第四章 反向遺傳學(xué)及其相關(guān)技術(shù)_第1頁(yè)
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第四章反向遺傳學(xué)及其相關(guān)技術(shù)一、概述(一)遺傳研究的二條途徑1、表→里:正向遺傳學(xué)研究雜交或誘變→表型觀察→遺傳規(guī)律→確定存在的基因及數(shù)目→基因的功能及作用性質(zhì)。這一途徑是從生物體的性狀、表型變化來(lái)研究遺傳物質(zhì)的組成、分布與傳遞規(guī)律,屬于正向遺傳學(xué)采用的研究方法。2、里→表:反向遺傳學(xué)研究在已知DNA序列的基礎(chǔ)上,通過(guò)DNA重組、定點(diǎn)突變、插入/缺失等遺傳修飾手段創(chuàng)造突變體并研究突變所造成的表型效應(yīng),從而研究基因的生物學(xué)功能,闡明生命的本質(zhì)現(xiàn)象與規(guī)律。與反向遺傳學(xué)相關(guān)的遺傳操作技術(shù)為反向遺傳學(xué)技術(shù)。(二)RNA病毒的反向遺傳學(xué)采用病毒的遺傳材料,在培養(yǎng)細(xì)胞或易感宿主中重新拯救出活病毒或類似病毒物質(zhì)。

能夠拯救病毒的遺傳材料稱為感染性克隆,一般是在細(xì)菌質(zhì)粒中含有整個(gè)病毒基因組的cDNA拷貝,使得cDNA本身或從cDNA體外轉(zhuǎn)錄所得的RNA具有感染性。RNA病毒的反向遺傳系統(tǒng)通過(guò)定向修飾病毒的基因組序列,檢測(cè)被拯救的人工改造病毒的表型,可以在體內(nèi)(invivo)有效地研究病毒基因結(jié)構(gòu)、功能和病毒-宿主相互作用。

RNA病毒的反向遺傳操作

RT-PCR構(gòu)建RNA病毒的全長(zhǎng)cDNA,并進(jìn)行遺傳修飾↓與RNA聚合酶啟動(dòng)子結(jié)合體外轉(zhuǎn)錄病毒RNA↓

轉(zhuǎn)錄物RNA感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞↓拯救到活病毒↓拯救病毒的表型變化

↓病毒基因組的表達(dá)、調(diào)控、致病機(jī)理、病毒與宿主細(xì)胞互作、疫苗制造等單正股RNA病毒:RNA聚合酶+mRNA–

++–+中間型

結(jié)構(gòu)蛋白+子代正股RNA單負(fù)股RNA病毒:RNA聚合酶–

+結(jié)構(gòu)蛋白–子代負(fù)股RNA逆轉(zhuǎn)錄病毒:++RNARNA/DNA中間體逆轉(zhuǎn)錄酶DNA/DNA宿主++子代RNA正股RNA與負(fù)股RNA病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒?(三)真核生物的反向遺傳學(xué)采用反向遺傳學(xué)鑒定基因功能是真核生物功能基因組學(xué)的主要內(nèi)容。研究手段包括基因的互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)、超表達(dá)、反義抑制、基因敲除/基因打靶、基因陷阱、基因激活等手段。利用基因敲除或基因沉默而產(chǎn)生的功能變化研究基因功能是主要的反向遺傳學(xué)技術(shù)。二、反向遺傳學(xué)相關(guān)技術(shù)1、基因的同源重組2、基因的位點(diǎn)突變3、基因沉默基因敲除利用DNA轉(zhuǎn)化技術(shù),將含有目的基因和靶基因同源片段的重組載體導(dǎo)入靶細(xì)胞,通過(guò)載體與靶細(xì)胞染色體上同源序列間的重組,將外源基因整合入內(nèi)源基因組內(nèi),使外源基因得以表達(dá)。通過(guò)研究靶細(xì)胞或者個(gè)體在目的基因插入前后遺傳特性的改變,達(dá)到研究基因功能的目的。1、基因的同源重組完全敲除:通過(guò)同源重組直接將靶基因在細(xì)胞或者動(dòng)物個(gè)體中的活性完全消除。條件敲除:將某個(gè)基因的修飾限制于特定類型的細(xì)胞或個(gè)體發(fā)育特定的階段。完全敲除→條件敲除→特定組織/時(shí)間基因敲除基因敲除1)通過(guò)同源重組的基因敲除步驟構(gòu)建重組載體↓重組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞核內(nèi)↓篩選目的細(xì)胞↓轉(zhuǎn)基因生物重組載體的類型:a)替換性載體系統(tǒng):包括同源序列片段、替換基因的啟動(dòng)子、報(bào)道基因等成分。b)插入性載體系統(tǒng):插入基因片段(目的基因)、同源序列片段、標(biāo)志基因片段。用替換型(a)或插入型(b)載體進(jìn)行完全基因敲除實(shí)驗(yàn)2)Res同源重組系統(tǒng)——源于λ噬菌體Res重組酶的重組系統(tǒng)Ha和Hb:同源重組區(qū)域Pa和Pb:引物位點(diǎn)sm:篩選標(biāo)記

