香蕉枯萎病菌中毒素成分分析

香蕉枯萎病菌中毒素成分分析

由準(zhǔn)頭孢菌引起的白牙疾病是一種毀滅性疾病。該疾病分布在亞洲、非洲和印度洋的美國(guó)和其他香蕉產(chǎn)區(qū)，以及中國(guó)臺(tái)灣、廣東、廣東、福建和海南等地。國(guó)內(nèi)外對(duì)由尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)引起植物維管束枯萎,其病原菌可產(chǎn)生致病的毒素,對(duì)毒素的致病作用研究和毒素對(duì)抗病品種的篩選等方面的研究比較多。國(guó)內(nèi)尚未有關(guān)于香蕉枯萎病病原菌所產(chǎn)毒素成分分析的報(bào)道,我們提取了香蕉枯萎病菌4號(hào)小種的毒素,并進(jìn)一步對(duì)毒素進(jìn)行成分分析和生物測(cè)定,為研究寄主抗毒素機(jī)制及防治技術(shù)提供理論依據(jù),對(duì)加快抗病育種進(jìn)程有重要意義。1材料和方法1.1材料表面1.1.1試驗(yàn)中的蘑菇供試病菌分離自田間得病的香蕉植株,經(jīng)致病性測(cè)定對(duì)香蕉具致病力的4號(hào)生理小種。菌種貯藏在廣東海洋大學(xué)生物技術(shù)研究所。1.1.2香蕉組培苗的制備巴西蕉(感病品種)、8818(感病品種)、新北蕉(耐病品種)和廣粉一號(hào)(粉蕉,感病品種)的組培苗,供試香蕉苗為6葉期,根部洗凈并做傷根處理,香蕉組培苗均由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所提供。1.1.3試驗(yàn)種子1.2方法1.2.1提取毒素1.2.2高效液相色譜法(1)高效液相色譜分析。以商品鐮刀菌酸(FA,SIGMA公司)為標(biāo)樣,對(duì)毒素進(jìn)行高效液相色譜分析。儀器:Agilent-1100型高效液相色譜儀;在線真空脫氣機(jī);四元梯度泵;DAD二極陣列檢測(cè)器;自動(dòng)進(jìn)樣器;HP-A.09.01化學(xué)工作站;Grant×B14超聲波清洗器;0RIO-868酸度計(jì)。色譜柱:Hypersil-OPSC18柱5μm,200mm×4.6mm,I,d。色譜操作條件:流動(dòng)相--甲醇∶H2O(V/V)=85∶15;檢測(cè)器--熒光檢測(cè)器,激發(fā)波長(zhǎng)274nm,發(fā)射波長(zhǎng)460nm,進(jìn)樣量4μL。(2)色譜/質(zhì)譜(GC/MS)鑒定。利用日本島津公司QP2010型氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)毒素進(jìn)行成分分析。氣相色譜條件:安捷倫公司DB-5MS彈性石英毛細(xì)管色譜柱(30m×0.25mm×0.25μm);載氣:高純氦氣,純度99.999%;恒流模式:流動(dòng)速度為1mL·min-1;程序升溫:50℃保持1min,以3℃·min-1升至250℃,保持10min;進(jìn)樣口分流:分流比為40∶1,進(jìn)樣口溫度為220℃,接口溫度為250℃,進(jìn)樣量為1.0μL乙醚溶液(手動(dòng)式進(jìn)樣)。質(zhì)譜條件:EI電離源,電子能量70eV,光電倍增器管電壓200V,質(zhì)量掃描范圍33amu~40amu,全掃描方式,離子源溫度200℃。1.2.3香蕉苗病害活性測(cè)定主要有以下幾項(xiàng):1)毒素溶液的配制。用少量95%的乙醇溶解毒素粗結(jié)晶,然后用蒸餾水配制成所需濃度的毒素溶液(毒素溶液內(nèi)乙醇含量不能超過0.5%,預(yù)備實(shí)驗(yàn)證明乙醇含量低于0.5%的水溶液對(duì)香蕉幼苗及其他作物種子和幼苗生長(zhǎng)表現(xiàn)均無異常影響)。2)標(biāo)準(zhǔn)曲線。用商品FA準(zhǔn)確配制成濃度分別為20、40、60、80、100mg·mL-1的系列標(biāo)樣溶液,測(cè)定其D224nm,作出以濃度為縱坐標(biāo)、D224nm為橫坐標(biāo)的FA標(biāo)準(zhǔn)曲線。配制濃度分別為50、100、200mg·L-1的毒素溶液,測(cè)定其D224nm,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出該濃度毒素溶液中FA的含量,據(jù)此用商品FA配制成相應(yīng)等量FA濃度的溶液。