第10章核酸的生物合成

第十章核酸的生物合成基因(gene)：

為蛋白質或RNA編碼的DNA功能片段，是以堿基排列順序的方式儲存的遺傳信息?；蚪M（genome)：

某一物種擁有的全部遺傳物質，從分子意義上說，是指全部DNA序列。

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逆轉錄*中心法則(thecentraldogma)

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逆轉錄主要內(nèi)容●

DNA的生物合成——復制

●

RNA的生物合成——轉錄

●

蛋白質的生物合成——翻譯

●基因重組與基因工程第一節(jié)DNA的生物合成

DNABiosynthesis一、DNA的復制二、逆轉錄三、DNA的損傷和修復四、多聚酶鏈式反應（PCR）一、DNA的復制DNA分子是如何通過復制把遺傳信息高度保真性地（fidelity）傳遞給子代細胞的？一、DNA的復制概念：DNA在復制時，以親代DNA的每一股作模板，合成完全相同的兩個雙鏈子代DNA，每個子代DNA中都含有一股親代DNA鏈，這種現(xiàn)象稱為DNA的半保留復制(semi-conservativereplication)。（一）復制的基本規(guī)律1、半保留復制復制親代DNA子代DNADNA半保留復制示意圖Watson和Crick于1953年假定DNA的復制為半保留復制。

全保留式半保留式混合式DNA復制的三種可能方式1958年M.Meselson和F.M.Stall利用同位素15N標記大腸桿菌，首先證明了DNA半保留復制。15N-15N14N-14N15N-14N半保留復制的生物學意義按半保留復制方式，子代DNA與親代DNA的堿基序列一致，即子代保留了親代的全部遺傳信息，體現(xiàn)了遺傳的保守性。遺傳的保守性，是物種穩(wěn)定性的分子基礎，但不是絕對的。DNA在復制時，需在特定的位點起始，這是一些具有特定核苷酸排列順序的片段，即復制起始點(origin)

。在原核生物中，復制起始點通常為一個，而在真核生物中則為多個。2.有一定的復制起始點放射自顯影證實親代鏈解開后立即進行復制，沒有發(fā)現(xiàn)單鏈DNA。細菌和酵母菌中DNA復制起始點的堿基序列習慣上把兩個相鄰DNA復制起始點之間的距離（或DNA片段）定為一個復制子(replicon)。復制子是獨立完成復制的功能單位。DNA復制時，局部雙螺旋解開形成兩條單鏈，這種叉狀結構稱為復制叉。起點起點起點起點起點起點3、復制方式E.coil基因結構與復制起點oriterABCA.環(huán)狀雙鏈DNA及復制起始點B.復制中的兩個復制叉C.復制接近終止點(termination,ter)DNA的雙向復制示意圖DNA聚合酶只能以5'→3'方向聚合子代DNA鏈，即模板DNA鏈的方向必須是3'→5'。由于DNA分子中兩條鏈的走向相反，因此當分別以兩條親代DNA鏈作為模板聚合子代DNA鏈時，子代鏈的聚合方向也是不同的。4、半不連續(xù)復制3

5

3

5

3′5′3′5′解鏈方向領頭鏈(leadingstrand)隨從鏈(laggingstrand)DNA的半不連續(xù)復制3′5′半不連續(xù)復制動畫岡崎片段：

?1968年日本生化學者岡崎用電鏡及放射自顯影技術，觀察到DNA復制中出現(xiàn)一些不連續(xù)的片段，將這些不連續(xù)的片段稱為岡崎片段。

?原核生物:1000~2000個核苷酸

?真核生物:100~200個核苷酸以3’→5’方向的親代DNA鏈作模板的子代鏈在復制時基本上是連續(xù)進行的，其子代鏈的聚合方向為5’→3’，這一條鏈被稱為領頭鏈(leadingstrand)。以5’→3’方向的親代DNA鏈為模板的子代鏈在復制時則是不連續(xù)的，其鏈的聚合方向也是5’→3’，這條鏈被稱為隨從鏈(laggingstrand)。領頭鏈連續(xù)復制而隨從鏈不連續(xù)復制，就是復制的半不連續(xù)性。

（二）DNA復制的體系

底物:dNTP(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)

聚合酶:

依賴DNA的DNA聚合酶(DNA-pol)

模板:解開成單鏈的DNA母鏈

引物:提供3'-OH末端的寡核苷酸

其他酶和蛋白質因子:拓撲異構酶、解螺旋酶、單鏈DNA結合蛋白、引物酶、連接酶復制的化學反應

(dNMP)n

+dNTP→(dNMP)n+1

+PPi

聚合反應的特點以DNA單鏈為模板以dDNA為原料引物提供3′－OH聚合方向為5′→3′3′1、拓撲異構E（動畫）10

8局部解鏈后DNA復制過程中正超螺旋的形成解鏈過程中正超螺旋的形成解鏈過程中，DNA分子會過度擰緊、打結、纏繞、連環(huán)等現(xiàn)象。拓撲異構酶的作用特點既能水解、又能連接磷酸二酯鍵拓撲異構酶Ⅰ