Red同源重組技術(shù)用于基因打靶3)Cre-LoxP同源重組系統(tǒng)——源自P1噬菌體的重組系統(tǒng)屬于傳統(tǒng)的同源重組載體,但具有時(shí)空調(diào)控的功能。該系統(tǒng)由P1噬菌體的Cre重組酶和LoxP位點(diǎn)兩部分組成。Cre重組酶:由Cre基因編碼,識(shí)別LoxP位點(diǎn),介導(dǎo)兩個(gè)LoxP位點(diǎn)(序列)之間的特異性重組,使LoxP位點(diǎn)間的基因序列被刪除或重組。LoxP位點(diǎn):由2個(gè)13bp的反向重復(fù)序列和1個(gè)8bp的間隔區(qū)域構(gòu)成。Cre酶Cre酶

Cre酶Cre重組酶13bp的反向重復(fù)序列

Cre-LoxP重組系統(tǒng)的特點(diǎn)CreCre

Cre

重組酶所催化的是一個(gè)可逆的重組事件

Cre催化重組不需要任何輔助因子的參與介導(dǎo)兩個(gè)同向LoxP位點(diǎn)之間序列的插入/缺失(下左)介導(dǎo)兩個(gè)反向LoxP位點(diǎn)之間序列顛倒(下右)介導(dǎo)兩條含LoxP位點(diǎn)DNA鏈的交換或染色體易位。

Cre-Loxpgeneknock-outsystem4)高等動(dòng)物基因敲除技術(shù)真核生物基因敲除的技術(shù)路線主要包括構(gòu)建重組基因載體,用電穿孔、顯微注射等方法把重組DNA導(dǎo)入胚胎干細(xì)胞純系中,使外源DNA與胚胎干細(xì)胞基因組中相應(yīng)部分發(fā)生同源重組,將重組載體中的DNA序列整合到內(nèi)源基因組中并得以表達(dá)。顯微注射命中率較高,技術(shù)難度相對(duì)大些。電穿孔法命中率比顯微注射低,操作使用方便。胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)分離和體外培養(yǎng)的成功奠定了哺乳動(dòng)物基因敲除的技術(shù)基礎(chǔ)。模式動(dòng)物小鼠中完全基因敲除的步聚近交系,白色,易產(chǎn)生免疫缺陷

2、基因的位點(diǎn)突變1)點(diǎn)突變—TILLING技術(shù)TILLING(targetinginducedlocallesionsingenomes)—定向誘導(dǎo)基因組局部突變,是一種快速有效地從由化學(xué)誘變劑(EMS)誘變過(guò)的突變?nèi)后w中鑒定出點(diǎn)突變的方法。

先用化學(xué)誘變劑(甲基磺酸乙酯,EMS)誘發(fā)產(chǎn)生一系列的點(diǎn)突變,再用設(shè)計(jì)的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,然后將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物變性和退火形成異源雙鏈核酸分子,再用特異切割錯(cuò)配的內(nèi)切酶CELl酶切,最后變性處理后采用雙色聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳檢測(cè)分析。(建池)TILLING特點(diǎn):TILLING技術(shù)屬于高頻率點(diǎn)突變和PCR篩選相結(jié)合的技術(shù),可發(fā)現(xiàn)基因的錯(cuò)義突變、基因截短型損傷等突變類型??色@得大量的等位基因系列,對(duì)長(zhǎng)度很小基因,復(fù)等位基因等具有獨(dú)特的技術(shù)優(yōu)勢(shì)??烧T導(dǎo)產(chǎn)生高頻率的點(diǎn)突變,篩選目的基因需要較小的突變?nèi)后w。不依賴于農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化或內(nèi)源標(biāo)簽系統(tǒng),無(wú)需耗時(shí)的轉(zhuǎn)基因和復(fù)雜的組織培養(yǎng)。需要知道所研究基因的序列。2)隨機(jī)插入突變T-DNA插入突變

