工業(yè)微生物育種學(xué)4

本節(jié)內(nèi)容第五章工業(yè)微生物育種誘變劑第一節(jié)物理誘變劑第二節(jié)化學(xué)誘變劑第五章

工業(yè)微生物育種誘變劑誘變劑凡能誘發(fā)生物基因突變，并且突變頻率遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)自發(fā)突變的物理因子或化學(xué)物質(zhì)，稱(chēng)為誘變劑。它們包括物理誘變劑、化學(xué)誘變劑和生物誘變劑。不同的誘變劑誘發(fā)的突變體的功能類(lèi)型是不同的。最早的誘變劑是1927年用X射線(xiàn)誘發(fā)果蠅遺傳性狀變異時(shí)發(fā)現(xiàn)的。第一節(jié)物理誘變劑21世紀(jì)是生物學(xué)的世紀(jì)生物學(xué)在21世紀(jì)進(jìn)入了一個(gè)飛速發(fā)展的時(shí)期，而且它還帶動(dòng)了其他學(xué)科的進(jìn)步。生物學(xué)和其他學(xué)科間形成了很多的交叉學(xué)科。在物理學(xué)方面有生物物理學(xué)、生物力學(xué)、放射生物學(xué)、生物材料學(xué)等等。紫外線(xiàn)X射線(xiàn)γ射線(xiàn)快中子α射線(xiàn)β射線(xiàn)激光微波等離子可見(jiàn)光紅外線(xiàn)物理誘變劑的實(shí)質(zhì)事實(shí)上，物理誘變劑都是以量子為單位的可以發(fā)射能量的射線(xiàn)。我們把生物體或者其他實(shí)體放在各種射線(xiàn)下接受照射的過(guò)程稱(chēng)為輻射。根據(jù)輻射對(duì)物質(zhì)基本結(jié)構(gòu)的影響，可將它們分成非電離輻射和電離輻射。非電離輻射射線(xiàn)在穿過(guò)物質(zhì)時(shí)，使該物質(zhì)的分子或原子中的內(nèi)層電子提高能級(jí)，但并不得到或丟失電子，因此不產(chǎn)生離子，故稱(chēng)為非電離輻射。如紫外線(xiàn)電離輻射一些高能射線(xiàn)在照射并穿過(guò)物質(zhì)的過(guò)程中，能把該物質(zhì)分子或原子上的電子擊中而產(chǎn)生正離子，故稱(chēng)電離輻射。產(chǎn)生的正離子數(shù)量隨著射線(xiàn)發(fā)射的能量增高而增加。如X射線(xiàn)、γ射線(xiàn)和快中子等?？熘凶佑悬c(diǎn)特別。它本身是不帶電荷的粒子，不直接產(chǎn)生電離，但是它可使吸收中子物質(zhì)的原子核被撞擊出質(zhì)子。一、輻射引起生物變異的原因和生物效應(yīng)由輻射引起生物的基因突變不是一個(gè)簡(jiǎn)單的過(guò)程。其作用過(guò)程通常分為物理、物理-化學(xué)、化學(xué)和生物等幾個(gè)階段。當(dāng)輻射線(xiàn)處理生物細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞首先接受輻射能量，穿過(guò)細(xì)胞壁、膜、質(zhì)，最后與DNA接觸，產(chǎn)生一系列的化學(xué)反應(yīng)，從而有可能使DNA發(fā)生以下一些變化。輻射引起的DNA變化紫外線(xiàn)使DNA鏈上的兩個(gè)嘧啶堿基形成嘧啶二聚體。DNA鏈斷裂，有時(shí)是單鏈，有時(shí)是雙鏈，在有關(guān)酶的作用下，可能使DNA重新排列組合。嘧啶堿基或嘌呤堿基被氧化脫氨基作用。堿基分子結(jié)構(gòu)中碳與碳之間的鏈斷裂形成開(kāi)環(huán)現(xiàn)象。一個(gè)核苷酸被輻射能擊中后使堿基或磷酸酯游離出來(lái)。在DNA分子的一條單鏈堿基之間或兩條鏈的堿基之間發(fā)生交聯(lián)作用。關(guān)于輻射引起的生物效應(yīng)輻射引起的生物效應(yīng)與射線(xiàn)種類(lèi)和微生物的種類(lèi)有關(guān)。同一種射線(xiàn)對(duì)不同的微生物其效應(yīng)也不一樣，這與每種微生物修復(fù)系統(tǒng)的強(qiáng)弱不同有關(guān)。