第7章 RNA遺傳 - 副本

分子遺傳學(xué)

MolecularGenetics

第7章RNA遺傳

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)

醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室

李福才

2013.3

1第7章RNA遺傳

7.1RNA世界——生命早期的遺傳物質(zhì)

7.2RNA干涉/干擾現(xiàn)象

7.3RNAi對(duì)基因表達(dá)的作用

7.4RNA編輯RNA遺傳在中心法則中，RNA只是作為一個(gè)中間環(huán)節(jié)被描述，真正的遺傳模板是DNA。但是，20世紀(jì)70年代發(fā)現(xiàn)反轉(zhuǎn)錄酶以后，在Crick修正后的中心法則中，可以看到RNA已不是過去的中間環(huán)節(jié)，而是具有與DNA同等地位的遺傳模板。

然而，RNA編輯、RNA干擾的發(fā)現(xiàn)與研究，更使我們對(duì)RNA的遺傳作用刮目相看。

著名的分子生物學(xué)家Pennisi指出：“基因占據(jù)生物學(xué)的舞臺(tái)已經(jīng)數(shù)十年。但最近的工作提出，雖然基因經(jīng)常是掛牌的名角，可它們更像一些木偶。各種蛋白質(zhì)，有時(shí)是RNAs，在拉著線，告訴基因在何時(shí)何地打開或關(guān)閉”。7.1RNA世界——生命早期的遺傳物質(zhì)

RNA世界假說認(rèn)為，在生命進(jìn)化早期沒有蛋白酶，某些RNA序列可以催化RNA的復(fù)制。也就是說，RNA是生命早期的唯一遺傳物質(zhì)，它是生命的源頭。

在RNA遺傳的基礎(chǔ)上，才有了后來(lái)的DNA與蛋白質(zhì)體系。事實(shí)上，RNA的遺傳作用并未在生命的進(jìn)化中消失，在一定程度，RNA仍在支配著DNA與蛋白質(zhì)的命運(yùn)。

Johnston等的工作證明，某種RNA分子確實(shí)能夠催化RNA復(fù)制中的多聚化。

應(yīng)用NTP及RNA模板的編碼信息，使RNA引物持續(xù)增加14個(gè)核苷酸長(zhǎng)度，等于RNA螺旋一圈。這種多聚化是RNA模板依賴的，是按照引物的序列、長(zhǎng)度，以及RNA模板的信息進(jìn)行的。證明了引物的3′是在與RNA模板逐一地、嚴(yán)格地配對(duì)的情況下進(jìn)行的。結(jié)果，多聚化過程是逼真的；在引物被擴(kuò)展11個(gè)核苷酸的情況下，對(duì)此等序列進(jìn)行了克隆和序列分析，在1100個(gè)樣品中有1088個(gè)是與模板標(biāo)準(zhǔn)匹配的。如表7.1

Bartel等使用存在于隨機(jī)RNA序列的備用池中的RNA-連接酶ribozymes衍生物。某些衍生物能夠使用NTP及RNA模板的部分區(qū)域進(jìn)行模板指導(dǎo)的引物延伸。這些連接酶衍生物通過與模板的不配對(duì)的以特異小段的雜交來(lái)識(shí)別并催化該引物---模板復(fù)合體的RNA復(fù)制。從使用的模板的一小段來(lái)指導(dǎo)引物延伸來(lái)看，這些ribozymes不像復(fù)制RNA/DNA的酶的多聚化反應(yīng)，更類似于末端酶。從上述可知，W.K.Johnston等所描述的RNA復(fù)制雖然效率不高，卻是真正的RNA自我復(fù)制。因?yàn)樗幌馜NA復(fù)制那樣，需要許多蛋白酶來(lái)進(jìn)行加工。而這里的RNA復(fù)制，它不需要任何蛋白質(zhì)，完全由RNA酶(ribozymes)及RNA模板完成。

而通常的DNA/RNA病毒的復(fù)制以及細(xì)胞DNA復(fù)制都不是由純粹的DNA或RNA系統(tǒng)完成的。因此，RNA無(wú)疑地是一種復(fù)制模板。圖7.3RNA復(fù)制實(shí)驗(yàn)7.2RNA干涉/擾7.2.1RNAi的分子機(jī)制RNA對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控稱為RNA干擾（RNAinterference,RNAi）。

RNAi是一種轉(zhuǎn)錄后的基因沉默現(xiàn)象（post-transcriptionalgenesilencing,PTGS）,是dsRNA觸發(fā)細(xì)胞質(zhì)中與其同源的mRNA的降解，或在細(xì)胞核中dsRNA誘導(dǎo)同源的DNA的后生修飾（甲基化）而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄水平上的沉默。