以農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化為基礎(chǔ)的一種插入突變研究方法,根據(jù)插入位點(diǎn)的基因序列與植物表型變異等的相互關(guān)系可以從基因組中分離出相應(yīng)的基因并鑒定其功能。構(gòu)建T-DNA載體→轉(zhuǎn)化→突變體的篩選及遺傳分析→分離T-DNA插入位點(diǎn)的側(cè)翼序列→基因的定位、結(jié)構(gòu)與功能分析。T-DNA法敲除植物基因及突變體篩選:a.引物設(shè)計(jì)。LP和RP分別代表插入基因兩端的引物,LB是指載體上的一段引物。旁鄰序列是經(jīng)測(cè)序后獲得的DNA序列。b.PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果。分別代表野生型、雜合子和純合子PCR條帶。T-DNA插入特點(diǎn):不能控制其在生物體基因組中的插入位點(diǎn)。在植物中用T-DNA插入來(lái)敲除一個(gè)特定基因仍需要運(yùn)氣。隱性突變與顯性突變:隱性——表型的變化只能在轉(zhuǎn)化體的部分后代中體現(xiàn)出來(lái)(基因敲除);顯性——可以在轉(zhuǎn)化體中直接觀察到(基因激活)。某些特定基因,由于其特性在基因敲除后并不體現(xiàn)出功能的喪失。原因:重要的功能基因突變致死和冗余基因。染色體重排:突變體表型與T-DNA插入無(wú)關(guān)。效率不高,工作量大。建立飽和的突變體庫(kù)。轉(zhuǎn)座子插入突變利用某些能隨機(jī)插入基因序列的轉(zhuǎn)座子,在目標(biāo)細(xì)胞基因組中進(jìn)行隨機(jī)插入突變,建立一個(gè)攜帶隨機(jī)插入突變的細(xì)胞庫(kù),然后通過(guò)相應(yīng)的標(biāo)記進(jìn)行篩選獲得相應(yīng)的基因敲除細(xì)胞。由轉(zhuǎn)座子引起的突變可以轉(zhuǎn)座子DNA為探針,從突變體的基因組DNA文庫(kù)中篩選到突變的基因,再利用這部分序列從野生型基因文庫(kù)中獲得完整的基因。也可以利用PCR的方法擴(kuò)增轉(zhuǎn)座子的側(cè)翼序列,進(jìn)而得到完整的基因信息。轉(zhuǎn)座子插入特點(diǎn):插入的是完整的元件,便于分析。可從插入位點(diǎn)切除,產(chǎn)生回復(fù)突變,因此不僅可以據(jù)此確認(rèn)真正由轉(zhuǎn)座子引起的突變,還可以進(jìn)一步驗(yàn)證突變基因的功能。轉(zhuǎn)座子傾向于插入轉(zhuǎn)座子的臨近區(qū)域,可以用來(lái)研究基因組某一局部區(qū)域的結(jié)構(gòu)。通過(guò)不斷跳動(dòng)產(chǎn)生新的突變,相對(duì)較少的起始轉(zhuǎn)化系就可以獲得整個(gè)基因組的飽和突變,大大減少了工作量??梢詰?yīng)用于轉(zhuǎn)化效率不高的植物。轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)Ac/Ds系統(tǒng)由自主性元件(Ac)和非自主性元件(Ds)構(gòu)成。Ds元件能夠在Ac編碼的轉(zhuǎn)座酶的作用下移動(dòng),去除Ac元件可使其自身不能轉(zhuǎn)座。通過(guò)遺傳雜交引入自主性元件,轉(zhuǎn)座子插入序列可以重新移動(dòng)。因此,Ac/Ds轉(zhuǎn)座子插入系統(tǒng)只需要少量的轉(zhuǎn)基因品系(啟動(dòng)品系)作為轉(zhuǎn)座源即可。在真核系統(tǒng)中,轉(zhuǎn)座插入事件常不能產(chǎn)生可見(jiàn)的表型,這是因?yàn)楣δ芑虻娜哂嗷蛟谠缙诋a(chǎn)生致死效應(yīng)。采用經(jīng)修飾的轉(zhuǎn)座子可克服這些困難。