拓撲異構酶Ⅱ分類拓撲異構E不需要能量或輔助因子如：ATP和NAD＋需要能量或輔助因子如：ATP和NAD＋拓撲異構酶Ⅰ的作用拓撲異構酶Ⅱ的作用通過催化DNA拓撲結構的變化，減少由于解鏈形成的張力解鏈雙螺旋存在張力DNA拓撲異構酶Ⅱ張力解除雙螺旋變成松弛狀態(tài)解螺旋酶(helicase)又稱解鏈酶或rep蛋白利用ATP供能，作用于氫鍵，使DNA雙鏈解開成為兩條單鏈。每解開一對堿基，需消耗2分子ATP。2.解旋酶3、單鏈DNA結合蛋白(SSB)3′5′5′5′3′SSB的作用①保護單鏈DNA免遭核酸的降解。防止單鏈再次形成雙鏈③降低DNA的Tm，促進DNA解鏈。SSB4、引發(fā)酶和引發(fā)體3'HO5'3

5

3

5

引物酶是一種依賴DNA的RNA聚合酶，該酶以DNA為模板，合成一段RNA引物，為DNA聚合酶提供自由的3′-OH，使子代DNA鏈能夠開始聚合。引物引物酶

DnaADNA拓撲異構酶

DnaBDnaCSSB

DnaA

DnaBDnaCDNA拓撲異構酶引物酶SSB3

5

3

5

含有解螺旋酶(DnaB蛋白)、DnaC蛋白、引物酶和DNA復制起始區(qū)域的復合結構稱為引發(fā)體。

引發(fā)體的組裝形成引物酶的作用：為DNA聚合酶提供自由的3′－OHRNA引物的大小，在原核生物中通常為50~100個核苷酸，而在真核生物中約為10個核苷酸。RNA引物的堿基順序，與其模板DNA的堿基順序相配對。5、DNA聚合酶全稱：依賴DNA的DNA聚合酶(DNA-dependentDNApolymerase,DDDP)簡稱：DNA-pol活性：1.5

3

的聚合酶活性

2.核酸外切酶活性大腸桿菌中至少有5種，分別命為DNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ。①DNA聚合酶I（單體酶：單肽鏈）主要功能：負責DNA的損傷修復及在DNA復制中切除引物，填補空隙的作用。若用枯草桿菌蛋白酶處理此酶，可得兩個片段。蛋白酶切口Klenow片段的分子結構大片段保留了兩種酶活性,即5'→3'聚合酶和3'→5'外切酶活性，通常被稱為Klenowfragment。5

→3

聚合酶活性5′AGCTTCAGGATA

3′

|||||||||||3′TCGAAGTCCTAGCGAC5′

3

5

外切酶活性

5

3

外切酶活性?能切除突變的DNA片段。能辨認錯配的堿基對，并將其水解。

DNA聚合酶的核酸外切酶活性3’→5’外切酶活力DNA聚合酶I小結②DNA聚合酶Ⅱ（單體酶）

主要功能參于DNA的損傷修復，具有5′→3′聚合活力，較弱，3′→5′外切活性。但無5′→3′外切活性。③DNA聚合酶Ⅲ（寡聚酶）

是催化大腸桿菌DNA復制的主酶，全酶有10種亞基，含Zn2+。大腸桿菌DNA聚合酶Ⅲ全酶的結構和功能

延長因子DNA聚合酶Ⅲ兩個亞基夾住DNADNA聚合酶Ⅲ異二聚體核心酶校對引物的結合和識別促使核心酶二聚化原核生物DNA聚合酶－真核DNA聚合酶聚合酶DNA連接酶(DNAligase)可催化兩段DNA片段之間磷酸二酯鍵的形成，從而把兩段相鄰的DNA鏈連接成一條完整的鏈。6、DNA連接酶功能連接復制過程形成的DNA片段,形成一個3′,5′-磷酸二酯鍵連接酶ATGCCGPPOHAPTATGCCGPAPTP連接酶DNA連接酶ATP（NAD+）ADP+Pi（NMN++AMP）HO5’3’5’3’3’5’5’3’DNA連接酶的連接作用連接酶連接切口Mg2+連接酶ATP或NAD＋AMP+PPi或NMN+AMPATCGPTTPPPAACCTGAPACPPPPOHTGGATCGPTTPPPAACCTGAPACPPPTGGP缺口3'3'5'5'5'5'3'3'模板鏈模板鏈DNA連接酶催化的條件是：①需一段DNA片段具有3'-OH，而另一段DNA片段具有5'-Pi基；②未封閉的缺口位于雙鏈DNA中，即其中有一條鏈是完整的；③需要消耗能量，在原核生物中由NAD+供能，在真核生物中由ATP供能。DNA連接酶在復制中起最后接合缺口的作用。在DNA修復、重組及剪接中也起縫合缺口作用。是基因工程的重要工具酶之一。DNA連接酶的作用DNA復制酶系總覽（三）原核生物DNA復制DNA+n1dATPn2dGTPn3dCTPn4dTTPDNA+(n1+n2+n3+n4)PPiＤＮＡ聚合酶Mg2+以四種dNTP為底物在DNA模板指令下，按堿基配對的原則，由DNA聚合酶催化，向DNA的3′－OH端添加核苷酸，以5′→3′的方向合成與模板互補的新鏈。1、復制的起始原核生物：特定位點開始，特定位點終止，只有一個復制子。（基因組能獨立進行復制的單位）。真核生物：多個位點起始，多復制子。大腸桿菌復制起始點：oriC（original）

