第六章 生物技術(shù)與農(nóng)業(yè)

第六章生物技術(shù)與農(nóng)業(yè)第一節(jié)生物技術(shù)與種植業(yè)第二節(jié)現(xiàn)代生物技術(shù)與養(yǎng)殖業(yè)學(xué)習(xí)目的和要求1.掌握植物細胞工程、基因工程和分子標(biāo)記技術(shù)在植物育種中的應(yīng)用。2.掌握動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)及動物胚胎工程技術(shù)的原理及應(yīng)用。3.了解生物技術(shù)在動物生物反應(yīng)器中的應(yīng)用、以及胚胎干細胞技術(shù)在養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用。第一節(jié)生物技術(shù)與種植業(yè)一、植物細胞工程的應(yīng)用二、植物基因工程的應(yīng)用三、分子標(biāo)記及其在植物遺傳育種上的應(yīng)用植物細胞工程的應(yīng)用植物細胞工程與植物育種植物細胞工程與植物快速無性繁殖和脫毒植物細胞工程與種質(zhì)保存植物細胞工程與植物次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)一、植物細胞工程與植物育種利用植物細胞培養(yǎng)技術(shù)進行突變育種

將植物單細胞培養(yǎng)在附加一定化學(xué)物質(zhì)的培養(yǎng)基上，采用生物化學(xué)的方法對植物細胞進行誘變，從細胞水平上大量篩選擬定目標(biāo)的突變體,然后通過愈傷組織培養(yǎng)和植株再生,獲得突變材料,進一步培育成品種或作為育種的原始材料。(一)突變體篩選的目標(biāo)

改良農(nóng)作物品質(zhì)抗病突變體篩選抗鹽突變體篩選抗逆突變體篩選高光效突變體篩選營養(yǎng)缺陷型突變體篩選(二)突變體篩選的方法

1.直接選擇法：主要用于抗性突變體的篩選。其原理是將大量的培養(yǎng)細胞置于抗生素、代謝類似物、某些金屬或非金屬離子等有毒或有害（低溫）的培養(yǎng)基上，使野生型的細胞不能生長，而各種抗選擇條件的突變型細胞能生長，從而達到直接選擇突變體的目的。2.富集選擇法：是在最低培養(yǎng)基上培養(yǎng)誘變處理的細胞，被選擇的突變體細胞不能生長，但能存活，而正常細胞能活躍生長。然后用一種能使生長中的細胞中毒死亡的汰選劑淘汰掉這些細胞，最后未中毒的突變細胞恢復(fù)生長并分離出來。主要用于營養(yǎng)缺陷型突變體的篩選。二、植物細胞工程與植物快速無性繁殖（一）離體快速無性繁殖的概念

利用離體培養(yǎng)技術(shù)，將來自優(yōu)良植株的莖尖、腋芽、葉片、鱗片等器官、組織和細胞進行離體培養(yǎng)。在短期內(nèi)獲得大量遺傳性一致的個體的方法(技術(shù))稱離體無性繁殖。由于這種繁殖方式繁殖數(shù)量大、速度快，因此也稱離體快速無性繁殖。用這種方法得到的植株群體來自一個單株(或一個單芽)，它們的遺傳組成相同，這些株群可稱單株無性系或單芽無性系。（二）離體快速無性繁殖的優(yōu)越性加快繁殖速度培養(yǎng)無毒植株

雜合植株的繁殖

加速繁殖特殊材料

快速無性繁殖的另一優(yōu)越性是將植物的無性繁殖從田間移至室內(nèi)，使生產(chǎn)不受大自然的干擾，使育苗工廠化。（三）離體快速無性繁殖目的擴大繁殖珍稀植物資源和育種原始材料。擴大繁殖經(jīng)濟效益高，但難于繁殖的植物。繁殖和保存經(jīng)過病毒鑒定的無毒原種材料。繁殖銷售量大，但一時用常規(guī)(分株、扦插、播種)方法，難以滿足數(shù)量上需要的植物。（四）離體無性繁殖的程序無菌母株的制備不定芽的增殖完整小植株的形成小植株的馴化和移栽再生植株的鑒定1.無菌母株的概念及其制備方法概念：在無菌條件下，用于試管內(nèi)繼代增殖的植物材料，稱為無菌母株或“小母株”或“繁殖母株”。無菌母株制備的技術(shù)關(guān)鍵

培養(yǎng)材料的滅菌

培養(yǎng)基的篩選培養(yǎng)基篩選的原則如下：

A：因植物種類和品種而異。

B：因培養(yǎng)外植體類型不同而異。

C：因成苗途徑不同而異。2.不定芽的增殖

將獲得的無菌母株，在無菌條件下進行再次切割，繼代培養(yǎng)加速繁殖，使之在每個芽眼處形成叢芽。這種不定芽增殖過程中，可以反復(fù)多次切割培養(yǎng)，使之在短期內(nèi)加大芽的繁殖數(shù)量，以達到快速繁殖的目的。3.完整小植株的形成將繼代增殖的幼嫩小植株，轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)根的分化和根系的形成，最終成為具有根、芽(生長點)的完整小植株。(1)誘導(dǎo)小植株根分化的技術(shù)關(guān)鍵①調(diào)節(jié)激素種類和濃度