修飾:轉(zhuǎn)座因子后帶一個(gè)報(bào)告基因,報(bào)告基因的表達(dá)只有在轉(zhuǎn)座事件發(fā)生的情況下才能獲得,這樣就可以通過(guò)報(bào)告基因來(lái)檢測(cè)轉(zhuǎn)座子的表達(dá)情況。修飾的Ac/Ds轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)增強(qiáng)子陷阱(enhancertrap):轉(zhuǎn)座子含有一個(gè)具弱小啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的報(bào)告基因。報(bào)告基因的表達(dá)只有在轉(zhuǎn)座發(fā)生在內(nèi)源增強(qiáng)子附近時(shí)才能獲得。啟動(dòng)子陷阱(promotertrap):轉(zhuǎn)座子帶有一個(gè)無(wú)啟動(dòng)子的報(bào)告基因,這個(gè)基因只有在轉(zhuǎn)座子插入一個(gè)植物活躍的內(nèi)源啟動(dòng)子下游時(shí)才能表達(dá)。修飾的方法-增強(qiáng)子陷阱與啟動(dòng)子陷阱Mu轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)轉(zhuǎn)座子打靶載體是以兩種噬菌體Mu為基礎(chǔ)的mini-Mu轉(zhuǎn)座子,每個(gè)轉(zhuǎn)座子上都攜帶標(biāo)記基因??梢栽跀M刪除基因兩側(cè)各插入一個(gè)mini-Mu轉(zhuǎn)座子,然后在兩個(gè)插入位點(diǎn)之間制造缺失。這種缺失可以使兩個(gè)轉(zhuǎn)座子加上靶區(qū)之間的部分基因轉(zhuǎn)移。特點(diǎn):不需要知道基因組序列,僅已知外顯子即可載體構(gòu)建迅速,技術(shù)簡(jiǎn)單載體可以攜帶多種不同抗性基因,可以同時(shí)處理多基因。三、基因沉默技術(shù)反義RNARNA干擾(RNAi)反義RNA技術(shù)反義RNA技術(shù)是根據(jù)RNA序列人工合成的互補(bǔ)RNA。根據(jù)反義RNA的作用機(jī)制可將其分為三類:1、反義RNA是直接作用于靶mRNA的核蛋白體結(jié)合位點(diǎn)或與靶mRNA直接結(jié)合形成雙鏈RNA,從而直接抑制mRNA的翻譯或被RNA酶Ⅲ識(shí)別降解。2、反義RNA是與mRNA的非編碼區(qū)結(jié)合,引起mRNA構(gòu)象的變化,從而抑制其翻譯。3、反義RNA是作用于基因的啟動(dòng)子,直接抑制靶mRNA的轉(zhuǎn)錄。(一)概念RNA干擾(RNAinterference,RNAi):與靶基因序列同源的雙鏈RNA所誘導(dǎo)的一種序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象。RNA干擾基因沉默轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默(TranscriptionalGeneSilencing,TGS)轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默(Post-transcriptionalGeneSilencing,PTGS)基因沉默轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默(TGS)是指基因在細(xì)胞核內(nèi)RNA合成受到了阻止而導(dǎo)致基因沉默。轉(zhuǎn)錄水平基因沉默可以通過(guò)有性世代傳遞,表現(xiàn)為減數(shù)分裂的可遺傳性。引起轉(zhuǎn)錄水平基因沉默的機(jī)制主要有以下幾種:基因及其啟動(dòng)子甲基化:通常發(fā)生在DNA的CG序列的堿基上,該區(qū)域堿基甲基化往往導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄受抑制。