終止點：ter（terminate）一些特殊的Pr可以識別并結合到復制起點，隨即使DNA雙螺旋局部解鏈，形成復制眼，在其兩端的DNA的兩股鏈呈丫字狀，稱為復制叉。分別向兩側進行復制，通常復制叉雙向等速前進，迅速生長的細菌，第一輪復制未完成就啟動第二次復制。DNA復制的起始階段，由下列兩步構成。

1．解旋解鏈，形成復制叉：由拓撲異構酶和解鏈酶作用，使DNA的超螺旋及雙螺旋結構解開，堿基間氫鍵斷裂，形成兩條單鏈DNA。單鏈DNA結合蛋白（SSB）四聚體結合在兩條單鏈DNA上，形成復制叉。2．引發(fā)體組裝和引物合成：由解螺旋酶(DnaB蛋白)、DnaC蛋白、引物酶(DnaG蛋白)和DNA復制起始區(qū)域形成引發(fā)體；在引物酶的催化下，以DNA為模板，合成一段短的RNA片段，從而獲得3'端自由羥基（3'-OH）。

5'

3'5'dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH3'3'DNA-polDNA復制的延長過程2、DNA鏈的合成與延伸領頭鏈的合成過程隨從鏈的合成過程DNA聚合酶ⅢRNA引物領頭鏈的合成是連續(xù)的，而隨從鏈的合成是不連續(xù)的，為什么？復制過程簡圖解螺旋酶3′5′5′3′3′5′DNA拓撲異構酶ⅡDNA聚合酶Ⅲ引發(fā)體連接酶DNA復制系統(tǒng)SSPDNA聚合酶I原核生物基因是環(huán)狀DNA，雙向復制的復制片段在復制的終止點(ter)處匯合。

E.colioriter8232

ori

terSV405003、復制的終止

在復制過程中形成的RNA引物，需由RNA酶來水解去除；RNA引物水解后遺留的缺口，由DNA聚合酶Ⅰ（原核生物）或DNA聚合酶

（真核生物）催化延長缺口處的DNA，直到剩下最后一個磷酸酯鍵的缺口。（1）去除引物，填補缺口：在DNA連接酶的催化下，生成最后一個磷酸酯鍵，將岡崎片段連接起來，形成完整的DNA長鏈。（2）連接岡崎片段5

5

5

RNA酶OHP5

DNA-polⅠdNTP5

5

PATP

ADP+Pi5

5

DNA連接酶隨從鏈上不連續(xù)性片段的連接拓撲異構酶Ⅱ拓撲異構酶Ⅱ將兩個子代DNA環(huán)分離為了保證遺傳的穩(wěn)定，DNA的復制必須具有高保真性。DNA復制時的保真性主要與下列因素有關：

1．遵守嚴格的堿基配對規(guī)律；

2．DNA聚合酶在復制時對堿基的正確選擇；

3．對復制過程中出現(xiàn)的錯誤及時進行校正。DNA復制的保真性(fidelity)：DNA-pol的核酸外切酶活性和及時校讀A：DNA-pol的外切酶活性切除錯配堿基；并用其聚合酶活性摻入正確配對的底物。B：堿基配對正確，DNA-pol不表現(xiàn)外切酶活性。（四）真核生物DNA復制真核細胞染色體DNA分子為線性的。比原核細胞DNA分子大，復制更為復雜。為多復制子復制（多起點雙向復制），在全部染色體復制完成前，各復制子不能再開始新一輪復制。真核生物DNA復制起始復合物的組裝和激活分屬于不同的細胞周期。端粒（telomere）是指真核生物染色體線性DNA分子末端的結構部分，通常膨大成粒狀。真核生物端粒的形成：在DNA復制的同時另外還要組裝成核小體。功能?維持染色體的穩(wěn)定性?保證DNA復制的完整性端粒的結構特點?由末端單鏈DNA序列和蛋白質構成。?末端DNA序列是多次重復的富含G、T堿基的短序列。TTTTGGGGTTTTGGGG…線性DNA在復制完成后，其末端由于引物RNA的水解而可能出現(xiàn)縮短。故需要在端粒酶（telomerase）的催化下，進行延長反應。5

3

3

55

3

3

5端粒酶(telomera