離。特點(diǎn):快速、靈敏(幾～幾十微克)、高選擇、顯色方便。

RfA=a/cRfB=b/c2.比移值

比移值當(dāng)固定相、流動(dòng)相一定時(shí)，Rf與與組分性質(zhì)K的關(guān)系如下：色譜條件一定，Rf只與組分性質(zhì)有關(guān)，是薄層色譜基本定性參數(shù)，說(shuō)明組分的色譜保留行為Rf=0未移行(被固定完全吸附,K

)Rf=1移至前沿(組分不被固定相吸附,K

0)

一般:0＜Rf＜1

1）固定相、流動(dòng)相一定時(shí)，Rf值與物質(zhì)極性的關(guān)系是：物質(zhì)的極性↑大，K↑大，吸附得越牢，移動(dòng)距離越小，Rf↓小物質(zhì)的極性↓小，K↓小，吸附得越弱，移動(dòng)距離越大，Rf↑大

2）固定相、組分的極性一定時(shí)，Rf值與展開(kāi)劑極性的關(guān)系是：展開(kāi)劑極性↑大，Rf↑大（容易洗脫）展開(kāi)劑極性↓小，Rf↓?。ú蝗菀紫疵摚?/p>

3）展開(kāi)劑、組分的極性一定時(shí)，Rf值與固定相吸附力的關(guān)系是固定相吸附力↑大，Rf↑小固定相吸附力↓小，Rf↑大

Rf最佳范圍:0.3～0.5,也可控制在0.2～0.8范圍內(nèi)。

3．相對(duì)比移值某物質(zhì)，當(dāng)色譜條件一致時(shí)，Rf定值，定性用，但重現(xiàn)性差。有人建議用相對(duì)比移值定性。

參考斑點(diǎn)可以是另加的物質(zhì),亦可以樣品中另一組分為參考。4.分離度分離度（R）的計(jì)算公式為：d2為第2個(gè)色譜斑點(diǎn)的中心與原點(diǎn)的間距d1為第1個(gè)色譜斑點(diǎn)的中心與原點(diǎn)的間距W1及W2為相鄰兩斑點(diǎn)的直徑一般分離度應(yīng)大于1.0。123456溶劑前沿T=23℃RH=62%圖1延胡索薄層色譜鑒別（365nm紫外光燈檢視）1.婦科養(yǎng)坤丸(EEC002)2.婦科養(yǎng)坤丸(EEC001)3.婦科養(yǎng)坤丸(E05005)

4.延胡索對(duì)照藥材5.延胡索乙素對(duì)照品6.延胡索陰性對(duì)照?qǐng)D一：硅膠HPTLC分離金光菊屬植物（紫錐花類）根部提取物，從左到右分別為：海膽苷、咖啡酰酒石酸、紫錐菊、紫錐菊－蒲草（75％:25％）、紫錐菊－蒲草（50％:50％）、紫錐菊－蒲草（25％:75％）、蒲草、洋薊酸、菊聚酸。二.固定相

1.吸附柱色譜的固定相薄層色譜也可以使用,但薄層色譜所用的硅膠、Al2O3粒度比柱色譜更細(xì)。硅膠40

m(一般要求200目左右)

符號(hào):硅膠G硅膠+石膏硅膠H硅膠(未加任何物質(zhì))硅膠HF254

硅膠不含粘合劑+熒光物質(zhì)硅膠GF254

硅膠+石膏+熒光物質(zhì)

熒光劑：①M(fèi)n激活的ZnSiO4（F254），在紫外光（254nm）燈下呈淡綠色熒光②Ag激活ZnS、CuS（F365），呈綠色熒光三.展開(kāi)劑選擇:(同柱)僅操作方法不同。分離強(qiáng)極性物質(zhì),選擇強(qiáng)極性展開(kāi)劑,同時(shí)也應(yīng)考慮固定相的活性。

物質(zhì)極性吸附力流動(dòng)相極性防止大強(qiáng)大太牢,Rf太小小弱小Rf太大分離混合樣品時(shí),展開(kāi)劑選擇一般規(guī)則:(1)先用單一的中等極性展開(kāi)劑試一下。(2)改用二元展開(kāi)劑,其比例要摸索。目的:改變展開(kāi)劑的極性。圖10-6點(diǎn)滴試驗(yàn)法例:

A、B兩組分試樣AB展開(kāi)劑苯Rf0.450.42分不開(kāi)改為苯+乙醇Rf0.520.46可分開(kāi)能否說(shuō)出A、B哪一組分極性大？解：顯然B的極性大。因?yàn)檎归_(kāi)劑極性加大時(shí),極性大的組分Rf↑(相似相溶)。

此外，為提高分離度、防止斑點(diǎn)拖尾，通常：①分離酸性成分，使用酸性展開(kāi)劑。②分離堿性物質(zhì)，使用堿性展開(kāi)劑。四、操作方法

1.薄層（硬）板的制備

(1)載板的準(zhǔn)備多用玻璃板作為載板，也可用塑料膜和金屬鋁箔，要求表面光滑,平整清潔，以便吸附劑能均勻地涂鋪于上。常用規(guī)格有10cm×10cm、10cm×20cm、20cm×20cm等。(2)薄層(硬)板的鋪制

粘合劑煅石膏：吸附劑的9-15%左右羧甲基纖維素鈉CMC-Na：0.5-1%水溶液合成有機(jī)物：聚乙烯醇2.5%（有時(shí)對(duì)顯色劑無(wú)效）鋪板方法手工鋪板與機(jī)械鋪板各種吸附劑鋪板方法⑴硅膠G⑵硅膠H⑶氧化鋁G（含9%煅石膏）2.點(diǎn)樣點(diǎn)樣體積：一般在1～10

l,

點(diǎn)樣量太大,斑點(diǎn)易拖尾點(diǎn)樣方式：接觸式點(diǎn)樣與噴霧式點(diǎn)樣原點(diǎn)形狀：點(diǎn)狀、條狀點(diǎn)樣器具：微量進(jìn)樣器、定量毛細(xì)管；底距：1.5～2cm點(diǎn)距：0.8～1.5cm原點(diǎn)直徑

：

2～3mm。（邊點(diǎn)邊熱風(fēng)吹）接觸式點(diǎn)樣應(yīng)注意：

正確選擇溶解樣品的溶劑,防止點(diǎn)樣環(huán)形色譜效應(yīng)原點(diǎn)直徑一般以3mm為宜

防止點(diǎn)樣毛細(xì)管損傷薄層表面

盡量避免多次點(diǎn)樣

點(diǎn)樣環(huán)形色譜效應(yīng)：在點(diǎn)樣的同時(shí)，樣品在原點(diǎn)呈環(huán)狀展開(kāi)，如果樣品在溶劑中的溶解度很大，原點(diǎn)將變成空心環(huán)，稱為“點(diǎn)樣環(huán)形色譜效應(yīng)”?？朔椒?應(yīng)選擇樣品組分溶解度相對(duì)較小的溶劑以避免此現(xiàn)象的產(chǎn)生。噴霧式點(diǎn)樣點(diǎn)樣儀（Linomat5半自動(dòng)點(diǎn)樣儀）噴霧點(diǎn)樣的優(yōu)點(diǎn)：點(diǎn)樣過(guò)程中，點(diǎn)樣器不與薄層板接觸，可防止薄層板表面物理?yè)p傷。

能減少樣品橫向、縱向擴(kuò)散，樣品斑點(diǎn)窄，展開(kāi)后分離度提高。

自動(dòng)化程度高，樣品溶液不易在針壁上殘留，可提高點(diǎn)樣的準(zhǔn)確度與重現(xiàn)性。3.展開(kāi)

將點(diǎn)好樣的薄層板浸入展開(kāi)劑中，展開(kāi)劑借薄層板上固定相的毛細(xì)作用攜帶樣品組分在薄層板上遷移一定距離的過(guò)程稱為展開(kāi)，見(jiàn)圖10-9。（1）展開(kāi)裝置常用的展開(kāi)裝置有直立型的單槽色譜缸和雙槽色譜缸（常用其規(guī)格有10cm×10cm、10cm×20cm、20cm×20cm等）、圓形色譜缸、臥式色譜缸等。(2)展開(kāi)方式

一般展開(kāi)方式：上行、斜行與下行展開(kāi)距離：6～15cm注意點(diǎn)：①薄層板浸入展開(kāi)劑中的深度約0.5cm,不能浸住起始線,層析缸應(yīng)密閉。②先飽和15～30分鐘,再展開(kāi),防止邊緣效應(yīng)。