同源基因間的反式失活:擁有同源序列的沉默位點(diǎn)和其他位點(diǎn)的DNA的相互作用而引起的基因沉默。甲基化并失活的基因能作為一種“沉默子”,對(duì)其他具有同源性的靶基因施加一種反式作用,使具有同源序列的靶基因發(fā)生甲基化并導(dǎo)致失活。反式失活的靶基因既可以與沉默基因是等位基因,也可以是非等位基因。

后成修飾作用導(dǎo)致的基因沉默:指轉(zhuǎn)基因的序列和堿基組成不發(fā)生改變,但是其功能卻在個(gè)體發(fā)育的某一階段受到細(xì)胞內(nèi)因子的修飾作用后而關(guān)閉。這種修飾作用所造成的轉(zhuǎn)基因沉默是可以隨著修飾作用的解除而被消除。后成修飾作用導(dǎo)致的轉(zhuǎn)基因沉默與受體植物的核型構(gòu)成有關(guān)。重復(fù)序列:外源基因如果以多拷貝形式整合到同一位點(diǎn)上,形成首尾相連的正向重復(fù)或頭對(duì)頭、尾對(duì)尾的反向重復(fù),則不能表達(dá),而且拷貝數(shù)越多,基因沉默現(xiàn)象越嚴(yán)重。這種重復(fù)序列誘導(dǎo)的基因沉默可能是重復(fù)序列間自發(fā)配對(duì),甲基化酶特異性識(shí)別這種配對(duì)結(jié)構(gòu)而使其甲基化,從而抑制其表達(dá)。轉(zhuǎn)錄后水平基因沉默(PTGS)則是指基因能夠在細(xì)胞核里被穩(wěn)定地轉(zhuǎn)錄,但在細(xì)胞質(zhì)里卻無(wú)相應(yīng)的mRNA存在的現(xiàn)象。引起轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默機(jī)制主要有以下幾種:共抑制:由Napoli在轉(zhuǎn)CHS基因的矮牽?;ㄖ邪l(fā)現(xiàn),普遍存在于轉(zhuǎn)基因植物中。其發(fā)生是由于外源基因編碼區(qū)與受體細(xì)胞基因間存在同源性而導(dǎo)致外源基因與內(nèi)源基因的表達(dá)同時(shí)受到抑制。

具有同源性的外基因和內(nèi)源基因在細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄速率很高,但在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)無(wú)mRNA積累,是典型的轉(zhuǎn)錄后水平基因沉默。共抑制的產(chǎn)生不僅同內(nèi)、外源基因間編碼區(qū)的同源性有關(guān),還與控制外源基因的啟動(dòng)子的強(qiáng)度等因素有關(guān)?;驂褐疲篊ogoni等首先在粗糙脈孢霉的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),外源基因可以抑制自身和相應(yīng)內(nèi)源基因的表達(dá),他們把這一現(xiàn)象定為基因壓制。基因壓制是可逆的,而且這種逆轉(zhuǎn)會(huì)伴隨有外源拷貝的丟失。基因壓制發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平,導(dǎo)致已復(fù)制的穩(wěn)定態(tài)mRNA大量減少。

RNA干擾:指將與靶基因的mRNA同源互補(bǔ)的雙鏈RNA(dsRNA)導(dǎo)入細(xì)胞后并被切割成21~23個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的短核苷酸雙鏈,在其它作用因子的參與下能夠特異地與其同源的mRNA結(jié)合并導(dǎo)致其降解,從而產(chǎn)生相應(yīng)的功能表型缺失。RNAi——一種新的遺傳工具RNAi是植物、果蠅、線蟲(chóng)和包括哺乳動(dòng)物在內(nèi)的許多生物抵抗病毒感染和限制轉(zhuǎn)座子運(yùn)動(dòng)的一種自然存在的防御機(jī)制。RNAi可以作為一種簡(jiǎn)單、有效的代替基因敲除的遺傳工具,來(lái)制備特定基因缺失表型的個(gè)體,從而研究該基因的功能.這項(xiàng)技術(shù)在疾病的基因治療上也有光明的應(yīng)用前景。特別可以用于阻斷某些突變基因的表達(dá),或者由蛋白過(guò)量表達(dá)引起的疾病。

(二)、RNA干擾的發(fā)現(xiàn)

1994年Cogoni等證明真菌中亦有類似現(xiàn)象,此稱為基因壓制(quelling)。共抑制現(xiàn)象(cosuppression)