A.大多數(shù)植物根分化需適當(dāng)提高生長素水平，降低細胞分裂素水平。B．有些植物除去細胞分裂素，轉(zhuǎn)入僅有生長素的培養(yǎng)基中即可根分化。C.有些植物在無激素條件下即可生根。②調(diào)節(jié)基本培養(yǎng)基營養(yǎng)組成。主要調(diào)節(jié)大量元素中硝酸鹽和銨鹽的含量和比例。③調(diào)節(jié)滲透壓：(2)誘導(dǎo)根分化的方法①培養(yǎng)基內(nèi)誘導(dǎo)根分化②基質(zhì)生根法：將無根小植株插入預(yù)先準備好的基質(zhì)中生根。③嫁接生根法：將無根小植株直接嫁接在砧木上，利用砧木的根系吸取營養(yǎng)和水分。4.小植株的馴化和移栽馴化中要掌握逐步過渡的原則，才能收到良好的效果。移栽前首先要進行日光鍛煉，通過“曬苗”措施恢復(fù)葉綠體光合作用功能。使小苗由異養(yǎng)逐步過渡到自養(yǎng)。第二步進行濕度鍛煉，使小苗逐步適應(yīng)周圍環(huán)境的濕度。移栽時應(yīng)將小苗基部培養(yǎng)基沖洗干凈，以避免有害微生物的侵染。移栽基質(zhì)可根據(jù)植物種類不同選擇基質(zhì)。砂培法必須澆培養(yǎng)液。小苗移植后一定要注意保濕，特別保持較高的空氣濕度，移植10d內(nèi)空氣相對濕度應(yīng)保持在80％～90％，注意土壤或基質(zhì)濕度不可過高。5.再生植株的鑒定(1)鑒定的意義(2)鑒定方法

細胞學(xué)鑒定：對再生株群體抽樣檢查根尖染色體數(shù)目以及減數(shù)分裂期的染色體行為。

形態(tài)鑒定：在田間對再生株的植物學(xué)性狀進行鑒定，發(fā)現(xiàn)變異株再作細胞學(xué)鑒定。(五)用組織細胞培養(yǎng)技術(shù)工廠化

生產(chǎn)試管苗1.利用組織細胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)試管苗的優(yōu)點:

培養(yǎng)組織和細胞生長周期短，可以在短時間內(nèi)生產(chǎn)大量試管苗；

實驗材料易于獲得，它不受季節(jié)、地區(qū)的限制，可隨需要而大量獲得材料。2.用植物組織細胞培養(yǎng)技術(shù)建

立植物的無性系無性系（clone）的生產(chǎn)與試管品種的商品化是目前植物組織培養(yǎng)技術(shù)的主要應(yīng)用之一。無性系的建立是在植物的快速繁殖技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，它的建立可為植物幼苗的工廠化生產(chǎn)打下基礎(chǔ)。3.用植物組織細胞培養(yǎng)技術(shù)建立的

植物無性系的類型器官發(fā)生型(0rganogensis)類胚體發(fā)生型(Embryogensis)原球莖型(Protocorm)器官型(Organtype)不定芽型(Adventitousbudtype)從外植體誘導(dǎo)愈傷組織，經(jīng)愈傷組織細胞的分化培養(yǎng)，可通過形成不定芽而再生成植株的方式。在不定芽上還能不斷地誘導(dǎo)不定芽。器官發(fā)生型的特點：繁殖速度快，由于經(jīng)愈傷組織而再生成植株，遺傳性不穩(wěn)定。優(yōu)點：成苗數(shù)量大，對培養(yǎng)基要求不算高，容易調(diào)配。缺點：通過愈傷組織成苗，細胞的染色體容易發(fā)生數(shù)量和結(jié)構(gòu)變異，很難使再生植株群體保持穩(wěn)定的遺傳性。

由植物器官、組織和細胞培養(yǎng)通過形成類胚體，再由類胚體經(jīng)由球形期、心形期、魚雷期、子葉期發(fā)育成成熟胚，由成熟胚再發(fā)育成植株的方式。在成熟的類胚體上還能繼續(xù)不斷地形成新的胚狀體。類胚狀體發(fā)生型的特點：遺傳性一致，有些植物體細胞胚發(fā)生數(shù)量亦相當(dāng)大。如胡蘿卜1L培養(yǎng)基有10萬個以上的胚狀體。

對培養(yǎng)基要求高，器官發(fā)生條件苛刻。繁殖數(shù)量不如不定芽型和器官發(fā)生型多，但遺傳性穩(wěn)定。這種類型的組織細胞培養(yǎng)后可經(jīng)原球莖分化而形成植株。原球莖發(fā)生型是蘭屬特有的器官發(fā)生方式。大部分蘭花屬于這一類型，形成原球莖后就能不斷繁殖下去，這樣就建立起了無性系。種子消毒后，在培養(yǎng)基上播種，經(jīng)一段時間培養(yǎng)而發(fā)生原球莖(帶芽)，然后由原球莖直接長成植株。培養(yǎng)離體的莖、花芽、葉、鱗片等外植體，誘導(dǎo)直接產(chǎn)生不定芽，再生成植株的方式。器官型特點：遺傳性也比較穩(wěn)定，但繁殖速度慢。對培養(yǎng)基要求高，器官發(fā)生條件苛刻。繁殖數(shù)量不如不定芽型和器官發(fā)生型多，但遺傳性穩(wěn)定。