3)毒素對(duì)香蕉苗致病力的比較。將根部處理的8818香蕉苗直接浸入40mL濃度分別為50、100、200mg·L-1的毒素溶液和商品FA溶液的組培瓶中,每瓶1株,每個(gè)處理設(shè)8株苗。4)毒素對(duì)不同品種香蕉苗的致病作用比較。將根部處理巴西蕉、8818、新北蕉和粉蕉(廣粉一號(hào))幼苗,直接浸入裝有40mL濃度為200mg·L-1毒素溶液中,每個(gè)處理5株幼苗。以0.5%乙醇水溶液為對(duì)照。(3)和(4)實(shí)驗(yàn)分別于12h觀察香蕉苗的萎蔫情況,按如下分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行調(diào)查,并計(jì)算病情指數(shù)。病級(jí)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如下:0級(jí)———無癥狀,1級(jí)———25%以下葉片黃化,2級(jí)———25%~50%葉片黃化,3級(jí)———50%~75%葉片黃化,4級(jí)———75%以上葉片黃化,5級(jí)———整個(gè)植株枯死。1.3關(guān)于顆粒特異性的測(cè)定1.3.1種子萌發(fā)率的測(cè)定分別配制100、250、500和1000mg·L-14個(gè)濃度的毒素溶液。試驗(yàn)方法參照田雪亮等的方法,將作物的種子置于30℃恒溫箱內(nèi)催芽,以種子露白2~3mm為宜,48h后測(cè)量各種作物的胚芽長(zhǎng),96h后統(tǒng)計(jì)各種作物的種子萌發(fā)率(胚根超過種子直徑記為萌發(fā))。以0.5%乙醇水溶液為對(duì)照,每個(gè)處理3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)100粒種子。1.3.2調(diào)查內(nèi)容和方法1.3.1中的作物,3~4葉期的幼苗,洗凈根部做傷根處理,分別浸入盛有30mL濃度為125、250和500mg·L-1的毒素溶液的三角瓶中,以0.5%的乙醇水溶液為對(duì)照,每個(gè)濃度、每種作物設(shè)3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)10株幼苗。處理96h后,觀察記錄幼苗失水萎蔫程度,調(diào)查危害程度,計(jì)算出病情指數(shù)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS軟件進(jìn)行方差分析,用LSD法檢驗(yàn)比較處理的差異顯著性。2結(jié)果與分析2.1gc/ms分析高效液相色譜分析商品FA標(biāo)樣和毒素的高效液相色譜吸收?qǐng)D譜分別見圖1和圖2。由圖1可知,商品FA在保留時(shí)間為5.546min處開始出現(xiàn)第1個(gè)吸收峰,然后分別在7.269min和9.501min出現(xiàn)第2和第3個(gè)吸收峰。由圖2可知,毒素在保留時(shí)間為5.557min、7.300min和9.556min處也有3個(gè)吸收峰,與標(biāo)樣出現(xiàn)吸收峰的保留時(shí)間非常接近,從而證明是一種提取的香蕉枯萎病菌的毒素的成分中含有FA。色譜/質(zhì)譜(GC/MS)鑒定GC/MS總離子流圖(圖3),掃描出來的毒素共有7個(gè)色譜峰,即有7種有機(jī)化合物。對(duì)這7個(gè)色譜峰進(jìn)行積分,獲得百分含量,分別為5.81%、5.94%、6.31%、2.80%、3.42%、73.34%、2.37%。由此看出,第6個(gè)峰所代表的有機(jī)化合物是毒素中的主要物質(zhì)成分。第6個(gè)峰的質(zhì)譜圖見圖4,經(jīng)計(jì)算機(jī)質(zhì)譜庫(kù)檢索,該峰所代表的有機(jī)化合物是鐮刀菌酸(FA),從而進(jìn)一步驗(yàn)證了高效液相色譜分析結(jié)果。從生物測(cè)定的結(jié)果也證明香蕉枯萎病菌產(chǎn)生的毒素與FA產(chǎn)生的萎蔫癥狀是一致的。另外,對(duì)其他6個(gè)峰也進(jìn)行了計(jì)算機(jī)質(zhì)譜庫(kù)檢索,第1個(gè)峰是Benzoicacid;第2個(gè)峰是Pyridine,3-butyl-;第3個(gè)峰是Propanedioicaicd,phenyl-;第4個(gè)峰是Undecanenitrile;第5個(gè)峰是2(3H)-Furanone;第7個(gè)峰是Dibutylphthalate。