第七章-微生物的遺傳與變異

上章教學回顧第六章微生物的生長及其控制§6-1測定生長繁殖的方法§6-2微生物的生長規(guī)律§6-3影響微生物生長的主要因素§6-4微生物培養(yǎng)法概論§6-5有害微生物的控制一、測生長量二、計繁殖數(shù)一、溫度二、氧氣三、pH一、微生物的個體生長和同步生長二、單細胞微生物的典型生長曲線三、微生物的連續(xù)培養(yǎng)四、微生物的高密度培養(yǎng)一、實驗室培養(yǎng)法二、生產(chǎn)實踐中培養(yǎng)微生物的裝置一、幾個基本概念二、物理滅菌和消毒的代表——高溫三、化學殺菌劑、消毒劑和治療劑第七章微生物的遺傳與變異教學目的與要求了解微生物的遺傳變異的物質基礎，掌握原核微生物與真核微生物的基因重組和突變，熟悉基因工程的基本操作和菌種保藏原理二、

教學內容：1、遺傳變異的物質基礎（☆）2、基因突變和誘變育種（★）3、基因重組和雜交育種（★）4、基因工程5、菌種的衰退、復壯和保藏遺傳(heredity,inheritance)是指上一代生物將自身的一整套遺傳基因穩(wěn)定地傳遞給下一代的行為或功能，具有極其穩(wěn)定(保守)的特性。遺傳型(genotype)又稱基因型，指某一生物個體所含有的全部遺傳因子即基因組(genome)所攜帶的遺傳信息。遺傳和變異的幾個基本概念遺傳型(可能性)+環(huán)境條件表型(實現(xiàn)性)代謝、發(fā)育表型(phenotype)是指某一生物體所具有的一切外表特征和內在特性的總和，是其遺傳型在合適環(huán)境條件下通過代謝和發(fā)育而得到的具體體現(xiàn)，是一種具體性狀。變異(variation)指生物體在某種外因或內因的作用下所引起遺傳物質結構或數(shù)量的改變，亦即遺傳型的改變。特點：在群體中只以極低的幾率(一般10-5~10-10)出現(xiàn)；性狀變化幅度大；變化后的新性狀是穩(wěn)定的、可遺傳的和不可恢復的。飾變(modification)指外表修飾性改變，是一種不涉及遺傳物質結構改變而只發(fā)生在轉錄、轉譯水平上的表型變化。特點：是整個群體中的幾乎每一個體都發(fā)生同樣變化；性狀變化的幅度?。灰蚱溥z傳物質未變，故飾變是不遺傳的和可恢復的。

如Serratiamarcescens(粘質沙雷氏菌，舊稱“神靈色桿菌”)。遺傳和變異的幾個基本概念微生物因其獨特的生物學特性而成為模式生物物種與代謝類型的多樣性個體的體制極其簡單營養(yǎng)體一般都是單倍體易于在成分簡單的組合培養(yǎng)基上大量生長繁殖繁殖速度快易于積累不同的中間代謝物或終產(chǎn)物菌落形態(tài)的可見性與多樣性環(huán)境條件對微生物群體中各個體作用的直接性和均一性易于形成營養(yǎng)缺陷型突變株各種微生物一般都有其相應的病毒存在多種處于進化過程中、富有特色的原始有性生殖方式遺傳和變異的幾個基本概念第一節(jié)遺傳變異的物質基礎種質連續(xù)理論：1883~1889年間德國A.Weissmann提出。認為遺傳物質是一種具有特定分子結構的化合物（種質）?；驅W說：1933年摩爾根（ThomasHuntMorgan）發(fā)現(xiàn)了染色體，并證明基因在染色體上呈直線排列，提出了基因學說，使得遺傳物質基礎的范圍縮小到染色體上。但染色體是由核酸和蛋白質兩種長鏈高分子組成。當時認為決定生物遺傳型的染色體和基因，起活性成分是蛋白質。DNA是遺傳變異的物質基礎的證明：1944年以后，先后有利用微生物為實驗對象進行的3個著名實驗的論證才使人們普遍接受核酸尤其是DNA才是真正的遺傳物質。第一節(jié)遺傳變異的物質基礎一、3個經(jīng)典實驗一)經(jīng)典轉化實驗最早：1928年英國的F.Griffith，以S.pneumoniae(肺炎鏈球菌)作研究對象。肺炎鏈球菌SⅢ型：RⅡ型：具莢膜，菌落表面光滑，為致病株不形成莢膜，菌落外觀粗糙，非致病株結論：加熱殺死的SⅢ型細菌，在其細胞內可能存在一種具有遺傳轉化能力的物質，它能通過某種方式進入RⅡ型細胞，并使RⅡ型細菌獲得表達SⅢ型莢膜性狀的遺傳特性。1944年O.T.Avery、C.M.MacLeod和M.McCarty從熱死SⅢ型S.pneumoniae中提純了可能作為轉化因子的各種成分，并在離體條件下進行了轉化試驗：（1）動物試驗（3）S型菌的無細胞抽提液試驗熱死SIII菌—————不生長