誘導(dǎo)頂端分生組織分化產(chǎn)生不定芽，再生成小植株，再將小植株分段切取，每一段帶一個芽。即選取已經(jīng)發(fā)育成熟的頂芽和腋芽，連同它們的短枝經(jīng)表面滅菌后，在無菌條件下培養(yǎng)，誘導(dǎo)不定芽并使其生根形成植株的方式。不定芽發(fā)生型的特點：不僅繁殖率高，可利用外植體原有的芽，包括隱芽在內(nèi),繁殖數(shù)量大，同時能保持該植物種的遺傳穩(wěn)定性。

容易成苗，對培養(yǎng)基要求不高，后代遺傳性較為穩(wěn)定，但取材受到一定限制，僅限于具有明顯頂端分生組織和次生分生組織的物種。4.植物無性系的工廠化生產(chǎn)技術(shù)植物無性系的工廠化生產(chǎn)的主要程序為小型工廠的設(shè)計、用具的準備、生產(chǎn)方法的選擇等。小型工廠由操作間、培養(yǎng)間、接種間、溫室、貯藏間等組成。操作間用于培養(yǎng)基的制備（20～40㎡）；接種間用于無菌操作（8～16㎡）；培養(yǎng)間用于試管苗的生產(chǎn)（20～40㎡）；溫室用于試管苗的鍛煉及移栽（200～400㎡）。工廠化試管苗生產(chǎn)工藝流程圖所選植株取帶芽莖段材料消毒剪取單芽莖段無菌試管苗剪取單芽轉(zhuǎn)接試管苗原種轉(zhuǎn)接試管苗轉(zhuǎn)接試管苗光培鍛煉沙培鍛煉營養(yǎng)缽苗圃一年生商品苗商品試管苗移出三、無病毒植物的培養(yǎng)植物受病毒危害是一個影響生產(chǎn)的嚴重問題。目前已發(fā)現(xiàn)的植物病毒種類不下500種，嚴重危害著農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。在果樹、蔬菜、花卉、林木以及農(nóng)作物上皆有發(fā)現(xiàn)。隨著生產(chǎn)栽培時間的推移，危害越來越嚴重，發(fā)現(xiàn)的病毒種類也越來越多。許多栽培植物因為感病而嚴重減產(chǎn)，品質(zhì)變劣。(一)脫除植物病毒的原理及方法莖尖培養(yǎng)脫毒法熱處理脫毒法微體嫁接離體培養(yǎng)脫毒法珠心組織培養(yǎng)脫毒法1.莖尖培養(yǎng)脫毒法(1)莖尖培養(yǎng)脫除病毒的依據(jù)

病毒在植物體內(nèi)分布是不均一的，越接近生長點，病毒濃度越稀，因此有可能采用小的莖尖離體培養(yǎng)而脫除植物病毒。康乃馨不同大小莖尖培養(yǎng)與康乃馨斑駁病毒的脫除情況莖尖大小培養(yǎng)數(shù)荊芥鑒定之病斑無病毒莖尖(mm)總病斑接種葉數(shù)每葉平均病斑數(shù)數(shù)目﹪0.133130.22660.2520137612.28400.53011987017.14130.7594291235.31111.044321139.2001.0以上519722098.600已知病毒是DNA大分子，病毒侵染植物后可進入植物細胞。當(dāng)植物細胞分裂時，病毒DNA隨著復(fù)制。因此，植物細胞分裂和病毒繁殖之間存在相互競爭，在迅速分裂的植物細胞中，是正常核蛋白合成占優(yōu)勢，而在植物細胞伸長期間，是病毒核蛋白合成占優(yōu)勢。生長點、分生組織細胞是活躍分裂的細胞，其分裂速度比病毒DNA復(fù)制速度快，故采用旺盛分裂的生長錐(頂端分生組織)離體培養(yǎng)，就有可能脫除植物病毒。(2)莖尖脫毒的原理(3)利用莖尖培養(yǎng)技術(shù)產(chǎn)生無病毒植株的優(yōu)點有些病毒不能侵染種子，因此用種子繁殖能排除大多數(shù)病毒，達到復(fù)壯的目的。但有性過程不能維持無性繁殖作物種性，使用這—方法則受到了限制。利用莖尖分生組織培養(yǎng)是目前最有效的除去病毒的方法，幾乎對所有病毒都有效，且周期短，效率高，還可與植物的快速繁殖相結(jié)合。

同一種病毒在不同植物體內(nèi)分布部位不同。

不同病毒種類在同一種植物中分布部位不同。

莖尖越小對培養(yǎng)基的要求越高，成功率越低。病毒在植物不同種和品種莖尖中分布的部位及脫毒效果

植物種類病毒去除病毒莖尖大小(mm)品種數(shù)甘薯斑紋花葉病毒1.0～2.06縮葉花葉病毒1.0～2.01羽毛狀花葉病毒0.3～1.02馬鈴薯馬鈴薯Y病毒1.0～3.01馬鈴薯X病毒0.2～0.57馬鈴薯卷葉病毒1.0～3.03馬鈴薯G病毒0.2～0.31馬鈴薯S病毒0.2以下5大麗菊花葉病毒0.6～1.01康乃馨花葉病毒0.2～0.85百合各種花葉病毒0.2～1.03鳶尾花葉病毒0.2～0.51大蒜花葉病毒0.3～1.01矮牽牛煙草花葉病毒0.1～0.36菊花花葉病毒0.2～1.03草莓各種花葉病毒0.2～1.04甘蔗花葉病毒0.7～8.012.熱處理脫毒法(1)熱處理脫毒法的依據(jù)和原理:

植物細胞分裂和病毒繁殖之間存在著相互競爭，在旺盛分裂的細胞中是正常核蛋白合成占優(yōu)勢，而在細胞伸長期間是病毒蛋白的合成占優(yōu)勢。因此，加速分生組織細胞的分裂可以獲得無病毒植株。病毒是DNA大分子，病毒進入植物細胞后，隨植物細胞的DNA一起復(fù)制。熱處理并不能殺死病毒，只能鈍化病毒的活性，使病毒在植物體內(nèi)增殖減緩增殖或增殖停止，而失去侵染的能力。

熱處理是一種物理效應(yīng)，與冷處理一樣，它可以加速植物細胞的分裂，使植物細胞在與病毒繁殖的競爭中取勝。(2)熱處理脫除病毒的方法①愈傷組織熱處理脫毒法

方法：從患病植株上取葉片(莖片、鱗片、花器亦可)進行離體培養(yǎng)，誘導(dǎo)形成愈傷組織，然后將愈傷組織反復(fù)繼代培養(yǎng)同時兼用熱處理。常用處理溫度及處理時間：

溫度：37～38℃時間：處理2周、4周或8周；

溫度：50℃時間：3～15min。

反復(fù)繼代兼熱處理，經(jīng)歷一定的時間(繼代次數(shù)需試驗)后，將熱處理過的愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)器官分化。愈傷組織繼代兼熱處理鈍化TMV和CMV獲得無病毒植株的效果

繼代無煙草花葉病毒(TMV)無黃瓜花葉病毒(CMV)

次數(shù)25℃30℃37℃小計25℃30℃37℃小計00/20--0/208/21--8/21

10/200/200/200/605/184/1910/2119/58

20/200/200/200/608/2010/2011/2029/60

32/200/208/2010/6010/208/2011/2029/6040/200/205/205/6054/201/205/2010/60②熱空氣處理脫毒法

方法：將試驗?zāi)钢暝诟邷厣L室中生長一個階段，使其頂端分生組織和次生分生組織迅速生長，然后切取其莖尖分生組織進行離體培養(yǎng)。生長室溫度：35～40℃(注意逐漸升溫)。光照強度：3000～100001x(因植物而異)。所脫除的病毒種類和處理溫度的高低、處理時間長短也有密切關(guān)系。應(yīng)注意病毒種類、處理溫度、處理時間三者之間的協(xié)調(diào)關(guān)系。3.微體嫁接離體培養(yǎng)脫毒法(1)微體嫁接脫毒法的特點:

可以將極小的(﹤0.2mm)莖尖作為接穗嫁接到不帶毒的種子實生苗砧木上。然后連同砧木一起在培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)。接穗在砧木的哺育下很容易成活，故可用很小的莖尖來培養(yǎng)，消除病毒的幾率大，獲得無病毒苗的可能性大。(2)微體嫁接脫毒的方法

砧木(Goldendelicions)種子低溫層積處理后滅菌，把種胚培養(yǎng)在MSA固體培養(yǎng)基上。在25℃黑暗條件下培養(yǎng)15d，使其發(fā)芽。

將MSA固體培養(yǎng)基中發(fā)芽的上胚軸切下(帶2片子葉)，插入帶濾紙橋的試管中，濾紙橋中間有孔，使上胚軸通過小孔而固定。試管中放的是MSB，適于莖尖(接穗)生長的液體培養(yǎng)基。

接穗(Griffith)用其0.2mm大小的莖尖分生組織進行嫁接。采用劈接法將接穗插入兩片子葉中間的組織中。接穗在砧木的哺育下生長發(fā)育。蘋果微體嫁接莖尖大小與脫毒成功率

莖尖大小嫁接莖尖嫁接成功莖尖嫁接成功率(mm)(個)(個)(％)莖原錐(0.08～0.03)20315莖原錐帶2片葉原基(0.1～0.2)201365莖原錐帶4片葉原基(0.3～0.4)201575莖原錐帶6片葉原基(0.6～0.8)2018904.珠心組織培養(yǎng)脫毒法

有人認為病毒是通過維管組織傳播的，而珠心組織與維管組織無直接聯(lián)系，故可以通過珠心組織培養(yǎng)獲得無病毒植株。(Millins（1976)報道，柑橘、葡萄通過珠心組織培養(yǎng)獲得無病毒植株。(二)無病毒植物的鑒定1.血清鑒定法2.生物鑒定法(敏感植物鑒定法)3.電子顯微鏡鑒定法

血清鑒定法基本原理：利用抗原和抗體的特異性結(jié)合，用病毒作為抗原來免疫動物產(chǎn)生抗體（即抗血清），該抗血清只能結(jié)合該種病毒。因而利用抗原和抗體相結(jié)合的“血清反應(yīng)”即可鑒定是否為無病毒植株。動物植物血清反應(yīng)病毒感染人工注射異體蛋白（抗原）動物免疫球蛋白（抗體）帶該種病毒（抗原）