電離輻射主要引起DNA上的基因突變和染色體畸變；非電離輻射主要是形成嘧啶二聚體。物理誘變劑引起微生物的變異或死亡與輻射劑量成正比。在相同的總輻射劑量的條件下，不管是一次連續(xù)照射和分次累加照射（間隔不能太久），也不管是高劑量短時(shí)間照射或低劑量長(zhǎng)時(shí)間照射，其誘變效應(yīng)基本上是相等的。切爾諾貝利核爆炸2011年3月11日爆發(fā)的9.0級(jí)特大地震影響，日本福島核電站反應(yīng)堆發(fā)生氫氣爆炸二、輻射效應(yīng)的影響因子內(nèi)在因素：1微生物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)2遺傳類(lèi)型3修復(fù)系統(tǒng)的強(qiáng)弱環(huán)境因素：1氧氣有氧比缺氧時(shí)的電離輻射效應(yīng)更好2溫度較高的溫度能促進(jìn)氧氣與自由基之間的作用,使射線(xiàn)與DNA接觸過(guò)程所引起的化學(xué)反應(yīng)加速3水分含水量影響細(xì)胞對(duì)輻射的敏感性4可見(jiàn)光能激活光復(fù)活酶的活性，分解紫外線(xiàn)引起的嘧啶二聚體三、非電離輻射——紫外線(xiàn)紫外線(xiàn)波長(zhǎng)范圍是40nm~390nm。紫外線(xiàn)可由紫外燈管產(chǎn)生。要求的設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便、價(jià)格低廉。紫外線(xiàn)誘變效果顯著。誘變頻率高，而且不易發(fā)生回復(fù)突變。因此紫外線(xiàn)是一種使用最早也是沿用最久的應(yīng)用效果最明顯的物理誘變劑。紫外線(xiàn)的誘變作用DNA分子能吸收紫外線(xiàn)光譜。其中嘧啶堿基比嘌呤堿基敏感上百倍。紫外線(xiàn)使DNA分子發(fā)生如下幾種變化：①DNA與蛋白質(zhì)交聯(lián)；②胞嘧啶和尿嘧啶之間的水合作用；③DNA鏈的斷裂；④形成嘧啶二聚體。這是紫外線(xiàn)引起的主要變化。胸腺嘧啶和胸腺嘧啶二聚體單鏈和雙鏈上形成的

胸腺嘧啶二聚體單鏈上的二聚體會(huì)影響到復(fù)制時(shí)的堿基正常配對(duì)。雙鏈上的二聚體會(huì)阻礙雙鏈的分開(kāi)，復(fù)制到這一點(diǎn)就無(wú)法繼續(xù)進(jìn)行，造成DNA鏈的異常。紫外線(xiàn)誘變的自我修復(fù)實(shí)驗(yàn)顯示：光復(fù)活酶在可見(jiàn)光存在的條件下可將DNA上的90%二聚體解聚。各種微生物產(chǎn)生光復(fù)活作用是不同的，而且導(dǎo)致各種微生物光復(fù)活的可見(jiàn)光譜范圍也不一樣。嘧啶二聚體可由光修復(fù)完成，其他DNA結(jié)構(gòu)的變化，如交聯(lián)，水合作用及DNA鏈斷裂等，可由切除修復(fù)和重組修復(fù)等在暗處進(jìn)行。紫外線(xiàn)的有效光譜紫外線(xiàn)的光譜范圍是40nm~390nm，不過(guò)其有效誘導(dǎo)微生物發(fā)生突變的波長(zhǎng)范圍是200nm~300nm，最有效的波長(zhǎng)為253．7nm。因?yàn)镈NA可以吸收的紫外線(xiàn)光譜通常為260nm。這是DNA的特征吸收峰。DNA吸收最好的也就是誘變效果最好的。紫外線(xiàn)照射劑量的表示方法絕對(duì)劑量：用爾格/平方毫米表示，需要用一種劑量?jī)x來(lái)測(cè)定，由于操作比較困難，實(shí)際工作中應(yīng)用較少。紫外線(xiàn)照射劑量的表示方法相對(duì)劑量：用照射時(shí)間表示，劑量與照射時(shí)間成正比關(guān)系，照射時(shí)間長(zhǎng)，劑量就大，只要控制好時(shí)間就可控制劑量。另外，還可用殺菌率來(lái)表示，專(zhuān)家認(rèn)為它比用照射時(shí)間作為劑量單位更準(zhǔn)確，它可以消除燈管不同或者燈管使用年代長(zhǎng)短所造成的有效波長(zhǎng)發(fā)射率不同的誤差。