活RII

菌—————長出RII菌

熱死SIII菌+活RII菌—————長出大量RII菌和10-6SIII菌活RII菌+SIII菌無細胞抽提液——長出大量RII菌和少量SIII菌平皿培養(yǎng)平皿培養(yǎng)平皿培養(yǎng)（2）細菌培養(yǎng)實驗轉化試驗示意對照P190動物試驗混合培養(yǎng)RII型活菌SIII型活菌SIII型熱死菌RII型活菌SIII型活菌健康健康健康健康健康健康健康病死病死病死活RⅡ菌長出SⅢ菌只有RⅡ菌離體轉化試驗：1）從活的S菌中抽提各種細胞成分２)對各種生化組分進行轉化試驗只有SⅢ型細菌的DNA才能將S.pneumoniae的R型轉化為SⅢ型。且DNA純度越高，轉化效率也越高。有力地說明SⅢ型菌株轉移給RⅡ型菌株的決不是遺傳性狀（有無莢膜）本身，而是DNA遺傳因子。①加SⅢ菌DNA②加SⅢ菌DNA及DNA酶以外的酶③加SⅢ菌的DNA和DNA酶④加SⅢ菌的RNA⑤加SⅢ菌的蛋白質⑥加SⅢ菌的莢膜多糖二）噬菌體感染實驗A.D.Hershey和M.Chase，1952年進行首先把E.coli培養(yǎng)在以放射性32PO43-或35SO42-作為磷源或硫源的組合培養(yǎng)基中，從而制備出含32P-DNA或含35S-蛋白質的噬菌體接著，進行了兩組實驗（1）含32P-DNA的一組：放射性85%在沉淀中10分鐘后用搗碎器使空殼脫離吸附離心沉淀細胞進一步培養(yǎng)后，可產(chǎn)生大量完整的子代噬菌體上清液中含15%放射性沉淀中含85%放射性沉淀中含25%放射性（2）含35S-蛋白質的一組：放射性75%在上清液中10分鐘后用搗碎器使空殼脫離吸附離心沉淀細胞進一步培養(yǎng)后，可產(chǎn)生大量完整的子代噬菌體上清液中含75%放射性二）噬菌體感染實驗結果：在噬菌體感染過程中，其蛋白質外殼根本未進入宿主細胞。進入宿主細胞雖只有DNA，但卻有自身的增殖、裝配能力，最終會產(chǎn)生一大群完整子代噬菌體。結論：證實DNA是噬菌體的遺傳物質，在DNA中，存在著包括合成蛋白質外殼在內的整套遺傳信息。三）植物病毒的重建實驗為了證明核酸是遺傳物質，H.Fraenkel-Conrat（1956）用含RNA的煙草花葉病毒（TMV）進行了著名的植物病毒重建實驗。方法：將TMV在一定濃度的苯酚溶液中振蕩，就能將其蛋白質外殼與RNA核心相分離。分離后的RNA在沒有蛋白質包裹的情況下，也能感染煙草并使其患典型癥狀，而且在病斑中還能分離出完整的TMV粒子。選用了HRV（霍氏車前花葉病毒）與TMV進行了如下拆分與重建實驗：實驗方法A：RNA（TMV）-蛋白質（HRV）B：RNA（HRV）-蛋白質（TMV）用兩種雜合病毒感染煙草：A:表現(xiàn)TMV的典型癥狀并分離到正常TMV粒子B:表現(xiàn)HRV的典型癥狀并分離到正常HRV粒子。結論：在RNA病毒中，遺傳的物質基礎也是核酸(RNA)TMVHRVHRVTMV拆分重建核酸的特性及復制方式(補充)1、核酸的化學組成和結構第一節(jié)遺傳變異的物質基礎2、核酸的特性溫度升高導致雙鏈的解鏈（變性），當溫度緩慢降低時被解鏈的DNA能夠重新配對（復性），不同來源的DNA之間堿基序列互補的區(qū)段也能夠進行堿基配對（退火或雜交）。二、遺傳物質在細胞內存在的部位和方式核酸存在的七個水平細胞水平：大部分DNA都集中在細胞核或核區(qū)中，數(shù)目1-2個。細胞核水平：核染色體組（核基因組或基因組）和核外染色體。染色體水平：染色體數(shù)和染色體倍數(shù)（單倍、雙倍）核酸水平：核酸種類、核酸結構、DNA長度基因水平：具有特定核苷酸序列的核酸片段（遺傳功能單位）密碼子水平（遺傳信息單位）遺傳密碼是指DNA鏈上決定各具體氨基酸的特定核苷酸順序。其信息單位是密碼子。每一密碼子由3個核苷酸序列即1個三聯(lián)體組成。核苷酸水平（核苷酸單位或堿基單位）最低突變單位或交換單位第一節(jié)遺傳變異的物質基礎掌握幾個有用的數(shù)據(jù)：①每個堿基對（pb）的平均相對分子質量約為650；②1×106的dsDNA約為1.5kb或0.5μm;③3nmol堿基的重量約等于1μg。④多數(shù)細菌的基因組為1～9Mb第一節(jié)遺傳變異的物質基礎二、遺傳物質在細胞內存在的部位和方式1、細胞核水平1）在原核細胞中染色體DNA(核染色體)：在核區(qū)內，雙鏈，環(huán)狀或線狀，無組蛋白；染色體外DNA(核外染色體):質粒(F質粒、R質粒、Col質粒、Ti質粒、Ri質粒、mega質粒和降解質粒)2）在真核細胞中核DNA：在細胞核內與組蛋白結合成核小體；核外DNA：細胞質基因(包括線粒體和葉綠體基因等)；共生生物（如卡巴顆粒）；2μm質粒(釀酒酵母的在核內)等。原核生物的質粒1、定義典型質粒：凡游離于原核生物核基因組以外，具有獨立復制能力的小型共價閉合環(huán)狀的dsDNA(cccDNA)分子。線形質粒2、特點具有麻花狀的超螺旋結構，大小一般為1.5~300kb。攜帶某些核基因組上所缺少的基因，使細菌等原核生物獲得了某些對其生存并非必不可少的特殊功能。復制類型有嚴緊型復制控制和松弛型復制控制兩種。含質粒的細胞在正常的培養(yǎng)基上受吖啶類染料、絲裂霉素C、紫外線、利福平等因子處理后，會發(fā)生質粒消除。具有與核基因組整合與脫離功能，這類質粒又稱為附加體。質粒與質粒間，質粒與核染色體間發(fā)生基因重組。原核生物的質粒3、質粒在基因工程中的應用優(yōu)點①體積小，便于DNA的分離和操作；②呈環(huán)狀，使其化學分離過程中能保持性能穩(wěn)定；③有不受核基因組控制的獨立復制起始點；④拷貝數(shù)多，使外源DNA可很快擴增；⑤存在抗藥性基因等選擇性標記，便于含質?？寺〉臋z出和選擇（如E.coli的pBR322質粒）4、質粒的分離與鑒定分離：細胞的裂解、蛋白質和RNA去除以及質粒DNA與染色體DNA分離。鑒定：電鏡、瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳及密度梯度離心法。第一節(jié)遺傳變異的物質基礎二、遺傳物質在細胞內存在的部位和方式2、基因水平：