＋玻璃片凝集法示意圖植物汁液對照血清抗血清葉綠體發(fā)生典型凝集現(xiàn)象2.敏感植物鑒定法敏感植物的概念：

有些植物對病毒極為敏感，一旦感染病毒就會在其葉片乃至全株上表現(xiàn)特有的病斑，把這種植物稱為病毒敏感植物或指示植物。敏感植物鑒定病毒的方法：

A.摩擦接種法

B.嫁接法3.電子顯微鏡鑒定法

用電鏡直接觀察經(jīng)脫毒培養(yǎng)的葉片，檢查是否有病毒質(zhì)粒的存在，還可以測量病毒顆粒的大小、形狀和結(jié)構(gòu)。電鏡鑒定法是—種既準確又科學(xué)的方法。莖尖脫毒培養(yǎng)過程三、植物細胞工程與種質(zhì)保存(一)種質(zhì)保存的發(fā)展概況:1.低溫干燥法即減少植物種子含水量，同時利用低溫干燥環(huán)境，來延長種子壽命的方法。該方法是目前保存種質(zhì)最通用的方法。2.減壓貯藏法降低氧壓，以抑制種子呼吸來延長種子壽命。由于對貯藏設(shè)備要求太高，該方法尚未普遍推廣。3.冷處理保存法利用冷處理(4℃左右)的方法，以降低植物細胞的代謝水平，來探索保存無病毒莖尖分生組織和愈傷組織。3.超低溫冷凍保存種質(zhì)超低溫冷凍保存種質(zhì)是指在干冰（-79℃）、超低溫冰箱（-80℃）、液氮的氣相（-140℃）或液態(tài)氮（-196℃）中保存組織和細胞。(二)超低溫冷凍保存種質(zhì)的優(yōu)點在極低的溫度下，細胞停止代謝和生長，也不會發(fā)生變異，因此其遺傳特性可長期保存下來。超低溫冷凍保存也不會喪失細胞的形態(tài)發(fā)生的潛能，因而特別適合各類植物（如珍貴植物和瀕危植物的種質(zhì)保存、雜交育種材料的保存等）的種質(zhì)保存。利用超低溫冷凍保存還可長期貯存脫毒的莖尖分生組織，用于遠緣雜交的花粉、細胞系及花粉胚等。因此，超低溫冷凍保存技術(shù)既可以節(jié)省人力、物力，又可為遺傳育種工作提供性狀穩(wěn)定的材料。(三)超低溫冷凍保存種質(zhì)的原理

常用的冷凍防護劑均屬于低分子量的中性物質(zhì)，這類物質(zhì)在水溶液中能強烈地結(jié)合水分子，水合作用的結(jié)果使溶液的黏度增加。當(dāng)溫度下降時，溶液冰點下降，即冰的結(jié)晶中心增長速度下降，使水的固化程度減弱。

冷凍防護劑的使用提高了培養(yǎng)基滲透壓，導(dǎo)致細胞的輕微質(zhì)壁分離，相對提高了組織和細胞的抗寒力。

二甲基亞砜除上述作用外，還極易滲入細胞內(nèi)部，可防止細胞在冷凍和融冰時引起過度脫水而遭受破壞，起到保護細胞的作用。(四)超低溫冷凍保存種質(zhì)的方法

將離體培養(yǎng)的莖尖分生組織、愈傷組織、懸浮培養(yǎng)細胞、原生質(zhì)體等，經(jīng)冷凍防護劑處理，然后送入-196℃液氮超低溫庫內(nèi)進行“超低溫冷凍”保存。常用的冷凍防護劑種類有甘油、甘露醇、脯氨酸、二甲基亞砜(DMSO)。冷凍防護劑的使用濃度為5％?10％。(五)超低溫冷凍保存種質(zhì)的程序預(yù)培養(yǎng)冷處理降溫冷凍及超低溫保存解凍再培養(yǎng)(1)預(yù)培養(yǎng)提高細胞抗寒力，培養(yǎng)時間3～4周。加速傳代以提高分裂細胞的比例。用甘露醇、糖等提高培養(yǎng)基滲透壓。加入脯氨酸或二甲基亞砜進行短期預(yù)冷處理。(2)冷處理

保存材料的溫度必須降至O℃。

加入冷凍防護劑冷凍保護劑的作用：它們屬于相對低分子質(zhì)量的中性溶質(zhì)，在溶液中以強烈地結(jié)合水分子，發(fā)生水合作用，使溶液中的黏性增加。DMSO易滲透到細胞內(nèi)部，不會導(dǎo)致細胞在冷凍和融冰時因脫水過度受滲透沖擊而損傷。(3)降溫冷凍及超低溫保存降溫冷凍有預(yù)凍、慢速冷凍和快速冷凍三種方法。

預(yù)凍法：加入冷凍防護劑后，使溫度下降-70℃～-20℃范圍內(nèi)進行預(yù)冷，然后再進入-196℃液氮庫超低溫冷凍保存。

慢速冷凍法：在加入冷凍防護劑后，逐漸降低溫度，以每分鐘下降1℃～-5℃的速度降低溫度。待溫度降到-40℃或-100℃時，平衡1h，即穩(wěn)定1h。然后進入-196℃液氮低溫庫，超低溫冷凍保存。