邊緣效應(yīng)是指同一物質(zhì)的色譜斑點(diǎn)在同一薄層板上出現(xiàn)的兩邊緣部分的Rf值大于中間部分的Rf值的現(xiàn)象。產(chǎn)生該現(xiàn)象的主要原因是由于色譜缸內(nèi)溶劑蒸氣未達(dá)飽和，造成展開(kāi)劑的蒸發(fā)速率在薄層板兩邊與中間部分不等。展開(kāi)劑中極性較弱和沸點(diǎn)較低的溶劑在邊緣揮發(fā)的快些，致使邊緣部分的展開(kāi)劑中極性溶劑比例增大，故Rf值相對(duì)變大。a）TLC第一次展開(kāi)、b）TLC第二次展開(kāi)、①單向多次展開(kāi)用同一種展開(kāi)劑，沿同一展開(kāi)方向展開(kāi)多次。通過(guò)增加展開(kāi)距離,達(dá)到更好的分離效果特殊展開(kāi)方式：不同展開(kāi)距離對(duì)結(jié)果的影響，硅膠HPTLC分離洋甘菊油，

a）3cm

b）5cm

c）7cm

d）9cm。abcd原點(diǎn)12雙向展開(kāi)③雙向展開(kāi)第一次展開(kāi)后，取出，揮去溶劑，將薄層板旋轉(zhuǎn)90o角后，再改用另一種展開(kāi)劑展開(kāi)。見(jiàn)圖10-11。②單向多級(jí)展開(kāi)用不同的展開(kāi)劑，沿同一展開(kāi)方向展開(kāi)多次。以達(dá)到更好的分離效果。

④離心展開(kāi)——薄層板以適當(dāng)轉(zhuǎn)速旋轉(zhuǎn)時(shí)，流動(dòng)相以適當(dāng)速率轉(zhuǎn)移到薄層上。該技術(shù)主要用于制備色譜。薄層色譜展開(kāi)時(shí)相對(duì)濕度的影響不同相對(duì)濕度色譜結(jié)果顯示，蒼術(shù)在較高濕度條件下分離效果較好。薄層色譜展開(kāi)時(shí)溫度的影響耐用性試驗(yàn)（Robustness）薄層色譜法變動(dòng)因素：不同廠牌的薄層板。不同點(diǎn)樣方式。展開(kāi)溫度及相對(duì)濕度的變化等。系指在測(cè)定條件有小的變動(dòng)時(shí)，測(cè)定結(jié)果不受影響的承受程度。目的為用于常規(guī)檢驗(yàn)提供依據(jù)。4.檢視

1、有色化合物——直接定位2、無(wú)色化合物有紫外吸收UV光斑點(diǎn)有熒光熒光板上有暗斑(顯色劑定位)噴霧或浸漬顯色蒸氣顯色：碘-生物堿、氨基酸衍生物、肽類、脂類及皂苷噴霧或浸漬后加熱顯色顯色劑：通用有碘、硫酸不僅有紫外吸收且能產(chǎn)生熒光只有紫外吸收不能產(chǎn)生熒光無(wú)紫外吸收(物理定位)五.定性

定性分析方法:將待定性組分與對(duì)照品點(diǎn)在同一薄層板上，比較組分與對(duì)照品色譜斑點(diǎn)顏色與Rf值的一致性。

對(duì)未知樣品,要幾個(gè)展開(kāi)體系均有一致Rf值,才可認(rèn)為同一物質(zhì)。

樣對(duì)123456溶劑前沿T=23℃RH=62%圖1延胡索薄層色譜鑒別（365nm紫外光燈檢視）1.婦科養(yǎng)坤丸(EEC002)2.婦科養(yǎng)坤丸(EEC001)3.婦科養(yǎng)坤丸(E05005)

4.延胡索對(duì)照藥材5.延胡索乙素對(duì)照品6.延胡索陰性對(duì)照點(diǎn)樣順序從左至右分別為連續(xù)三批供試品、對(duì)照藥材、對(duì)照品、陰性對(duì)照六、定量:

（一）

洗脫法:誤差

5%(基本符合微量分析誤差要求)。薄層分離——取下斑點(diǎn)——洗脫——離心——取上清液進(jìn)行測(cè)定（二）

薄層掃描法:誤差<5%(符合要求)。

薄層掃描法又稱原位定量薄層掃描法（insituquantitativethinlayerchromatography,QTLC）。本法是將一定波長(zhǎng)的單色光垂直照射展開(kāi)后的薄層板，測(cè)定薄層色譜斑點(diǎn)的吸收度隨展開(kāi)距離的變化，所得關(guān)系曲線下的面積與色譜斑點(diǎn)中待測(cè)物質(zhì)的濃度或量成正比，這種定量分析方法稱為薄層掃描法。1.基本原理Kubelka-Munk理論由于薄層板上的固定相，對(duì)光的散射現(xiàn)象，色譜斑點(diǎn)中待測(cè)物質(zhì)的吸收度與濃度的關(guān)系不符合比爾定律。Kubelka-Munk理論充分闡明了薄層色譜斑點(diǎn)中待測(cè)物質(zhì)的吸收度與濃度的定量關(guān)系。(克曼方程)設(shè)薄層板上固定相的厚度為X,入射光的強(qiáng)度為I0，當(dāng)透過(guò)厚度x的固定相后，照射在微分薄層厚度dx上的入射光強(qiáng)與反射光強(qiáng)分別為i和j時(shí)，見(jiàn)圖10-12。其入射光強(qiáng)的增量與反射光強(qiáng)的增量分別符合下面兩個(gè)微分方程（10-9）

（10-10）

式中S為薄層單位厚度的散射系數(shù)，K為薄層固定相單位厚度的吸光系數(shù).K值與薄層色譜斑點(diǎn)中待測(cè)物質(zhì)的濃度成正比。K雖稱為“吸光系數(shù)”，僅因“單位厚度”而得名。將式（10-9）與式（10-10）聯(lián)立求解，可得透過(guò)x薄層厚度固定相后的透過(guò)光強(qiáng)i及反射光強(qiáng)j與色譜斑點(diǎn)中物質(zhì)的濃度或量之間的關(guān)系（體現(xiàn)在參數(shù)a及b中的K）。

（10-11）

（10-12）式中，，

A和B均為常數(shù)。在薄層掃描時(shí)，我們通常只考慮薄層板的上表面（x=X）反射光的強(qiáng)度j及薄層板的下表面（x=0）透過(guò)光的強(qiáng)度i與色譜斑點(diǎn)中的待測(cè)物質(zhì)的濃度或量的關(guān)系。圖10-12散射性薄層截面示意圖I0—照射強(qiáng)度；

i(x)-x處的透射光強(qiáng)；j(x)-x處的反射光強(qiáng)；x—固定相層厚（1）薄層色譜斑點(diǎn)的反射率在薄層板的上表面，即

x=X處，I=I0，j=I0R。則

（10-13）式中SX為薄層板的散射參數(shù)，它與固定相的種類、粒度及涂布均勻程度有關(guān)，其值的大小直接影響到偏離比爾定律的程度。KX為吸收參數(shù)，相當(dāng)于薄層色譜斑點(diǎn)單位面積中待測(cè)物質(zhì)的量()。

當(dāng)SX一定時(shí)(如Merck廠生產(chǎn)的硅膠板SX=3，氧化鋁板SX=7)，R與色譜斑點(diǎn)中待測(cè)物質(zhì)的量（KX）符合上式。（2）薄層色譜斑點(diǎn)的透光率T

在薄層板的下表面，即x=0處，I=I0T，j=0。則

（10-14）

同理，當(dāng)SX一定時(shí)，T與色譜斑點(diǎn)中待測(cè)物質(zhì)的量（KX）符合上式。（3）薄層色譜斑點(diǎn)的吸光度A

理想的空白薄層板的單位薄層厚度的吸光系數(shù)K=0。事實(shí)上，一般空白板K≠0。為了消除此影響，通常在薄層掃描中都是以空白板為基準(zhǔn)，測(cè)定相對(duì)透光率及相對(duì)反射率來(lái)計(jì)算薄層色譜斑點(diǎn)的吸光度。在透射法中薄層色譜斑點(diǎn)的吸光度為

在反射法中薄層色譜斑點(diǎn)的吸