是生物體內一切具有自主復制能力的最小遺傳功能單位，其物質基礎是一條以直線排列、具有特定核苷酸序列的核酸片斷。由眾多的基因構成了染色體。以原核生物為例：基因調控系統(tǒng)操縱子啟動基因(啟動子)調節(jié)基因操縱基因結構基因DNA鏈RAmRNABmRNACmRNAOabc蛋白質第一節(jié)遺傳變異的物質基礎二、遺傳物質在細胞內存在的部位和方式2、基因水平：真核生物的基因與原核生物的基因最明顯的不同是它們一般無操縱子結構，存在著大量不編碼序列和重復序列，轉錄和轉譯在細胞中有空間分隔，以及基因被許多無編碼功能的內含子阻隔，從而使編碼序列變成不連續(xù)的外顯子狀態(tài)。第二節(jié)基因突變和誘變育種一、基因突變簡稱“突變”。是變異的一類，泛指細胞(病毒粒)內遺傳物質的分子結構或數(shù)量突然發(fā)生的可遺傳的變化，可自發(fā)或誘導產(chǎn)生。狹義的突變專指基因突變(點突變)；廣義的突變則包括基因突變和染色體畸變。野生型菌株：簡稱野生型，指從自然界分離到的菌株。突變株(變異體、變異型)野生型經(jīng)突變后形成的帶有新性狀的菌株。（一）突變類型突變株的表型選擇性突變株非選擇性突變株營養(yǎng)缺陷型(株)抗性突變型(株)條件致死突變型(株)形態(tài)突變型(株)抗原突變型(株)產(chǎn)量突變型(株)★依表型的改變分為：營養(yǎng)缺陷型——因突變而喪失合成一種或幾種生長因子、堿基或氨基酸等生物合成酶的能力，因而無法再在基本培養(yǎng)基上正常生長繁殖，而必須在基本培養(yǎng)基中添加某種物質才能生長的突變類型?？剐酝蛔冃汀蛲蛔兌a(chǎn)生了對某種化學藥物或致死物理因子的抗性，它們可在加有相應藥物或用相應物理因子處理的平板上選出條件致死突變型——突變后在某種條件下可正常生長繁殖，并呈現(xiàn)其固有的表型，而在另一條件下卻無法生長繁殖的突變型形態(tài)突變型——由突變引起的個體或菌落形態(tài)的變異抗原突變型——因突變而引起的細胞抗原結構發(fā)生改變產(chǎn)量突變型——因突變而要代謝物產(chǎn)量上明顯有別于原始菌株。（一）突變類型每一細胞在每一世代中發(fā)生某一性狀突變的幾率。也可用某一單位群體在每一世代中產(chǎn)生突變株的數(shù)目來表示。突變率=突變細胞數(shù)/分裂前群體細胞數(shù)突變是獨立的。某一基因發(fā)生突變不會影響其它基因的突變率。因此，在同一個細胞中同時發(fā)生兩個基因突變的幾率是極低的，因為雙重突變型的幾率只是各個突變幾率的乘積。由于突變的幾率一般都極低，因此，必須采用檢出選擇性突變株的手段，尤其是采用檢出營養(yǎng)缺陷型的回復突變株（backmutant或reversemutant）或抗性突變株特別是抗藥性突變株的方法來加以確定。（二）突變率（二）突變率基因符號基因的名稱用其英文單詞的頭3個小寫英文字母表示，且應排成斜體字（書寫時可在其下劃一底線區(qū)別）。同一基因的不同基因突變則在3個英文小寫字母后加一個正體大寫字母或數(shù)字表示。如hisA、hisB代表組氨酸的A、B基因。在基因名稱右上方可用不同符號表示微生物的突變型:his+、his-分別表示組氨酸原養(yǎng)型和缺陷型，gal+、gal-分別表示能發(fā)酵半乳糖和不能發(fā)酵半乳糖