RNA沉默是一種阻遏外來(lái)序列的有效手段，并在動(dòng)、植物發(fā)育中有重要作用。

1998年FireA.和MelloC.C在線蟲中發(fā)現(xiàn)RNAi現(xiàn)象。獲得2006年Nobel醫(yī)學(xué)和生理學(xué)獎(jiǎng)。RNAi作用機(jī)制：

在不同的生物中，不同來(lái)源的雙鏈RNA(dsRNA，約500bp)被DICER（含有螺旋酶，helicase，dsRNA結(jié)合域，及PAZ功能域）裂解為一種具特異序列的有活性中間體---21~23nt的雙鏈siRNA（smallinterferingRNAs或guideRNAs）。

然后，siRNA結(jié)合核酸酶復(fù)合物（RISC的蛋白質(zhì)部分）形成RNA誘導(dǎo)復(fù)合物（RNA-inducedsilencingcomplex,RISC）。激活的RISC依靠siRNA中的一條鏈（GuideStrand）去尋找互補(bǔ)的mRNA鏈，然后RISC中的核酸內(nèi)切酶（Augonate2,Ago2）在距離siRNA3＇端12bp的位置切割mRNA。

RNAi的分子遺傳機(jī)制

基因mut-7及rde-2如果發(fā)生突變則導(dǎo)致內(nèi)源轉(zhuǎn)座子在生殖細(xì)胞中動(dòng)員，稱之為増變現(xiàn)象。說明RNAi過程是造成轉(zhuǎn)位子抑制的原因。如果基因rde-1和rde-4發(fā)生突變，則對(duì)線蟲注射dsRNA后缺乏產(chǎn)生RNAi的響應(yīng)，在生殖細(xì)胞中也不能動(dòng)員轉(zhuǎn)位子。dsRNA被轉(zhuǎn)換為特異序列中間體（R）,然后引起同源的mRNA降解/沉默。rde-1及rde-4為從dsRNA產(chǎn)生R所需要，mut-7及rde-2則被需要來(lái)響應(yīng)R使靶mRNA沉默。7.2.2siRNA的產(chǎn)生與擴(kuò)增

在線蟲中，小量的dsRNA能夠作用于大量的靶mRNA。這是因?yàn)閐sRNA在轉(zhuǎn)變?yōu)閟iRNA的過程中，至少有三種擴(kuò)增途徑。

1）Dicer酶可以把長(zhǎng)的dsRNA截成10~20段，等于擴(kuò)增10~20倍。2）存在一種催化機(jī)制，siRNA常常成倍增加，以用于進(jìn)一步擴(kuò)增。3）短的RNAs能作為靶mRNA的引物，在RNA依賴的RNA多聚酶的作用下，啟動(dòng)一個(gè)RNA指導(dǎo)的RNA多聚化反應(yīng)，隨后產(chǎn)生許多“次級(jí)siRNAs，稱為靶指導(dǎo)的擴(kuò)增。（圖7.7）

首先dsRNA被切成短的siRNA,使dsRNA轉(zhuǎn)換成ssRNA。這些單鏈正常的siRNA如果沒有識(shí)別同源的靶mRAN，并與之配對(duì)，就會(huì)被降解。

一旦反義的siRNA與靶mRNA配對(duì)，則靶-指導(dǎo)的siRNA的擴(kuò)增就會(huì)發(fā)生。這時(shí)，與靶mRNA配對(duì)的siRNA小段將沿mRNA延伸，但只能延伸幾百個(gè)堿基左右就停止，并從該區(qū)裂解下來(lái)而成為次級(jí)siRNA。這種效應(yīng)稱之為“可遷移效應(yīng)”。

siRNA與靶mRNA的穩(wěn)定化與“可遷移效應(yīng)”的結(jié)合就形成了一個(gè)“連式反應(yīng)”，在這個(gè)反應(yīng)中，隨著Dicer的作用，primersiRNA的更新，以及新的一輪擴(kuò)增，將發(fā)生siRNA的多輪的復(fù)制。

應(yīng)該注意到，這種復(fù)制或擴(kuò)增并不是自我復(fù)制/擴(kuò)增，而是從primerA產(chǎn)生primerB,primerC,primerD,…這是從一個(gè)局部延伸為全體，再?gòu)娜w裂解為若干局部的過程。7.2.3RNAi的遺傳

它們是一些專與某一基因特異結(jié)合的片段，而且在它們應(yīng)該發(fā)揮作用的特異的時(shí)空中，含量相當(dāng)豐富，暗示著它們也許能夠復(fù)制。Grishok等在線蟲中的實(shí)驗(yàn)證明，RNAi性狀是后生的，可遺傳。它不需要通過基因序列的改變-----突變。線蟲（C.elegant）實(shí)驗(yàn)(圖10)：

1）注射dsRNA;

2）把蟲子泡在含有dsRNA溶液中；

3）或者喂以正在表達(dá)有義及反義RNA的微生物。將dsRNA注射到線蟲兩性體，在子一代（F1）產(chǎn)生的基因沉默（RNAi）往往在F2消失。但是，在母性生殖系中，由RNAi引起的基因抑制，可以偶爾地遺傳到F2及以后各代中（圖7.8）。