快速冷凍法：在0℃下加入冷凍防護劑二甲基亞砜后，直接進入-196℃液氮庫。(4)解凍

采用迅速解凍法，在30～40℃下迅速解凍，以避免組織和細胞脫水死亡。(5)再培養(yǎng)

根據(jù)植物種類，提供和滿足原來的培養(yǎng)條件進行培養(yǎng)，使細胞恢復(fù)分裂能力。誘導(dǎo)器官分化和植株再生，當(dāng)然對于次生物質(zhì)生產(chǎn)來講，這一步是恢復(fù)高產(chǎn)細胞株的生化合成能力。四.細胞工程與植物次生

代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)(一)利用植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物的意義(二)利用植物組織細胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物的方法（一）利用植物組織培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物的意義

次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)是在可控制的條件下進行的，因此可以通過改變培養(yǎng)條件來篩選新細胞系，得到超越整體植物產(chǎn)量的代謝產(chǎn)物，節(jié)約能源，減少占用耕地面積。

與植物栽培不同而與發(fā)酵工業(yè)相似，不受天氣、地理、季節(jié)等外界環(huán)境因素的影響。而且培養(yǎng)細胞是在無菌條件下生長的，因此可以排除病菌和蟲害的侵擾。

可以進行特定的生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)。

可以探索新的合成路線的獲得新的有用產(chǎn)物。目前已經(jīng)對400多種植物進行過研究,從培養(yǎng)的植物細胞中分離到次生代謝產(chǎn)物有600多種，其中60多種在含量上超過或等于原植物,包括幾十個類別，如核酸、蛋白質(zhì)、酶類、多肽、糖類、脂肪、或單寧類物質(zhì)、維生素、激素、各種植物堿、固醇、植物生長激素等。（二）利用植物組織細胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)次生代謝物的方法1.高產(chǎn)的細胞株的選擇:(1)適于大規(guī)模培養(yǎng)的細胞株有兩個條件：

細胞的生長速度快;次生代謝物含量的積累較高。

(2)篩選細胞株的過程：

愈傷組織的誘導(dǎo)和培養(yǎng):從高產(chǎn)株的產(chǎn)次生產(chǎn)物部位取出部分材料培養(yǎng)成愈傷組織。

單細胞的分離和細胞無性系的分離。

細胞株的篩選:對愈傷組織繼代培養(yǎng)和進行各種化學(xué)分析，以確定次生代謝物的產(chǎn)量。待化學(xué)分析的結(jié)果明確后，將次生代謝物產(chǎn)量最高的細胞塊再繼代培養(yǎng)。2.擴大培養(yǎng)

將篩選到的優(yōu)良細胞株經(jīng)多次擴大繁殖,可培養(yǎng)出大量的細胞，以作為大規(guī)模細胞培養(yǎng)的原種。在培養(yǎng)過程中，要經(jīng)常鑒定細胞株，并進行提純，防止細胞株退化和變異。3.大量培養(yǎng)植物細胞大量培養(yǎng)系統(tǒng)可以分為固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)系統(tǒng)。通常使用的固體培養(yǎng)系統(tǒng)包括有利用瓊脂作為支持物的瓊脂培養(yǎng)和固定細胞。液體培養(yǎng)系統(tǒng)包括小規(guī)模的懸浮培養(yǎng)和大規(guī)模的成批培養(yǎng)、半連續(xù)培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)。植物基因工程的應(yīng)用一、基因工程在植物育種中的應(yīng)用二、基因工程與生物固氮三、利用植物作為生物反應(yīng)器一、基因工程在育種中的應(yīng)用(一)培育抗蟲植物(二)培育抗病毒植物(三)培育抗除草劑作物(四)培育耐受環(huán)境壓力和抗衰老的作物(五)改進農(nóng)產(chǎn)品的品質(zhì)(六)改變花卉顏色、花形和花期(七)植物雜種優(yōu)勢利用的基因工程(一)培育抗蟲植物抗蟲基因的種類：⑴細菌抗蟲基因如Bt毒蛋白基因；⑵植物抗蟲基因：豇豆胰蛋白酶抑制劑基因、馬鈴薯蛋白酶抑制劑-Ⅱ基因、α-淀粉酶抑制劑基因、外源凝集素基因。⑶其它抗蟲基因：真菌的殼多糖酶基因、核糖體滅活蛋白（RIP）基因產(chǎn)物及一些昆蟲的毒素基因都具有一定的抗蟲作用(二)培育抗病毒植物⑴TMV外殼蛋白介導(dǎo)的抗性利用植物病毒外殼蛋白基因，培育抗病毒的轉(zhuǎn)基因植物。⑵病毒復(fù)制酶介導(dǎo)的抗病毒作用

⑶衛(wèi)星RNA介導(dǎo)的抗病毒作用(三)培育抗除草劑作物抗除草劑轉(zhuǎn)基因策略：一是修飾除草劑作用的靶蛋白，使其對除草劑不敏感，或?qū)氚械鞍谆蚴怪^量表達以使植物吸收除草劑后仍能正常代謝；二是引入酶或酶系統(tǒng)，在除草劑發(fā)生作用前將其降解或解毒。(四)培育耐受環(huán)境壓力和抗衰老的作物