strS、strR分別表示對鏈霉素敏感和具有抗性蛋白質（基因表達產(chǎn)物）的符號用其英文單詞的頭3個大寫英文字母（或1個大寫，2個小寫）表示，且應排成正體字（三）突變的特點1.自發(fā)性:2.稀有性:3.可誘變性:4.不對應性：5.獨立性：6.穩(wěn)定性：7.可逆性：自發(fā)突變率極低而且穩(wěn)定，10-6～10-9各種性狀的突變自發(fā)地發(fā)生在誘變劑作用下，自發(fā)突變可提高10-10000倍突變的性狀與引起突變的原因之間無直接的對應關系。例如，在紫外線作用下，除產(chǎn)生抗紫外線的突變體外．還可誘發(fā)任何其他性狀的變異某一基因的突變率不受它種基因突變率的影響。說明突變對某一細胞或某一基因都是隨機的。突變的根源是遺傳物質結構上發(fā)生了穩(wěn)定變化，故產(chǎn)生的新的變異性狀也是穩(wěn)定的、可遺傳的。任何性狀都可發(fā)生正向突變，也都可以發(fā)生相反的過程——回復突變。（四）基因突變的自發(fā)性和不對應性的證明在各種基因突變中，抗性突變最為常見。但在過去相當長時間內對這種抗性產(chǎn)生的原因爭論十分激烈。一種觀點認為，突變是通過適應而發(fā)生的，即各種抗性是由其環(huán)境（指其中所含的抵抗對象）誘發(fā)出來的，突變的原因和突變的性狀間是相對應的，并認為這就是“定向變異”，也有人稱它為“馴化”或“馴養(yǎng)”。另一種看法則認為，基因突變是自發(fā)的，且與環(huán)境是不相對應的。由于其中有自發(fā)突變、誘發(fā)突變、誘變劑與選擇條件等多種因素錯綜在一起，所以難以探究問題的實質。從1943年起，經(jīng)過幾個嚴密而巧妙的實驗設計，主要攻克了如何檢出在接觸抗性因子前已產(chǎn)生的自發(fā)突變株的難題，終于在科學的基礎上結束了這場紛爭。（五）基因突變及其機制誘變(誘發(fā)突變)自發(fā)突變點突變(基因突變)畸變堿基置換移碼突變基因突變轉換：顛換A←→G，T←→CA←→T，A←→CG←→C，G←→T缺失：插入：缺失：添加易位(轉座)：倒位：重復：插入：染色體DNA序列從某一部位轉移到同一染色體上另一部位或其他染色體上某一部位的現(xiàn)象。

染色體發(fā)生兩次斷裂后，某一區(qū)段發(fā)生顛倒，而后又愈合的現(xiàn)象。一)自發(fā)突變概念：指生物體自然發(fā)生而非人為引起的突變1、基因突變的自發(fā)性和不對稱性的實驗證明變量試驗：1943年S.E.Luria和M.Delbruck涂布試驗:1949年H.B.Newcombe影印平板培養(yǎng)試驗：1952年J.Lederberg夫婦2、自發(fā)突變的原因(機制)由背景輻射或環(huán)境因素引起誘變作用，如宇宙射線、加熱等微生物自身產(chǎn)生誘變物質如微生物細胞內的咖啡堿、硫氰化合物、二硫化二丙烯、重氖絲氨酸及過氧化氫等。DNA復制中．偶然堿基配對錯誤(10-7~10-11×1000=10-6)

，引起突變。大腸桿菌稀釋培養(yǎng)物(103/mL)10ml10ml(培養(yǎng)前先分成50小管)(在同一大管中作整體培養(yǎng)后分50份)(抗噬菌體菌落數(shù))(抗噬菌體菌落數(shù))3,2,64,1,0103,1,21,7,17,4,5,4,7,5,3,6,4,5Luria等的變量實驗結論：

①E.Coli抗噬菌體性狀的產(chǎn)生，并非由所抗的環(huán)境因素（即噬菌體T1）誘導出來的，而是在它接觸T1前，在某次細胞分裂過程中自發(fā)產(chǎn)生的。這一自發(fā)突變發(fā)生得越早，抗性菌落出現(xiàn)得就越多，反之則越少。②噬菌體T1在這里僅起淘汰原始的未突變菌株和甄別抗噬菌體突變型的作用，而決非“馴養(yǎng)者”。保溫5h保溫5h噴入T1保溫噴入T1保溫6個平板重新涂布噴入T1保溫噴入T1保溫6個平板重新涂布I個小菌落生長時產(chǎn)生抗噬菌體突變在未噴噬菌體T1前沒有突變細胞自發(fā)突變假說獲得免疫性假說在12個瓊脂平板上每個平板涂布5*104個大腸桿菌的噬菌體敏感性細胞每個平板上有5*104個小菌落，每個菌落約含5000個細菌1個抗噬菌體菌落（共28個）小菌落中每個抗噬菌體細胞產(chǎn)生1個抗菌體菌落（共353個）兩組平板有相同數(shù)目的細菌，所以將產(chǎn)生相同數(shù)目的抗噬菌體菌落Newcombe的涂布試驗結論：

①E.Coli抗噬菌體突變的確發(fā)生在與T1接觸之前。②噬菌體T1的加入只起到甄別這類自發(fā)突變是否發(fā)生作用，而不是誘發(fā)相應突變的原因。涂布試驗中突變率的計算初始接種量：5×104個/皿培養(yǎng)5小時，繁殖了12.3代，每個微菌落約含5100個細菌這時，每個平皿上的細胞數(shù)為：5100×5×104≈2.6×108個/皿在6個平板上，比接種時增加的細胞數(shù)為：

