第五章-核酸分子雜交技術(shù)

核酸分子雜交（DNA/DNAorDNA/RNA）核酸分子雜交技術(shù)：

具一定同源性的兩條(DNA或RNA)單鏈在適宜的溫度及離子強(qiáng)度等條件下,可按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則特異性地復(fù)性，形成雙鏈。探針(已知核酸片斷，單鏈)待測核苷酸序列(單鏈)

核酸分子雜交技術(shù)，是在1968年由華盛頓卡內(nèi)基學(xué)院（CarnegieInstituteofWashington）的RoyBritten及其同事發(fā)明的。所依據(jù)的原理是，帶有互補(bǔ)的特定核苷酸序列的單鏈DNA或RNA，當(dāng)它們混合在一起時(shí)，其相應(yīng)的同源區(qū)段將會(huì)退火形成雙鏈的結(jié)構(gòu)。

核酸分子雜交的基本原理DNA變性方法熱變性：90~100℃酸堿變性：常采用堿變性化學(xué)試劑變性：尿素、甲酰胺、甲醛等特點(diǎn)：粘度增加、密度增加、增色效應(yīng)、溶解溫度(meltingtemperature,Tm)DNA復(fù)性或雜交(hybridization)DNA/DNA,DNA/RNA,RNA/RNA等影響雜交的因素核酸分子的濃度和長度濃度大，復(fù)性快；分子量大，復(fù)性慢溫度離子強(qiáng)度雜交液中的甲酰胺核酸分子的復(fù)雜性非特異性雜交反應(yīng)預(yù)雜交：封閉非特異性雜交位點(diǎn)，用鮭魚精子DNA分子雜交的基本方法Southern印跡法Northern印跡法Western印跡法原位雜交斑點(diǎn)印跡雜交液相雜交SouthernDNA印跡雜交SouthernDNA印跡雜交

使在電泳凝膠中分離的DNA片段轉(zhuǎn)移并結(jié)合在適當(dāng)?shù)臑V膜上，然后通過同標(biāo)記的單鏈DNA或RNA探針的雜交作用檢測這些被轉(zhuǎn)移的DNA片段，這種實(shí)驗(yàn)方法叫做DNA印跡雜交技術(shù)。由于它是由英國人EdwinMellorSouthern于1975年首先設(shè)計(jì)出來的，故又叫Southernblot。Southern雜交(Southernbloting)的主要步驟待測DNA樣品的制備、酶切待測DNA樣品的電泳分離：瓊脂糖凝膠電泳凝膠中DNA的變性：堿變性Southern轉(zhuǎn)膜：硝酸纖維素(NC)膜、尼龍膜毛細(xì)管虹吸印跡法、電轉(zhuǎn)印法、真空轉(zhuǎn)移法探針的制備Southern雜交雜交結(jié)果的檢測（a）（b）（c）（d）（e）基因組DNADNA限制片段硝酸纖維素濾膜同探針同源雜交的基因DNA片段X光底片DNA凝膠電泳SouthernDNA印跡雜交之X光顯像圖片水稻（OryzasativaL.)的葉綠體DNA分別用核酸內(nèi)切限制酶BglⅡ(A-C)、BamHⅠ（D-F）、EcoRⅠ（G-I）、和HindⅢ（J-L）消化，加樣在含有EtBr染料的1%的瓊脂糖凝膠電泳中作電泳分離，然后同32P標(biāo)記的玉米psbA探針作Southern雜交。X光底片中顯現(xiàn)的陽性條帶，表明含有水稻的psbA基因序列利用非放射性探針檢測核苷酸主要應(yīng)用1.遺傳病診斷2.DNA圖譜分析3.PCR產(chǎn)物分析NorthernblotNorthern雜交*1979年，J.C.Alwine等人發(fā)展而來，是將RNA分子從電泳凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或其他化學(xué)修飾的活性濾紙上，進(jìn)行核酸雜交的一種實(shí)驗(yàn)方法。也稱為Northern印跡（NorthernBlot），用以檢測某一特定的RNA（通常是mRNA）片段的存在及表達(dá)量。*因這種方法與Southernblot雜交技術(shù)十分類似，與DNA的雜交（Southern雜交）相對(duì)應(yīng)，被趣稱為Northern雜交。Northern印跡雜交1、基本原理和基本過程與Southernblot基本相同2、鑒別RNA3、探針可用DNA或RNA片段4、待測樣品為總RNA或mRNANorthern印跡與Southern印跡的不同點(diǎn)1、變性：RNA電泳前加熱變性、電泳時(shí)加變性劑保持RNA處于變性狀態(tài)，DNA電泳前和電泳中不變性與Southern印跡雜交不同之處：RNA電泳避免單鏈RNA自身形成高級(jí)結(jié)構(gòu)和自身降解

