第4章 藥物定量分析與分析方法驗證

第四章藥物定量分析與

分析方法驗證蘇州大學藥學院藥物分析教研室第一節(jié)定量分析樣品的前處理方法一、概述前處理（預處理）的目的1）提高分析方法的選擇性：主要以分離提取為基礎的預處理方法。分離有離線（沉淀、萃取等等）和在線（色譜、預柱等等）兩類。2）提高分析方法的靈敏度：主要以待測組分的富集為基礎的預處理方法。如固體萃取、色譜柱切換技術。藥物分析的預處理1）原料藥：由于高純度，多數不需要預處理。2）制劑：一般需要預處理。（參見Chapter12)3）含特殊元素的藥物：如金屬、鹵素、硫、磷、氮等，需要預處理。含特殊元素的藥物預處理的目的含金屬、鹵素、硫、磷、氮等特殊元素的藥物，其藥物定量分析通常利用其無機狀態(tài)進行測定，而含鹵素藥物（特別是芳香性鹵素藥物）往往會出現多種鹵素異構體的混和藥物，其鹵素反應的差異性難于同時準確確定。因此，它們在分析前需要經過不同方法進行預處理。前處理方法：

基于特殊元素在分子中結合的牢固程度而選用不同的方法，通常分為兩種，即1）不經有機破壞的分析方法2）經有機破壞的分析方法二、不經有機破壞的分析方法（一）直接測定法適用性：此法應用于在水溶液中可以電離、不需有機破壞即可直接測定的藥物：1）凡金屬原子不直接與碳原子相連的含金屬藥物（如有機酸和酚的金屬鹽）2）金屬原子直接與碳原子相連，但鍵結合不牢固的有機金屬藥物。（二）經水解后測定1.堿水解后測定法適用性：本法適于鹵素結合不牢固的有機藥物。例：鹵素與脂肪碳鏈相結合。方法：將含鹵素的有機藥物溶于適當溶劑中，加氫氧化鈉溶液或硝酸銀溶液加熱回流使其水解，將有機結合的鹵素轉變?yōu)闊o機鹵素離子，再選用間接銀量法測定。例：三氯叔丁醇的含量測定

2、酸水解后測定法本法將含有金屬的有機藥物經酸水解，將有機金屬轉變?yōu)榭扇苄缘臒o機金屬鹽，再進行配位滴定或剩余酸堿滴定，從而間接確定藥物含量。如：硬脂酸鎂的測定（三）經氧化還原后測定法1、堿性還原后測定適用性：鹵素碘結合于芳環(huán)上的藥物。方法：由于碘的結合較牢固，須在堿性溶液中加還原劑（如鋅粉）回流，使碳碘鍵斷裂，形成無機碘化物后測定。如：泛影酸測定