6×（2.6×108

5×104）=15.6×108在未涂布的平板上共發(fā)現(xiàn)28個突變，故突變率=28/15.6×108=1.8×108含藥物的培養(yǎng)皿不含藥物的培養(yǎng)皿原始敏感菌種123456789111210影印接種Lederberg等設計的平板影印培養(yǎng)法二)誘發(fā)突變誘發(fā)突變：簡稱誘變。指通過人為的方法，利用物理、化學或生物因素顯著提高基因自發(fā)突變頻率的手段。誘變劑：凡具有誘變效應的任何因素。化學因素的誘變物理因素的誘變紫外線X射線和γ射線等是不帶電的光量子，不能直接引起物質原子電離或激發(fā)，但在與基因分子碰撞時，把全部或部分能量傳給原子而產(chǎn)生次級電子。這些次級電子一般具有很高的能量，能產(chǎn)生電離作用；因而直接或間接地改變DNA結構?；瘜W因素的誘變1、直接引起堿基置換的誘變劑是一類可直接與核酸的堿基發(fā)生化學反應的化學誘變劑，能與所有生物體的DNA，無論它是離體的DNA、離菌的噬菌體還是代謝作用幾乎停頓的細胞(如芽孢)等都發(fā)生化學作用，從而引起突變(主要轉換，極少顛換)。如亞硝酸、烷化劑、羥胺。2、間接引起堿基置換的誘變劑是一些堿基類似物，其結構與DNA中的堿基十分相似，但穩(wěn)定性較正常堿基小，在菌體內能以不同的形式存在(如5—溴尿嘧啶能以酮式或烯醇式狀態(tài)存在)它們能通過活細胞的代謝作用摻入到DNA分子中而不妨礙DNA的正常復制，但其發(fā)生的錯誤配對可引起堿基的置換。化學因素的誘變3、移碼誘變劑能插入DNA分子的堿基對之間，使DNA鏈結構變形，并在DNA復制時由于不對稱交換，引起DNA鏈中插入或缺失一個或幾個堿基，造成這一對核苷酸后的整個密碼的移動，產(chǎn)生移碼突變。物理因素的誘變紫外線(UV)對DNA的損傷與修復損傷DNA具有強烈的紫外吸收能力，尤其是核酸鏈上的堿基對，其中嘧啶比嘌呤更敏感。紫外線的大劑量作用可導致菌體死亡，小劑量則可引起突變。生物學效應：DNA鏈斷裂、DNA分子內部和分子間交聯(lián)、核酸和蛋白質交聯(lián)、嘧啶堿的水合作用及胸腺嘧啶二聚體的形成等。同一條鏈上：雙鏈解開和復制受阻，導致死亡兩條鏈上：破壞腺嘌呤的正常摻入和堿基配對，導致突變物理因素的誘變紫外線(UV)對DNA的損傷與修復修復光復活：把經(jīng)UV照射后的微生物立即暴露于可見光下時，就可出現(xiàn)明顯降低其死亡率的現(xiàn)象。經(jīng)UV照射后形成了胸腺嘧啶二聚體的DNA分子，在黑暗中會被一種光激活酶(光解酶、光裂酶)結合而穩(wěn)定存在，但在300-500nm可見光下，此酶會因獲得光能而激活，并使二聚體重新分解成單體。注意：在利用UV進行誘變育種時，就應在紅光進行照射和后續(xù)操作，并放置在黑暗條件下培養(yǎng)。暗復活(暗修復、切除修復)是活細胞一種用于對被UV等誘變劑損傷后不依賴可見光，只通過酶切作用去除嘧啶二聚體，隨后重新合成一段正常DNA鏈的核酸修復方式。二、突變與育種一)自發(fā)突變與育種１、從生產(chǎn)中育種如從污染噬菌體的發(fā)酵液中，分離到抗噬菌體突變株；酒精工廠糖化酶產(chǎn)生菌中，篩選到糖化力強、培養(yǎng)條件較粗放的白色孢子變種“上酒白種”等。２、定向培育優(yōu)良菌株定向培育：利用微生物的自發(fā)突變，采用特定的選擇條件，通過對微生物群體不斷移植以選育出較優(yōu)良菌株的過程。19世紀，巴斯德培育低毒力的炭疽芽孢桿菌活菌苗；牛型結核桿菌接種在含牛膽汁和甘油的馬鈴薯培養(yǎng)基上篩選卡介苗。二、突變與育種二)誘變育種概念：利用物理、化學等誘變劑處理均勻分散的微生物細胞群，在促進其突變率顯著提高的基礎上，采用簡便、快速和高效的篩選方法，把適合人類需要的少數(shù)優(yōu)良菌株選育出來的過程。實踐意義可獲得供工業(yè)和實驗室應用的各種菌株。當前發(fā)酵工業(yè)和其他微生物生產(chǎn)部門所使用的高產(chǎn)菌株，幾乎毫無例外地都是通過誘變育種而明顯提高其生產(chǎn)性能的。如青霉素生產(chǎn)菌株(產(chǎn)黃青霉)的選育二)誘變育種1、基本環(huán)節(jié)出發(fā)菌株誘變絕大多數(shù)個體死亡少數(shù)存活多數(shù)未變少數(shù)突變多數(shù)負變少數(shù)正變多數(shù)幅度小少數(shù)幅度大多數(shù)不投產(chǎn)少數(shù)宜投產(chǎn)可計算：存活率突變率正變率“高產(chǎn)率”投產(chǎn)率二)誘變育種2、一般原則(1)選擇簡便有效的誘變劑。(2)挑選優(yōu)良的出發(fā)菌株

(3)處理成單細胞或單孢子懸液(4)選用最適劑量(5)充分利用復合處理的協(xié)同效應(6)利用和創(chuàng)造微生物形態(tài)、生理與產(chǎn)量間的相關指標，以便在初篩中即可從形態(tài)性狀估計其生產(chǎn)潛力。(7)設計和采用高效篩選方案和方法(初篩和復篩)(8)創(chuàng)造新型篩選方法１）選擇簡便有效的誘變劑誘變劑的種類：物理誘變劑和化學誘變劑誘變劑的選擇在同樣效果下，應選用最簡便的因素；在同樣簡便的情況下，則應選擇最高效的因素。簡便有效的誘變方法：紫外線的照射最為簡便。設備：紫外燈、磁力攪拌器、無可見光（只有紅光）暗室等，紫外燈：波長為253.7nm,