變性凝膠電泳(甲醛、尿素、甲酰胺等)RNase抑制環(huán)境2、轉(zhuǎn)膜：RNA轉(zhuǎn)膜前不需變性和中和處理,Southern印跡時(shí)，DNA轉(zhuǎn)膜前需進(jìn)行堿變性及中和處理3、靶核酸為RNAWestern雜交印跡法(Westernbloting)檢測蛋白質(zhì)，即將電泳分離的非標(biāo)記蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相載體上，用特異的抗血清對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定及定量的方法主要步驟：蛋白質(zhì)樣品的制備SDS-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳蛋白質(zhì)的電轉(zhuǎn)移：NC膜靶蛋白的免疫學(xué)檢測靶蛋白于第一抗體（一抗）反應(yīng)與標(biāo)記的第二抗體（酶標(biāo)二抗）反應(yīng)顯色反應(yīng)：酶促反應(yīng)InSituHybridization原位雜交原位雜交(insituhybridization)*細(xì)胞或染色體的原位雜交，用于基因定位。

*細(xì)菌菌落的原位雜交：篩選陽性克隆。將標(biāo)記的核酸探針與固定在細(xì)胞或組織中的核酸進(jìn)行雜交，稱原位雜交。根據(jù)檢測物分細(xì)胞內(nèi)原位雜交和組織切片內(nèi)原位雜交；根據(jù)探針與待檢核酸分：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA雜交。特點(diǎn)能在成分復(fù)雜的組織中進(jìn)行單一細(xì)胞的研究不需從組織或細(xì)胞中提取核酸，對(duì)含量極低的靶序列靈敏度高能準(zhǔn)確反映組織細(xì)胞的相互關(guān)系及功能狀態(tài)原位雜交1、定義：將標(biāo)記的核酸探針與固定在細(xì)胞或組織中的核酸進(jìn)行雜交，稱原位雜交。根據(jù)檢測物分細(xì)胞內(nèi)原位雜交和組織切片內(nèi)原位雜交；根據(jù)探針與待檢核酸分：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA雜交保持組織細(xì)胞的形態(tài)對(duì)核酸無抽提，修飾與降解作用不改變核酸在組織細(xì)胞內(nèi)的定位不阻礙核酸與探針的雜交過程對(duì)雜交信號(hào)無遮蔽作用理化性質(zhì)穩(wěn)定2、雜交過程：（1）組織或細(xì)胞的固定理想固定液應(yīng)具備：（2）組織細(xì)胞雜交前的預(yù)處理去垢劑（如Tritonx-100和SDS）和蛋白酶

K去除核酸表面的蛋白質(zhì)組織細(xì)胞內(nèi)的核酸與蛋白質(zhì)結(jié)合成核酸蛋白復(fù)合體控制消化時(shí)間，避免細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞和核酸從載玻片上脫落（3）探針的選擇與標(biāo)記以獲得最好雜交效果為依據(jù)選擇探針探針的長度一般為50~300bp,有時(shí)達(dá)1.5kb

放射性核素標(biāo)記探針敏感性高，操作簡便穩(wěn)定檢測結(jié)果分辨率高，但信號(hào)檢測時(shí)間長

非核素標(biāo)記探針安全、穩(wěn)定性好、顯色快，易于觀察（4）雜交雜交液體積?。?0~20μl

cDNA和RNA探針雜交溫度約為50℃

雜交時(shí)間:DNA探針雜交為2~4h.RNA探針雜交過夜

雜交前一般將組織切片置95℃5~15分鐘使DNA變性沖洗溫度一般不超過50℃（5）雜交結(jié)果檢測所用探針為核素標(biāo)記,放射自顯影檢測

所用探針為非核素標(biāo)記,比色或化學(xué)發(fā)光檢測斑點(diǎn)及狹縫印跡雜交1、斑點(diǎn)印跡為圓形2、狹縫印跡為線狀3、鑒別DNA、RNA4、簡單、快速，同一張膜可檢測多個(gè)樣品5、特異性不高、不能鑒別核酸分子量斑點(diǎn)印跡雜交(dotbloting)將RNA或DNA變性后直接點(diǎn)樣于NC膜或尼龍膜上優(yōu)點(diǎn)：簡單、快速、可同時(shí)檢測多個(gè)樣品液相雜交

指待測核酸和探針都存在于雜交液中，堿基互補(bǔ)的單鏈核酸分子在液體中配對(duì)形成雜交分子的過程。（一）RNA酶保護(hù)分析法1、RNA酶保護(hù)分析法原理RNaseA和RNaseT1專一水解雜交體系中的單鏈RNA，不水解探針RNA與待測RNA互補(bǔ)形成的雙鏈RNA，使雜交分子得到保護(hù)，稱RNA酶保護(hù)分析法。2、雜交過程

制備待測RNARNA探針的制備與標(biāo)記：體外轉(zhuǎn)錄法制備和標(biāo)記RNA探針雜交：待測RNA與RNA探針在液相中雜交

RNaseA和RNaseTI除去單鏈RNA

電泳分離RNA

放射自顯性檢測雜交結(jié)果（二）核酸酶S1保護(hù)分析法1、原理核酸酶S1在一定條件下專一水解雜交體系中的單鏈DNA和單鏈RNA，