紫外線(xiàn)照射劑量和殺菌率在一定范圍內(nèi)是成正比的，其在殘存細(xì)胞中的變異幅度也有關(guān)系。殺菌率和誘變效果照射劑量越高，殺菌率也越高，在殘存細(xì)胞中的變異幅度也廣。一般認(rèn)為殺菌率以90%~99%效果較好。但也有報(bào)道說(shuō)，較低的殺菌率（70%~80%）有利于正突變型的產(chǎn)生。因此我們要設(shè)法掌握好減少死亡率和提高誘變效果之間的矛盾。紫外線(xiàn)誘變的步驟和方法1斜面培養(yǎng)出發(fā)菌株把細(xì)菌斜面培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期，霉菌或放線(xiàn)菌則培養(yǎng)到孢子剛成熟。

紫外線(xiàn)誘變的步驟和方法2前培養(yǎng)細(xì)菌的前培養(yǎng)以肉湯為主，適量加入核酸類(lèi)物質(zhì)或酵母浸膏等制成的營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基，同時(shí)還應(yīng)加入抑制修復(fù)物質(zhì)，如前面說(shuō)的咖啡堿或異煙肼等。當(dāng)接入的菌體培養(yǎng)到最佳生理狀態(tài)時(shí)，16~24小時(shí)。霉菌、放線(xiàn)菌培養(yǎng)到絕大部分孢子剛剛萌發(fā)。紫外線(xiàn)誘變的步驟和方法3制備菌懸液離心去除培養(yǎng)基，用生理鹽水制備菌懸液，加入玻璃珠震蕩分散，以無(wú)菌濾紙或脫脂棉過(guò)濾，使形成單細(xì)胞，分散程度達(dá)90~95%。要求菌懸液濃度：細(xì)菌約1×108個(gè)/毫升，放線(xiàn)菌107~108個(gè)/毫升，霉菌約106~107個(gè)/毫升。紫外線(xiàn)誘變的步驟和方法4紫外線(xiàn)照射取上述制備好的菌懸液5~6mL于直徑9cm的平板上，并加入2cm長(zhǎng)的磁力攪拌棒。先將紫外燈打開(kāi)預(yù)熱20min，以穩(wěn)定光波。將盛有菌懸液的平板放到磁力攪拌器上，離燈管有一段距離，打開(kāi)平皿蓋，暴露在紫外線(xiàn)下照射一段時(shí)間。邊攪拌邊照射，力求使細(xì)胞均勻吸收紫外線(xiàn)光波。紫外線(xiàn)誘變的步驟和方法為了避免光修復(fù)，在照射的過(guò)程中要在暗室完成，僅可打開(kāi)黃色或紅色燈。另?yè)?jù)國(guó)外報(bào)道，經(jīng)過(guò)紫外線(xiàn)誘變后的菌體可以轉(zhuǎn)入到無(wú)菌試管內(nèi)，并立即浸入冰水中1~2h，在低溫的條件下，細(xì)胞內(nèi)參與突變修復(fù)的各種酶類(lèi)的活性受到抑制，使修復(fù)難以進(jìn)行。紫外線(xiàn)誘變的步驟和方法5后培養(yǎng)照射完畢的菌懸液加入到適合于正突變體增殖的培養(yǎng)基中，在適宜溫度下培養(yǎng)1.5~2h。有些微生物在此階段還可加入酪素水解物、色氨酸或異煙肼等物質(zhì)來(lái)抑制修復(fù)。本階段利用延遲現(xiàn)象的原理，使誘變后的微生物生長(zhǎng)更有利于突變體的繁殖和減少細(xì)胞懸液在儲(chǔ)存過(guò)程中的死亡，并明顯提高突變率。紫外線(xiàn)誘變的步驟和方法6稀釋涂皿取一定量后培養(yǎng)物，作不同程度的稀釋?zhuān)鶕?jù)培養(yǎng)物中的含菌量選擇稀釋倍數(shù)和體積，加到準(zhǔn)備好的平板上，進(jìn)行涂板培養(yǎng)和篩選。紫外線(xiàn)誘變的步驟和方法1斜面培養(yǎng)出發(fā)菌株2前培養(yǎng)3制備菌懸液4紫外線(xiàn)照射5后培養(yǎng)6稀釋涂皿四、電離輻射常用的微生物誘變電離輻射物理誘變劑波長(zhǎng)生物學(xué)效應(yīng)X射線(xiàn)0.06~136nm1脫氧核糖的降解2糖-磷酸骨架的斷裂3喪失嘌呤4堿基的羥基化5自由基和DNA分子反應(yīng)6DNA鏈的斷裂γ射線(xiàn)0.006~1.4nm快中子X(jué)射線(xiàn)和γ射線(xiàn)X射線(xiàn)和γ