功率是15W，處理時的照射距離：20cm～30cm，照射時間不短于10～20s,也不長于10～20min。樣品：要直接暴露在紫外燈下，厚度不能超過3mm(?？扇?mL單細胞懸液放置在直徑為6cm的小培養(yǎng)皿中，在無蓋的條件下直接照射)。照射時，要用磁力攪拌器攪拌。處理劑量：常用照射時間或死亡率作為相對劑量。１）選擇簡便有效的誘變劑簡便有效的誘變方法化學誘變劑的種類、濃度和處理方法尤其是中止反應的方法很多，實際工作時可參看有關書籍。一種較有效的簡易處理方法的大致操作步驟是：先在平板上涂上出發(fā)菌株細胞，然后在平板上劃區(qū)并分別均勻地放上幾顆很小的誘變劑顆粒（也可放吸有誘變劑溶液的濾紙片），經(jīng)保溫培養(yǎng)后，可發(fā)現(xiàn)在顆粒周圍有一透明的抑菌圈，在抑菌圈的邊緣挑取若干突變菌落，將它們一一制成懸浮液，再分別涂布在瓊脂平板表面，使長出許多單菌落，最后可用影印平板法或逐個檢出法選出突變種。2）挑選優(yōu)良的出發(fā)菌株

出發(fā)菌株———用來育種處理的起始菌株

◆出發(fā)菌株應具備：

①對誘變劑的敏感性高；

②具有特定生產(chǎn)性狀的能力或潛力；

◆出發(fā)菌株的來源；

①自然界直接分離到的野生型菌株

②歷經(jīng)生產(chǎn)考驗的自發(fā)突變菌株

③具有有利于進一步研究或應用性關的菌株

④已經(jīng)歷多次育種處理的菌株３)處理單細胞或單孢子懸液

指某一突變在DNA復制和細胞分裂后，才在表型上顯示出來，造成不純的菌落。產(chǎn)生原因：①分離性遲延現(xiàn)象②生理性遲延現(xiàn)象要求：

①菌體處于對數(shù)生長期，并使細胞處于同步生長；

②細胞分散且為單細胞或單孢子懸液，以避免表型遲延現(xiàn)象方法：

①玻璃珠打散10-15min;

②加0.3%吐溫80（表面活性劑）

③用無菌脫脂棉過濾。

制備：

物理誘變劑——生理鹽水（0.85%NaCl)

化學誘變劑——緩沖液濃度：

細菌、放線菌108個/mL

霉菌、酵母菌106個/mL４)選用最適的誘變劑量劑量的表示法：不同種類和不同生長階段的微生物對誘變劑的敏感程度不同，致死率是最好的誘變劑相對劑量的表示方法。最適劑量的選擇：某誘變劑的劑量～存活率～誘變率三者的最佳結合點。劑量存活率曲線：劑量誘變率曲線：實際工作中：產(chǎn)量性狀的正變較多傾向于低劑量（如，在UV作誘變劑中，控制致死率在70-75%甚至30-70％）第一輪：一個出發(fā)菌株→→→選出200個菌株→→→選出50株→→→選出5株誘變處理初篩（每瓶一株）復篩（每瓶四株）第二輪：5個出發(fā)菌株→→→→→→選出50株→→→選出5株40株40株40株40株40株誘變初篩復篩（每瓶一株）（每瓶四株）第三輪，第四輪……(都同第二輪)創(chuàng)造新型篩選方法初篩：以粗測為主。平板或搖瓶平皿快速檢測法變色圈法水解圈法、顯色圈法生長圈法：營養(yǎng)缺陷株的篩選抑菌圈法：產(chǎn)量突變株的篩選梯度平板法：抗性突變株的篩選搖瓶培養(yǎng)法復篩：用搖瓶培養(yǎng)或發(fā)酵罐精測３、3類突變株的篩選方法產(chǎn)量突變株的篩選抗藥性突變株的篩選營養(yǎng)缺陷型突變株的篩選產(chǎn)量突變型的篩選操作要點：１）把誘變后的微生物的單細胞懸液均勻涂布在瓊脂平板上；２）待長上稀疏的小菌落后，用打孔器一一取出長有單菌落的瓊脂小塊；３）分別把它們整齊地移入滅菌的空培養(yǎng)皿內，在合適的條件下繼續(xù)培養(yǎng)4-5d；4）把每一長滿單菌落的瓊脂再轉移至已混有供試菌的大塊瓊脂平板上，以分別測定各小塊的抑菌圈，擇優(yōu)取之。方法：梯度平板法（gradientplate）抗藥性突變株的篩選抗藥性突變株的應用：作為菌株的遺傳標記作為生產(chǎn)菌種（結構類似物抗性變異株）圖7-18用梯度平板法定向篩選抗性突變株1)與篩選營養(yǎng)缺陷型突變株有關的3類培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基(MM，符號為[-])——能滿足某一種的野生型或原養(yǎng)型菌株營養(yǎng)要求的最低成分的合成培養(yǎng)基。補充培養(yǎng)基(SM,符號為[A]或[B])——在基本培養(yǎng)基中有針對性地補加某一種或幾種營養(yǎng)成分，以滿足相應的營養(yǎng)缺陷型菌株生長需要(其他營養(yǎng)缺陷型仍不能生長)的培養(yǎng)基。完全培養(yǎng)基(CM,符號為[+])——可滿足該菌各種營養(yǎng)缺陷型菌株營養(yǎng)需要的天然或半合成培養(yǎng)基。營養(yǎng)缺陷型突變株的篩選營養(yǎng)缺陷型突變株的篩選2)與營養(yǎng)缺陷型有關的3類遺傳型個體野生型——變異前的原始菌株。能在相應的基本培養(yǎng)基上生長。若A、B兩個基因表示其對這兩種營養(yǎng)物合成能力，則野生型株的遺傳型應是[A+B+]。營養(yǎng)缺陷型——原菌株由于發(fā)生基因突變，致使合成途徑中某一步驟發(fā)生缺陷，喪失了合成某種代謝產(chǎn)物的能力，因而無法再在基本培養(yǎng)基(MM)上正常生長繁殖，必須在培養(yǎng)基中外源補加該物質(補充培養(yǎng)基)才能生長的菌株。A營養(yǎng)缺陷型的遺傳型用[A-B+]表示原養(yǎng)型——營養(yǎng)缺陷型菌株經(jīng)回復突變或重組后產(chǎn)生的菌株，其營養(yǎng)要求在表型上與野生型相同。遺傳型也為[A+B+]。誘變回變或重組艾姆氏試驗基本原理：