2、酸性還原后測定法例：碘番酸的含量測定：在醋酸酸性條件下用鋅粉還原，使碳一碘鍵斷裂，形成無機碘化物后用銀量法測定。3、利用藥物中可游離的金屬離子的氧化性測定含量（1）含銻藥物利用五價銻有機藥物中可游離Sb5＋的氧化性，在酸性溶液中氧化碘化鉀，并定量析出碘，可用硫代硫酸鈉滴定液滴定。（2）含鐵藥物含鐵藥物加酸溶解后，游離出Fe3+，利用其在酸性溶液中氧化碘化鉀，析出的碘可用硫代硫酸鈉滴定液滴定。三、經有機破壞的分析方法適用性：在含金屬、鹵素、氮、磷、硫的有機藥物結構中，這些特殊元素與碳原子結合牢固者，需采用有機破壞，使元素的有機結合轉變?yōu)闊o機結合后進行含量測定。方法：濕法破壞、干法破壞（其中包括高溫熾灼法、氧瓶燃燒法）。（一）濕法破壞適用性：主要用于含氮有機藥物，包括生物制品中含氮元素以及蛋白質分析。方法：主要以硫酸作為分解劑（消解劑、消化劑），以氧化劑（如硝酸、高氯酸、過氧化氫等）作為輔助分解劑，從而實現氮元素從有機結合向無機結合的轉化。凱式定氮法：Ch.P收載的“氮測定法”，收載了“第一法（常量法）”和“第二法（半微量法）”。1）基本原理消化：在硫酸銅催化下，以硫酸作為氧化劑，同時以無水硫酸鈉（或硫酸鉀）提高硫酸沸點，以提高消化溫度，使藥物完全有機破壞，轉變?yōu)槎趸?、水、氨，氨被過量的硫酸吸收，成為硫酸銨鹽。堿化與水蒸氣蒸餾：將消化后的硫酸銨鹽，經氫氧化鈉溶液堿化，釋放出氨氣，并隨水蒸氣蒸餾而逸出消化體系，并被硼酸溶液吸收。滴定：將氨的硼酸吸收液用硫酸滴定液滴定。2、方法第一步：消化在長頸的、硅玻璃或硼玻璃制的凱氏燒瓶中完成，并在瓶口放置一個小漏斗。注意：1）稱量紙一同放入消化；2）燒瓶45°斜置；3）開始炭化緩緩加熱，過后強熱至沸騰，并間息性旋轉燒瓶；4）應在通風櫥內進行。第二步：堿化與水蒸氣蒸餾：“常量法”在消化瓶中進行，而“半微量法”將消化液轉移至蒸餾裝置中進行（SeeFig.4-1inP82)。注意：1）消化液放冷后，緩緩沿瓶壁加水稀釋，振搖，以防止?jié)饬蛩嵯♂寗×曳艧岫校?）稀釋液放冷后，沿瓶壁緩緩加入氫氧化鈉溶液堿化，此時不能振搖，使消化液與堿液分層，防止堿化。第三步：將蒸餾后的吸收液進行滴定。注意：本法須空白試驗校正，即從第1－3步的所有過程同時操作，僅僅是不取供試品，但需要加入同樣大小同時材質的濾紙進行消化。（二）干法破壞適應性：適用于濕法不易破壞完全的有機物(如含氮雜環(huán)類有機藥物)，以及鹵素、硫、磷等有機藥物。不適用于含易揮發(fā)性金屬(如汞、砷等，個別砷化合物除外)有機藥物的破壞。1、高溫熾灼法將有機物灼燒至完全灰化而分解藥物。注意事項：1、應控制溫度在420℃以下，以防止某些被測金屬化合物的揮發(fā)。2、灰化必需完全，其檢查方法為：將灰分放冷后，加入稍過量的稀鹽酸－水(1：3)或硝酸－水(1：3)的混合液，振搖，若溶液呈色或有不溶性有機物，則灰化不完全，還需繼續(xù)灰化。3、經本法破壞后，所得灰分往往不易溶解，此時切勿棄去。2、氧瓶燃燒法適應性：適于鹵素有機藥物、含硫、氮、硒等其他元素的有機藥物。方法：將有機藥物放入充滿氧氣的密閉燒瓶中進行燃燒，將產生的欲測物吸收于吸收液（多為水或水與氫氧化鈉的混合液）中，再用適宜方法測定。第二節(jié)定量分析方法特點一、容量分析法定義：容量分析法是將已知濃度的滴定液由滴定管滴加到待測藥物的溶液中，直到所加滴定液與被測藥物按化學計量反應完全為止，再根據滴定液濃度和消耗體積計算被測物含量

（一）容量分析法的特點滴定反應具有確定的等當點（即滴定液與藥物完全作用所達到的化學計量點）。在實際分析中，滴定終點（即指示劑變色點）與等當點不可能相同，必然產生滴定誤差（即滴定終點與等當點之間的誤差）。需選合適的指示劑，使滴定終點盡可能接近等當點。該法常用于測定高含量或中含量組分，即含量在1%以上，其相對誤差可達0.2%以下。（二）容量分析法的計算問題1、滴定度——指每1ml某摩爾濃度的滴定液所相當的被測藥物重量(mg)。2、滴定度(T)的計算在容量分析中，被測藥物（B）與滴定液（A）之間按一定摩爾比反應，其反應式為：aA+bB—

cC+dD滴定度按下式計算：T=M×(b/a)×B(mg/ml)其中，M——滴定液的摩爾濃度，b——被測藥物的摩爾數，a——滴定液的摩爾數，B——被測藥物的毫摩爾質量（分子量）3.百分含量計算