抗旱作物基因工程

抗鹽作物基因工程

抗寒作物基因工程

抗早熟作物基因工程

抗氧離子基團基因工程(五)改進農(nóng)產(chǎn)品的品質(zhì)1.改善脂肪酸的質(zhì)量(1)導(dǎo)入硬脂酰ACP脫飽和酶的反義基因,增加飽和脂肪酸含量。(2)導(dǎo)入硬脂酰CoA脫飽和酶基因、油酰基-ACP硫酯酶基因、3-酮酯酰ACP合成酶基因等，降低飽和脂肪酸含量。2.提高種子蛋白的營養(yǎng)價值(1)改良種子貯藏蛋白營養(yǎng)品質(zhì)：①修飾自身種子貯藏蛋白基因，從而改善其編碼蛋白質(zhì)的氨基酸組成；②把能編碼一系列氨基酸序列的外源種子貯藏蛋白基因?qū)肴狈υ摪被嵝蛄械姆N子植物；③利用人工合成的基因改善種子蛋白的含量。(2)改良影響面包烘烤質(zhì)量的種子蛋白特性：①通過增加麥谷蛋白的HMW-亞基基因拷貝數(shù)來增加麥谷蛋白的含量；②引入具有超量Cys殘基的HMW-亞基來產(chǎn)生高交聯(lián)聚合物。3.延遲水果的成熟期(1)應(yīng)用PG反義基因技術(shù)，抑制多聚半乳糖醛酸酶（PG酶）的活性，培育轉(zhuǎn)基因番茄

(2)應(yīng)用反義基因技術(shù)抑制植物體內(nèi)乙烯的合成，延長水果的成熟期,通過干擾乙烯合成的關(guān)鍵酶ACC（氨基環(huán)丙烷酸）合成酶和ACC氧化酶的編碼基因，培育轉(zhuǎn)基因植物。4.修飾淀粉的成分淀粉合成途徑中有三種關(guān)鍵酶—ADPG焦磷酸化酶（AGPP基因）、淀粉合成酶(顆粒凝結(jié)型淀粉合成酶GBSS、可溶性淀粉合成酶SSS）和分支酶（SBE）,其功能及表達活性與植物淀粉的結(jié)構(gòu)和特性密切相關(guān)，因此，通過改變這三種酶的數(shù)量和性質(zhì)，就可達到改變植物體中合成淀粉的結(jié)構(gòu)與質(zhì)量的目的。(六)改變花卉顏色、花形和花期利用基因工程的方法對黃酮類物質(zhì)合成途徑中的酶的基因進行操作，就可培育出具有獨特色澤的花卉。經(jīng)研究表明，同源異型基因表達的加強或減弱都可能會改變花的大小和形狀，而它的表達時間則直接影響植物的花期。因此，可望在不久的將來通過轉(zhuǎn)基因途徑人工控制花形和花期。(七)植物雜種優(yōu)勢利用的基因工程顯性核不育基因和育性恢復(fù)基因的基因工程

利用毒素基因的特異空間表達誘導(dǎo)雄性不育

通過抑制花藥中類黃酮的生物合成誘導(dǎo)雄性不育

通過提前降低胼胝質(zhì)含量誘導(dǎo)雄性不育

通過抑制花粉發(fā)育有關(guān)的基因誘導(dǎo)雄性不育

利用反義RNA技術(shù)創(chuàng)造雄性不育（二）基因工程與生物固氮

采用基因工程技術(shù)將固氮基因直接導(dǎo)入非豆科植物，特別是禾谷類農(nóng)作物，將其轉(zhuǎn)變?yōu)楣痰魑铩?/p>

采用基因工程技術(shù)，提高硝酸鹽還原酶的催化活性，或是在體外修飾基因的表達信號，提高硝酸鹽還原酶的水平，從而使植物使用硝酸鹽的能力得到加強。（三）利用植物作為生物反應(yīng)器1.利用植物生產(chǎn)糖類物質(zhì)2.利用植物生產(chǎn)蛋白質(zhì)和多肽3.利用植物生產(chǎn)可降解的生物塑料的原料三、分子標(biāo)記及其在植物遺傳

育種上的應(yīng)用(一)遺傳標(biāo)記的概念(二)分子標(biāo)記的種類、基本原理與特點(三)分子標(biāo)記在植物遺傳育種研究上的應(yīng)用遺傳標(biāo)記的概念