S.t.（鼠傷寒沙門氏菌）的his-菌株在基本培養(yǎng)基[-]平板上不能生長，而其回復突變成his+菌株后則能生長。利用細菌營養(yǎng)缺陷型的回復突變來檢測環(huán)境或食品中是否存在化學致癌劑的簡便有效方法。許多化學物質原先并非誘變劑或致癌劑，只有在進入機體并在肝臟的解毒過程中，受到肝細胞中一些加氧酶的作用，才形成有害物。有某種高濃度誘變劑存在有某種適當濃度誘變劑存在①賴氨酸發(fā)酵菌種：谷氨酸棒桿菌的Hom–②肌苷酸（IMP）發(fā)酵調控理論的實踐應用菌種：谷氨酸棒桿菌的酶12的腺嘌呤缺陷型★抗反饋調節(jié)突變株——是指對反饋抑制不敏感或對阻遏有抗性，或兩者兼有之的組成型菌株。菌種：黃色短桿菌的抗AHV突變株菌種：黃色短桿菌抗AHV菌株的甲硫氨酸缺陷型③蘇氨酸發(fā)酵營養(yǎng)缺陷型突變株的篩選3)篩選營養(yǎng)缺陷型菌株的一般步驟和萬法a、誘變：常用紫外線誘變形成少量營養(yǎng)缺陷型菌株。b、中間培養(yǎng)：用完全培養(yǎng)基或補充培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜c、淘汰野生型(濃縮缺陷型)抗生素法：某些抗生素能殺死生長繁殖著的微生物，而對處于休止狀態(tài)的微生物無殺傷作用。如青霉素(細菌)；制霉菌素(真菌)菌絲過濾法：適用于放線菌、霉菌等絲狀微生物。d、檢出營養(yǎng)缺陷型逐個測定法(點種法)把經(jīng)誘變處理并淘汰野生型后的菌液在完全培養(yǎng)基上涂布分離，將培養(yǎng)后長出的每—個茵落分別點種在基本培養(yǎng)基和另一個完全培養(yǎng)基上，培養(yǎng)一段時間后，凡在基本培養(yǎng)基上不能生長而在完全培養(yǎng)基的相應位置上能生長的菌落，表明其為營養(yǎng)缺陷型。營養(yǎng)缺陷型突變株的篩選e、鑒定營養(yǎng)缺陷型——生長譜法：將檢出的缺陷型菌株接種在完全培養(yǎng)基上培養(yǎng)，把生長的菌體或孢子經(jīng)離心和無菌水清洗后制成濃度為107-l08個/mL的菌懸液。取0.1m1該懸液與基本培養(yǎng)基混勻倒皿，冷凝并稍干燥后，分區(qū)加沾有各種營養(yǎng)物的濾紙片，培養(yǎng)，觀察生長反應。

生長譜法1.單一營養(yǎng)缺陷型2.非所涂物質營養(yǎng)缺陷型3-4.雙重營養(yǎng)缺陷型5.回復突變型6.高濃度生長因子抑制作用①生長譜法方法簡便；回變和污染不影響結果測定物質可為粉末或紙片

缺陷型的鑒定測定一般應分兩階段：第一階段：測定是哪類物質的缺陷型；第二節(jié)段：根據(jù)第一階段確定的范圍，進一步確定是哪種具體化合物的缺陷型；②組合營養(yǎng)物法：步驟（以氨基酸缺陷型的鑒定為例）：a.將多種營養(yǎng)因子編組；b.將組合液的紙片放在涂菌的基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)；c.結果分析；如：一組：1

2345

二組：26

789

三組：3710

1112

四組：4811

1314

五組：59121415營養(yǎng)因子分組編排時注意；1）每組內無重復的營養(yǎng)因子2）每組中應包含只出現(xiàn)一次的因子3）每組中其他因子應分別出現(xiàn)二次

缺陷型的鑒定一組：1

2345

二組：26

789

三組：3710

1112

四組：4811

1314

五組：59121415③組合補充培養(yǎng)基法：將待測的菌點種到各種補充培養(yǎng)基上，逐個分析各菌的缺陷類型，或快速分離出所需缺陷類型的菌株。ABFEDCHG