常用于直接滴定法和回滴定法。（1）直接滴定法：滴定液直接滴定，以求含量。（2）回滴定法（剩余滴定法）先加入一定過量的滴定液A，使其與被測藥物反應，反應完后，用另一滴定液B來回滴反應中剩余的滴定液A。二、光譜分析法光譜：當物質與輻射能相互作用時，物質內部發(fā)生能級躍遷。記錄由能級躍遷所產生的輻射能隨波長的變化所得的圖譜。光譜分析法：利用物質的光譜進行定性定量和結構分析的方法稱為光譜分析法，簡稱光譜法。常用的光譜分析法1、紫外－可見分光光度法2、紅外分光光度法3、熒火分析法4、原子吸收分光光度法（一）紫外可見分光光度法1、原理：物質分子對波長200—760nm范圍內的紫外可見電磁波將吸收而發(fā)生分子內電子能級躍遷，該躍遷產生的光譜是物質的特性參數，具此可建立其分析方法。特點:靈敏度高（可達10-4~10-7

g/ml）

準確度高（RSD2--5%)便宜、應用廣泛

2.朗伯-比耳定律A=ELC其中，A－－吸收度，L－－光程（或溶液厚度），C－－溶液濃度，E－－吸收系數，即單位濃度、單位液層厚度時溶液的吸收度。對于一定的溶液，E是波長的函數。吸收系數的兩種表達方式：1）摩爾吸收系數：在一定波長下，C＝1mol/L,L=1cm時的吸收度，用

表示。2）百分吸收系數：在一定波長下，C＝1%（i.e.1g/100ml，按被測物的干燥品或無水物計算),L=1cm時的吸收度，用表示。3.儀器校正和檢定儀器：（見圖）波長校正：汞燈或氘燈特征譜線校正法。吸收度校正：重鉻酸鉀硫酸溶液校正法，按規(guī)定測定的百分吸收系數與標準值相比較，其相對偏差在1%內。雜散光檢查：按規(guī)定測定透光率應符合標準。4、對溶劑的要求以空氣為空白，在1cm的石英池中測定溶劑的吸收度應符合標準，以消除溶劑的末端吸收或溶劑的純度不達標.標準：1）220－240nm不得超過0.402）241－251nm不得超過0.203）251－300nm不得超過0.104）300nm以上不得超過0.055.測定法(1)對照品比較法(2)吸收系數法(3)比色法(二)熒光分析法方法：對照品比較法其中，Ci－－供試品溶液濃度，Ri－－供試品溶液熒光強度，Rib－－供試品溶液試劑空白熒光強度，Cr－－對照品溶液濃度，Rr－－對照品溶液熒光強度，Rrb－－對照品溶液試劑空白熒光強度.特點1）高靈敏度：可達10-10-10-12g/ml2）需要在低濃度下測定：高濃度容易出現熒光熄滅現象，并有熒光吸收作用，使偏離線性范圍。3）熒光物質較少，常常需要衍生化。三、色譜分析法(一)高效液相色譜(HPLC)法高效液相色譜(HighPerformanceLiquidChromatography)，也可稱為高壓液相色譜(HighPressureLiquidChromatography),i.e.HPLC，基于其用途現存在兩類：分析型、制備型。其儀器的基本組件相似（以下講分析型）。儀器基本組成：基線：檢測器中只有流動相通過或雖有組分通過而不能為檢測器所檢出時，所給出的流出曲線。正?；€應為一條平行于橫軸(時間軸)的直線。漂移：基線隨時間朝某一方向的緩慢變化稱為漂移色譜曲線和色譜峰1、對儀器的一般要求色譜柱：常用規(guī)格為4.6250mm5um（1）正相：常用柱為硅膠柱、化學鍵合硅膠柱（即鍵合極性基團如：氰基-CN、氨基-NH2的硅膠柱）（2）反相：常用化學鍵合硅膠柱（即鍵合弱或非極性基團如：十八烷基（C18、ODS）、辛基（C8）的硅膠柱）流動相的組分和流速：正相常用非極性的正已烷、環(huán)已烷等與弱極性的異丙醇、乙腈、甲醇組合；反相常用弱極性的乙腈、甲醇與強極性的水組合。流速常用1ml/min.柱溫常為室溫，進樣量常為10ul.檢測器：常為UV、PAD（DAD），有時也使用蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）和MS。使用ELSD和MS時，流動相不能使用鹽。2、系統(tǒng)適用性試驗要求：用規(guī)定的對照品對儀器進行試驗和調整，應達到規(guī)定的要求，或規(guī)定分析狀態(tài)下色譜往的理論板數、分離度、重復性和拖尾因子應達到規(guī)定的要求?；局笜耍荷V柱的理論板數(n)、分離度、重復性、拖尾因子。(1)、色譜柱的理論板數(n)