上世紀(jì)90年代初,美國(guó)和荷蘭的兩個(gè)轉(zhuǎn)基因植物實(shí)驗(yàn)組在對(duì)矮牽牛(petunias)的研究中發(fā)現(xiàn):轉(zhuǎn)基因的植株不僅沒(méi)有新基因表達(dá),反而使原有的色素基因也受到了抑制。1995年,康乃爾大學(xué)的SuGuo博士在試圖阻斷秀麗新小桿線蟲(chóng)(C.elegans)的par-1基因?qū)嶒?yàn)中發(fā)現(xiàn):反義RNA與正義RNA(對(duì)照)都能切斷par-1基因的表達(dá)。該研究小組一直未能給這個(gè)意外以合理解釋。

GuoS,KemphuesKJ,ParL.Cell,1995,81:611-620.秀麗新小桿線蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)反義RNA與正義RNA?反義RNA-與靶核酸(如mRNA或有義DNA)鏈互補(bǔ)的RNA分子,可抑制靶核酸的功能。正義RNA-與mRNA對(duì)應(yīng)的RNA分子。RNA干擾的發(fā)現(xiàn)

1998年,F(xiàn)ire和Mello(美)首次在秀麗新小桿線蟲(chóng)中證明上述現(xiàn)象屬于轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默。他們發(fā)現(xiàn)SuGuo博士遇到的正義RNA抑制基因表達(dá)的現(xiàn)象,以及過(guò)去的反義RNA技術(shù)對(duì)基因表達(dá)的阻斷,都是由于體外轉(zhuǎn)錄所得RNA中污染了微量雙鏈RNA而引起:將體外轉(zhuǎn)錄得到的單鏈RNA純化后注射線蟲(chóng),基因抑制效應(yīng)變得十分微弱,而經(jīng)過(guò)純化的雙鏈RNA卻正好相反,能夠高效特異性阻斷相應(yīng)基因的表達(dá),其抑制基因表達(dá)的效率比純化后的反義RNA至少高2個(gè)數(shù)量級(jí)。該小組將這一現(xiàn)象稱為RNA干擾。

FireA,XuS,MontgomeryME,etal.Nature.1998,391:806-811.Negativecontrolshowinglackofstainingintheabsenceofthehybridizationprobe.(對(duì)照,缺mex-3

,不著色)(B)Embryofromuninjectedparentshowingnormalpatternofendogenousmex-3RNA(purplestaining).(正常野生型,紫)(C)Embryofromparentinjectedwithpurifiedmex-3antisenseRNA.Theseembryos(andtheparentanimals)retainmex-3mRNA,althoughlevelsmaybesomewhatlessthanwildtype.(野生型+反義RNA,淺紫)(D)Late4-cellstageembryofromaparentinjectedwithdsRNAcorrespondingtomex-3;nomex-3RNAisdetected.(TemplatesusedforinterferingRNAandinsituprobeswerelargelynon-overlapping.)

(野生型+雙鏈RNA,不著色)Effectsofmex-3RNAinterferenceonlevelsoftheendogenousmRNA.NomarskiDICmicrographsshowinsituhybridization(原位雜交)of4-cellstageembryos.“沉默”是金Fire與Mello獲2006年諾貝爾獎(jiǎng)在1999年一年內(nèi),發(fā)現(xiàn)RNA干擾現(xiàn)象廣泛存在于植物、真菌、線蟲(chóng)、昆蟲(chóng)、蛙類、鳥(niǎo)類、大鼠、小鼠、猴一直到人類的幾乎所有的真核生物細(xì)胞中。2000年,又先后發(fā)現(xiàn)小鼠早期胚胎中和大腸桿菌中也存在RNA干擾現(xiàn)象。2000年提出RNAi作用機(jī)制模型。HannondSMetal.Nature,2000,404(6775):293-296ZamorePD.Cell,2000,101(1):25-332001年,RNAi技術(shù)成功誘導(dǎo)培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因沉默現(xiàn)象。Nature,2001,411(6836):494-498RNAi技術(shù)被《Science》評(píng)為2001年度的十大科技進(jìn)展之一。2002年5月,Lindenbach(美),雙鏈RNA→艾滋病病毒細(xì)胞→減少艾滋病病毒基因表達(dá)90%以上。2002年7月,Novina等用RNAi技術(shù)實(shí)現(xiàn)了HIV1病毒的阻抑。2002年7月,McCaffrey(美)等人,雙鏈RNA+肝炎C病毒-標(biāo)志基因→鼠肝臟→抑制標(biāo)志基因的表達(dá)/肝炎C病毒基因的表達(dá)。利用RNAi可以直接和有效地起

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