Grishok等證明，如果RNAi在母體啟動(dòng)，它可以通過F1的精子傳到F2，盡管該精子缺乏RNAi的靶基因。所以，RNAi一旦啟動(dòng)，即使在缺乏內(nèi)源靶基因的情況下,雄性生殖系細(xì)胞能夠傳遞RNAi。

因此，RNAi性狀是后生的，可遺傳的。它并不需要通過基因序列的改變----突變。7.3RNAi對(duì)基因表達(dá)的作用7.3.1RNAi是對(duì)基因組的基因表達(dá)的反饋RNAi的發(fā)現(xiàn)使我們對(duì)RNA調(diào)控基因認(rèn)識(shí)不斷深入。這種小的RNAs分子根據(jù)它們的來(lái)源不同被稱為siRNA（shortinterferingRNAs）miRNA(microRNAs)。它們借助于互補(bǔ)的mRNA的結(jié)合，觸發(fā)mRNA降解或阻止mRNA翻譯成蛋白質(zhì)。近年來(lái)研究表明，RNAi的途徑不僅限于作用于基因組或使mRNA沉默。

在裂殖酵母中，RNAi是裝配著絲點(diǎn)和使配對(duì)區(qū)異染色質(zhì)化所必需的。并發(fā)現(xiàn)常染色質(zhì)可因RNAi的作用而形成異染色質(zhì)。另外，他們還發(fā)現(xiàn)，在特異的沉默機(jī)制下，在有性周期中可使用分散的內(nèi)源DNA重復(fù)序列來(lái)抑制基因。（7.9）

現(xiàn)在已經(jīng)證明，RNA從基因組上轉(zhuǎn)錄下來(lái)后能夠反饋回去修飾基因組。這些修飾作用可以通過細(xì)胞分裂遺傳下去并影響發(fā)育過程。7.3.2RNAi引導(dǎo)的同源RNA降解在動(dòng)物、植物及真菌等各種生物中引起轉(zhuǎn)錄后基因沉默（PTGS）/RNAi的機(jī)制都是大同小異，高度保守的。說明它的古老起源。

基本機(jī)制是dsRNA被加工成更小的片段（siRNA），對(duì)同源mRNA進(jìn)行識(shí)別與裂解，以及誘導(dǎo)DNA的甲基化而導(dǎo)致PTGS/RNAi現(xiàn)象。dsRNA的產(chǎn)生有多種方式包括：

反向的DNA重復(fù)序列的轉(zhuǎn)錄；有義及反義RNA的同時(shí)合成；

病毒復(fù)制，細(xì)胞/病毒的RNA依賴的RNA多聚酶（cRdRP/vRdRP）對(duì)單鏈RNA模板的轉(zhuǎn)錄。（圖7.11）PTGS/RNAi產(chǎn)生的機(jī)制可分二步：第一步是dsRNA內(nèi)切酶的作用，把sRNA加工成21~25nt的有義和反義的RNA(siRNA)，這些siRNA首先在植物中發(fā)現(xiàn)。在果蠅中，它們是由一種稱為Dicer的RNaseⅢ所產(chǎn)生。Dicer已在線蟲、S.pombe及哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)，它含有螺旋酶（helicase）,dsRNA結(jié)合域，及PAZ結(jié)構(gòu)域。第二步因Dicer所產(chǎn)生的siRNA引導(dǎo)RISC裂解同源的單鏈mRNAs。RISC恰在反義siRNA與mRNA結(jié)合區(qū)域的中間切割mRNA,使mRNA進(jìn)一步降解。

雖然RISC的大多數(shù)蛋白成分還不清楚，但已知到它含有內(nèi)切酶、外切酶、螺旋酶及同源搜索活性。RISC的成分是PAZ/Piwi蛋白。通過PAZ域與Dicer作用把siRNA吸收到RISC中。評(píng)論：PTGS/RNAi現(xiàn)象的本質(zhì)是不能正確地表達(dá)基因產(chǎn)物對(duì)基因的反饋調(diào)控。既然該基因已不能表達(dá)信息，就應(yīng)該使其沉默。這種沉默不是DNA本身的突變，而是后生的基因沉默。這種后生的DNA甲基化是遺傳的。這是一種對(duì)基因表達(dá)環(huán)境的一種可遺傳的適應(yīng)。7.3.3RNAi引導(dǎo)的同源DNA修飾RNA引導(dǎo)的同源DNA序列的胞嘧啶的從頭甲基化是首次在類病毒感染轉(zhuǎn)基因植物中發(fā)現(xiàn)的。繼之，又在非病原的植物系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)。

RNA指導(dǎo)的DNA甲基化如同降解同源RNA一樣，需要把dsR