在選定的條件下，注入供試品溶液(或該品種項下規(guī)定的內標物質溶液)，其理論板數為：n=5.54(tR/Wh/2)2其中，tR——供試品主成份或內標物質峰的保留時間，Wh/2——半高峰寬。標準：n應達到該品種項下規(guī)定的最小理論板數，否則，應改變色譜條件其達到要求。(2)、分離度(R)

為便于準確測量，要求定量峰與其它峰或內標峰之間有較好的分離度。分離度(R)的計算公式為；R=2(tR2-tR1)/(W1+W2)其中，tR為保留時間，W為峰寬度。除另外有規(guī)定外，分離度應大于1.50(3)、重復性用各品種項下的對照品溶液，以相同條件連續(xù)進樣5次，除另有規(guī)定外，峰面積的相對偏差不大于2.0%。對于內標法，也可按各該品種校正因子測定項下，配制相當于80%、100%、120%的對照品溶液，加入規(guī)定量的內標溶液，配成三種不同濃度的溶液，分別進樣3次，除另有規(guī)定外，平均校正因子的相對偏差不大于2.0%。(4)、拖尾因子（T）T=W0.05h/(2d1)其中，W0.05h為0.05峰高處的峰寬度，d1為峰極大至峰前沿的距離。除另外有規(guī)定外，T應在0.95－1.05之間。T>1.05即為拖尾峰，T<0.95即為前延峰。3、測定法內標法、外標法(1)內標法

確定藥物待測有效組分的校正因子(f)：取一定量樣品，在相同條件下分別測定內標物和藥物對照品的峰面積或峰高，從而確定f。f=(AS/CS)/(AR/CR)其中，A－－峰面積或峰高，C－－濃度，S－－內標物，R－－藥物對照品。

測定藥物待測有效組分：取一定量含有內標物的供試品溶液，測定內標物和待測有效組分的峰面積或峰高，從而確定待測組分濃度。CX=(f

AX)/(A’S/C’S)

(2)外標法比較標準：供試品的對照品或標準品。

方法：標準曲線法、外標一點法。

標準曲線法：用一系列不同濃度的標準溶液，測定濃度與峰面積或峰高的關系曲線。然后在相同條件下測定供試品的峰面積或峰高，再依據標準曲線確定其濃度。

外標一點法：在相同條件下分別測定供試品和對照品溶液的峰面積或峰高，依據下式確定供試品濃度：CX=(CR

AX)/AR(二)氣相色譜法1.對儀器的一般要求：色譜柱（填充柱或毛細管柱）、載氣（常為氮氣）及其流速、柱溫、氫火焰離子化檢測器的檢測條件、進樣量。

2.系統(tǒng)性實驗：同高效液相色譜法項下規(guī)定3.測定法：同高效液相色譜法下規(guī)定第三節(jié)藥品質量標準分析方法驗證驗證目的：對測定方法的效能進行評價，其指標可作為建立新的測定方法的實驗研究依據，證明所采用的方法適合于相應的檢測要求。分析方法效能評價指標：通常包括準確度、精密度（包括重復性、中間精密度、重現性）、專屬性、檢測限、定量限、選擇性、線性與范圍、耐用性。驗證項目：1）鑒別；2）檢查（即雜質定量或限度檢查）；3）含量測定；4）溶出度、釋放度檢查中的定量測定方法；5）輔料的測定。一、精密度精密度（precision)：指在規(guī)定的測定條件下，同一個均勻樣品，經多次取樣測定所得結果之間的接近程度。目的：考察分析方法在不同時間、人員、實驗室之間，測定結果的重復性和重現性。驗證的范圍：凡是定量測定項目，如含量測定、雜質定量測定。（一）表示方法1）偏差（deviation,i.e.D)2）標準偏差(standarddeviation,i.e.SD)3）相對標準偏差(relativestandarddeviation,i.e.RSD)注意：常用標準偏差、相對標準偏差表示精密度。

1.偏差某一次測定值與該樣本多次取樣測定的平均值的偏離，即di=測定值－平均值＝Xi-Xmean(1)相對偏差(relativedeviation):RD＝(di/Xmean)×100％(2)最大相對偏差:基于分析要求而確定的最大允許RD（即允許值），對于不同的分析方法其允許值不完全相同。