遺傳標(biāo)記是指可以明確反映遺傳多態(tài)性的生物特征。在經(jīng)典遺傳學(xué)中，遺傳多態(tài)性是指等位基因的變異。在現(xiàn)代遺傳學(xué)中遺傳多態(tài)性是指基因組中任何座位上的相對差異。遺傳標(biāo)記可以幫助人們更好地研究生物的遺傳與變異規(guī)律。在遺傳學(xué)研究中遺傳標(biāo)記主要應(yīng)用于連鎖分析、基因定位、遺傳作圖及基因轉(zhuǎn)移等。在作物育種中通常將與育種目標(biāo)緊密連鎖的遺傳標(biāo)記用于對目標(biāo)性狀進行追蹤選擇。遺傳標(biāo)記的種類1.形態(tài)標(biāo)記：指那些能夠明確顯示遺傳多態(tài)性的外觀性狀，如株高、穗形、粒色等的相對差異。2.細胞學(xué)標(biāo)記：指能明確顯示遺傳多態(tài)性的細胞學(xué)特征。染色體的結(jié)構(gòu)和數(shù)量特征即常見的細胞學(xué)標(biāo)記，它們分別反映了染色體結(jié)構(gòu)上和數(shù)量上的遺傳多態(tài)性。3.蛋白質(zhì)標(biāo)記：是根據(jù)蛋白質(zhì)（酶蛋白）電泳譜帶的不同來顯示蛋白質(zhì)（酶蛋白）在遺傳上的多態(tài)性。4.DNA標(biāo)記：DNA分子標(biāo)記是DNA水平上遺傳多態(tài)性的直接反映。DNA分子標(biāo)記的優(yōu)點(1)直接以DNA的形式表現(xiàn)，在生物體內(nèi)的各個組織、各個發(fā)育時期都可檢測到，不受季節(jié)、環(huán)境限制；(2)數(shù)量極多，遍及整個基因組；(3)多態(tài)性高，并且自然存在許多的等位變異，不需專門創(chuàng)造特殊的變異材料；(4)表現(xiàn)“中性”，即不影響目標(biāo)性狀的表達，與不良性狀無必然的連鎖；(5)許多分子標(biāo)記為共顯性標(biāo)記，能鑒別出純合基因型和雜合基因型，提供完整的遺傳信息RFLP

RFLP（RestrictionFragmentLengthPolymorphism）即限制性片段長度多態(tài)性。這種多態(tài)性是由于限制性內(nèi)切酶酶切位點或位點間DNA區(qū)段發(fā)生突變引起的。RFLP標(biāo)記具有共顯性，信息完整、實驗結(jié)果穩(wěn)定可靠，重復(fù)性好的特點，特別適合于建立連鎖圖。但是，RFLP有以下不足：①對DNA多態(tài)性檢出的靈敏度不高，RFLP連鎖圖上還有很多大的空間區(qū)（gap）；②RFLP檢測步驟多、周期長、成本高，每次實驗檢測的位點少；③需用放射性同位素或非放射性物質(zhì)標(biāo)記探針，且探針的種屬特異性較強。RAPD

RAPD（RandomlyAmplifiedPolymorphicDNA）即隨機擴增多態(tài)性DNA。RAPD技術(shù)建立在PCR（PolymeraseChainReaction）技術(shù)基礎(chǔ)之上，它是利用一系列不同的寡聚核苷酸（通常為10堿基）為引物，對所研究的基因組DNA進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物通過PAGE或瓊脂糖凝膠電泳分離，經(jīng)EB染色或放射自顯影來檢測擴增產(chǎn)物DNA片段的多態(tài)性。這些擴增產(chǎn)物DNA片段的多態(tài)性反映了基因組相應(yīng)區(qū)域的DNA多態(tài)性。微衛(wèi)星標(biāo)記微衛(wèi)星（Microsatellite）是指以少數(shù)幾個核苷酸（多數(shù)為2～4個）為單位多次串連重復(fù)的DNA序列，也稱之為簡單序列重復(fù)（SimpleSequenceRepeats，SSR）或簡單序列長度多態(tài)性（SimplesequenceLengthPolymorphism，SSLP）。

微衛(wèi)星標(biāo)記的最大優(yōu)點在于它具有大量的等位差異，而這種變異在生物群體中是大量存在的，通過簡單的PCR反應(yīng)即可直接檢測到已知的特定染色體位點。它具有一般PCR操作簡單、快速、成本低的特點，又擁有RFLP穩(wěn)定可靠，特異性強和共顯性的優(yōu)點。但是，微衛(wèi)星標(biāo)記必須依賴測序設(shè)計引物，引物的開發(fā)比較困難，所需技術(shù)復(fù)雜，周期長，費用高，對大多數(shù)物種來說現(xiàn)已發(fā)表的引物數(shù)目相當(dāng)有限，難以滿足各方面的需要。AFLP

AFLP即擴增片段長度多態(tài)性。AFLP是RFLP與PCR相結(jié)合的一種分子標(biāo)記技術(shù)，其基本原理是對基因組DNA限制性酶切片段的選擇性擴增，擴增片段通過高分辨率的測序分析膠（變性聚丙烯酰胺凝膠）進行電泳分離檢測，DNA多態(tài)性即以擴增片段的長度和數(shù)量不同而被檢測出來。AFLP是RFLP和PCR有機結(jié)合產(chǎn)生的一種分子標(biāo)記技術(shù)，既有RFLP的可靠性，也具有PCR（如RAPD）的靈敏性，可產(chǎn)生豐富而穩(wěn)定的遺傳標(biāo)記，快速高效。但是，AFLP主要屬于顯性標(biāo)記，且操作比SSR和RAPD復(fù)雜，費用較高，還可能需要同位素或非同位素標(biāo)記引物。遺傳多樣性研究

基因型不同的品種，或不同親緣關(guān)系的物種，基因組內(nèi)核苷酸序列存在差異。當(dāng)使用同一隨機引物對不