缺陷型的鑒定★缺陷型的應用作為菌株的遺傳標記：進行基因工程、誘變育種、研究代謝過程時用作親本標記；作為生產(chǎn)菌種：aa、核苷酸等生產(chǎn)菌種;作為aa、維生素、堿基的測定菌株。第三節(jié)基因重組與雜交育種一、原核微生物的基因重組二、真核微生物的基因重組一、原核生物的基因重組一)轉化(transformation)概念受體菌直接吸收供體菌的DNA片斷而獲得后者部分遺傳性狀的現(xiàn)象。通過轉化形成的后代，稱為轉化子，有轉化活性的外來DNA片斷為轉化因子。微生物的種類：十分普遍感受態(tài)(competence)指受體細胞最易接受外源DNA片段并能實現(xiàn)轉化的一種生理狀態(tài)。轉化過程：S.pneumoniae(G+)轉染：指用提純的病毒核酸(DNA或RNA)去感染其宿主細胞或其原生質體，可增殖出一群正常病毒后代的現(xiàn)象。轉化過程感受態(tài)細胞的建立用人工方法提高受體菌的感受態(tài)水平DNA的結合與攝取首先供體菌的dsDNA與受體菌細胞表面上的接受位點相結合，其中一條鏈被細胞表面上的核酸酶水解，水解產(chǎn)生的能量協(xié)助把另一條鏈推進受體細胞。轉化因子與染色體重組來自供體菌的ssDNA片斷與雙鏈結構受體染色體DNA同源片斷發(fā)生交換重組，形成一小段雜合DNA區(qū)段；然后受體菌染色體進行復制，于是雜合區(qū)也隨之得到復制，細胞分裂后，形成一個轉化子(strR)和一仍保持受體菌原來基因型(strS)的子代。供體(strR)dsDNA感受態(tài)受體(strS)酶解與吸收單鏈同源區(qū)段配對單鏈整合復制與分裂轉化子(strR)非轉化子(strS)轉化過程示意圖一、原核微生物的基因重組二)轉導(transduction)概念通過缺陷噬菌體為媒介，把供體細胞的小片段DNA到受體細胞中，通過交換與整合，使后者獲得前者部分遺傳性狀的現(xiàn)象。由轉導作用而獲得部分新性狀的重組細胞，稱為轉導子。種類1、普遍轉導2、局限性轉導3、溶原轉變1、普遍轉導概念通過極少數(shù)完全缺陷噬菌體(噬菌體內僅含有供體DNA)對供體基因上任何小片段DNA進行誤包(錯誤的裝配)，而將其遺傳性狀傳遞給受體菌的現(xiàn)象。一般用溫和噬菌體為媒介。分類完全普遍轉導：簡稱普遍轉導或完全轉導。流產(chǎn)普遍轉導：簡稱流產(chǎn)轉導病毒感染供體細菌子代病毒含病毒DNA的顆粒含宿主DNA的轉導顆粒感染感染受體細胞噬菌體生長重組產(chǎn)生更多的病毒顆粒轉導子由P22噬菌體引起的完全普遍轉導流產(chǎn)轉導示意圖宿主的DNA2、局限性轉導概念指通過部分缺陷(含有部分宿主的DNA)的溫和噬菌體把供體菌的少數(shù)特定基因攜帶到受體菌中，并與后者的基因整合、重組，形成轉導子的現(xiàn)象。特點 ①只局限于傳遞供體菌核染色體上的個別特定基因，一般為噬菌體整合位點兩側的基因②該特定基因由部分缺陷的溫和噬菌體攜帶③缺陷噬菌體的形成是由于它在脫離宿主核染色體過程中，發(fā)生低頻率(10-6)誤切(反常切除)④局限轉導噬菌體的產(chǎn)生要通過UV等因素對溶源菌的誘導并引起裂解后產(chǎn)生。分類低頻轉導和高頻轉導2、局限性轉導低頻轉導LFT)通過一般溶源菌釋放的噬菌體所進行的轉導，只形成極少數(shù)(10-4~10-6)轉導子。高頻轉導HFT)通過對雙重溶源菌的誘導所釋放的噬菌體所進行的轉導，可形成高達50%左右的轉導子。同時有兩種噬菌體整合在細菌的染色體上前噬菌體：沒有感染力圖1.1-4細菌受噬菌體感染后的兩種反應

A.裂解反應B.溶原性反應自發(fā)或誘導變異營養(yǎng)態(tài)游離態(tài)整合態(tài)一、原核微生物的基因重組三)接合(conjugation,mating)概念：供體菌(“雄性”)通過性菌毛與受體菌(“雌性”)直接接觸，把F質?；蚱鋽y帶的不同長度的核基因組片斷傳遞給后者，使后者獲得若干新遺傳性狀的現(xiàn)象。接合之后的受體細胞稱接合子。能進行接合的微生物：細菌和放線菌E.coli的雜交實驗E.coli的4種接合型菌株與F因子E.coli的雜交實驗A+B+C-D-A-B-C+D+[+]離心后洗凈A+B+A-B-C-D-C+D+A+B+C+D+2×1081×1081×1082×108無菌落生長無菌落生長研究細菌接合的營養(yǎng)缺陷型法原理A,B,C,D：met,bio,thr,leu[-][-][-]E.coli的4種接合型菌株與F因子100/0255075轉移區(qū)tra復制區(qū)rep轉座因子F因子

即F質粒，又稱致育因子或性因子，是小分子的DNA，長約6×104bp，約為E.coli染色體的2%。1、F+菌株即“雄性”菌株，指細胞內存在一至幾個F質粒，并在細胞表面著生一至幾條性菌毛的菌株。當F+菌株與F-菌株接觸時，通過性菌毛的溝通和收縮，F(xiàn)質粒由F+菌株由“滾環(huán)模型”轉移至F-菌株中，同時F+菌株中的F質粒也獲得復制，使兩者都成為F+菌株。F因子以很高的頻率傳遞，但含F(xiàn)因子的宿主細胞的染色體DNA一般并不被轉移。F+×F–