2.標準偏差（standarddeviation)3.相對標準偏差(relativestandarddeviation)RSD＝(S/Xmean)100%藥物分析對RSD的一般要求：1)、容量法：5個平行的原料藥精制樣本的RSD不大于0.2%.2)、UV：3－5個平行的一定濃度的原料藥精制樣本的RSD不大于1%.3)、HPLC：3－5個平行的一定濃度的原料藥精制樣本的RSD小于2%.（二）質量標準的驗證內容：重復性、中間精密度、重現性1、重復性在較短的時間間隔內，在相同條件下，由同一個分析人員測定所得結果的精密度，即重復性，或批內精密度。方法1)在規(guī)定的“范圍”內，至少選用9個測定樣本，通常為高、中、低濃度各至少取3個供試品溶液。2）將相當于100%水平的供試品溶液，用至少測定6次的結果進行評價。2.中間精密度在同一個實驗室，由實驗室內部條件改變（如：不同時間由不同分析人員用不同設備）測定結果的精密度。目的：為了考察相同實驗室的不同因素（時間、人員和設備）對方法的影響。方法：通常對時間、人員、設備等因素進行實驗設計，對不同因素分別進行考察和評價。3.重現性

在不同實驗室由不同分析人員測定結果的精密度。目的：為了考察不同實驗室的不同因素（時間、人員和設備）對方法的影響。為法定標準的必須驗證項目。方法：對不同因素分別進行實驗設計與考察。二、準確度

準確度（accuracy)：指用該方法測定的結果與真實值或參考值接近的程度,表示分析方法測量的正確性。測定與表達方式：常用加樣回收法測定，用回收率(%)表示。在已知含量的藥物中多次加入一定量的待測組分的標準品（或對照品或已知含量的原料藥）制備為多個測試品進行實驗，據此計算加樣回收率?；厥章?%)＝(平均測定量－原藥物含量)×100％/加入量（一）含量測定方法的驗證1、原料藥用已知含量的對照品或供試品進行測定：在已知含量的藥物中加入原料藥對照品或已知含量的供試品測定回收率，即回收率(%)＝(平均測定量－原藥物含量)×100％/加入量用本法與已知準確度的另一方法分別測定供試品，其結果進行比較。2、制劑向空白輔料和其它組分組成的樣品中，加入被測組分對照品（或已知含量的原料藥）測定回收率，即回收率(%)＝(平均測定量－空白值)×100％/加入量向制劑中，加入被測組分對照品（或已知含量的原料藥）測定回收率，即回收率(%)＝(平均測定量－本底值)×100％/加入量用本法與已知準確度的另一方法分別測定供試品，其結果進行比較。（二）雜質定量測定方法驗證雜質測定方法多采用色譜法。向原料藥或制劑中加入已知含量的雜質對照品，進行加樣回收率測定。若不能獲取雜質對照品，用本法與已知準確度的另一方法分別測定供試品，其結果進行比較。在色譜法，若不能獲取雜質的校正因子（或在其它儀器方法中不能獲取其響應因子）（如：沒有對照品），可用藥效主成分的校正因子（或響應因子）近似計算雜質含量，但必須明確指出雜質或雜質總量相對于該主成分的峰面積比(%).（三）數據要求1）回收樣本：在規(guī)定范圍內,至少用9次測定結果進行評價，即通常對高、中、低三種濃度的樣本每個測定3－5次，確定每種濃度的回收率，且三種濃度的RSD均應符合要求。2）作為比較標準的原料藥或空白輔料：含量測定也要求3－5次，其RSD應符合要求，以其平均值作為比較標準。3）回收率的RSD:一般要求為2%以內。4）回收率的一般要求：容量法：99.7-100.3%；UV和HPLC：98-102%。生物樣品：85－115%(濃度

200

g),80-120%(濃度

200

g).三、專屬性專屬性：指在其他成分（如雜質、降解產物、輔料等）可能存在下，采用的方法能準確測定出被測物的特性。若一個方法的專屬性較差，可用多個方法組成一個專屬性較強的方法組。藥物分析中專屬性考察的范圍：鑒別反應、雜質檢查、含量測定。（一）鑒別反應目的：與可能共存的組分或存在的結構相似的組分能夠區(qū)分。方法要求：1）不含被測組分的樣本，呈陰性反應；2）含有結構相似組分的樣本，或含有“有關物質”檢查項的組分（即可能共存組分）的樣本，呈陰性反應。（二）含量測定與雜質測定1、用代表性圖譜表示專屬性：在圖中標明各成分的