有關(guān)其他6個(gè)化合物的成分及其作用機(jī)理還需進(jìn)一步研究進(jìn)行驗(yàn)證。2.2fa溶液脅迫處理隨著毒素溶液和等量FA溶液濃度的增加,蕉苗的病情指數(shù)也隨著增高;相同處理時(shí)間,經(jīng)毒素溶液處理的香蕉苗病情指數(shù)均比其等量FA溶液處理的高,且香蕉苗出現(xiàn)萎蔫癥狀的時(shí)間比FA溶液處理的早(圖5)。如200mg·L-1的毒素溶液處理蕉苗,36h后蕉苗的葉片開始表現(xiàn)出卷縮枯萎癥狀,而FA溶液處理的蕉苗,則在48h后才開始出現(xiàn)。因此實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,毒素中FA是主要的致枯萎物質(zhì),但除此之外,還含有其他物質(zhì),這些物質(zhì)在毒素致枯萎過程中起到增效的作用,加速植株的枯萎死亡。2.3不同品種蕉苗對(duì)毒素敏感程度的差異用毒素溶液處理巴西蕉苗、8818蕉苗、新北蕉苗和廣粉一號(hào)蕉苗的結(jié)果表明,不同品種的蕉苗經(jīng)毒素溶液處理后均表現(xiàn)出香蕉枯萎病的典型癥狀,即植株出現(xiàn)葉片黃化、萎垂、根變褐色、莖倒垂,最后整株枯萎。但不同品種的蕉苗對(duì)毒素的敏感程度存在差異,由圖6可知,廣粉一號(hào)蕉苗對(duì)毒素最為敏感,浸苗12h后,便有部分葉片開始變黃、失水,部分細(xì)根開始變褐,其病情指數(shù)為6.67;而巴西蕉、8818和新北蕉都是處理60h后才表現(xiàn)出上述癥狀,病情指數(shù)分別為4.6、13.3和5.33。4個(gè)品種蕉苗都隨著處理時(shí)間的增加,其病情指數(shù)升高。結(jié)果說明毒素是導(dǎo)致本試驗(yàn)中蕉苗枯萎的主要作用因子,對(duì)不同品種蕉苗之間不存在選擇毒性。2.4毒素對(duì)適用于檢測(cè)炮點(diǎn)總發(fā)芽率和交叉率的影響毒素對(duì)不同科屬作物種子萌發(fā)的影響,結(jié)果表明毒素對(duì)各種供試其非寄主植物的種子萌發(fā)都具有顯著抑制作用(對(duì)黃瓜種子的萌發(fā)抑制相對(duì)較小),而且隨著毒素溶液濃度的增加,其抑制效果更明顯(表1)。例如當(dāng)毒素溶液的濃度為100mg·L-1時(shí),只有菜心和茄子對(duì)毒素比較敏感,茄子的發(fā)芽率為27.78%,與對(duì)照相比發(fā)芽率降低了57.62%;而毒素濃度增加至500mg·L-1時(shí),茄子的發(fā)芽率為0。濃度為250mg·L-1各種作物種子(黃瓜和黃豆除外)發(fā)芽率與對(duì)照的相比均差異顯著。不同種子對(duì)香蕉枯萎病菌毒素的敏程度差異較大(表1)。2.5黃瓜胚芽生長(zhǎng)的抑制作用經(jīng)不同濃度毒素溶液處理后,各科屬作物種子的胚芽生長(zhǎng)均受到不同程度的抑制,并隨毒素溶液濃度的增大,胚芽生長(zhǎng)受到的抑制作用也加強(qiáng)(表2)。如毒素溶液濃度為100mg·L-1時(shí),黃瓜胚芽長(zhǎng)為2.19cm,毒素濃度為1000mg·L-1時(shí),胚芽長(zhǎng)只有0.62cm。不同濃度毒素溶液處理后不同作物種子(100mg·L-1毒素溶液處理的黃豆和辣椒除外)胚芽長(zhǎng)與對(duì)照的相比均差異顯著。2.6對(duì)毒素的敏感性試驗(yàn)表明,不同濃度毒素溶液對(duì)不同科屬作物幼苗均有較強(qiáng)的致萎作用(圖7)。其中,白菜和黃豆對(duì)毒素溶液最敏感,125mg·L-1的毒素溶液處理96h后,其病情指數(shù)達(dá)到100,即幼苗全部萎蔫死亡。當(dāng)毒素溶液的濃度增加到500mg·L-1時(shí),經(jīng)浸苗處理96h后,除玉米外,其余作物幼苗的病情指數(shù)均達(dá)到100。3香蕉腐爛病菌毒素成分分析和致病性機(jī)制毒素是植物病原菌致病的主要物質(zhì)之一,植物病原菌往往產(chǎn)生多種致毒活性物質(zhì)適應(yīng)不同寄主的抗病性或同一寄主的不同抗病機(jī)制。Chu等認(rèn)為黃萎病菌致病可能不是單純的某個(gè)毒素蛋白致病因子或者某幾個(gè)毒素蛋白致病因子發(fā)揮作用,而可能存在一種相互作用過程。張芹先后從松針褐斑病菌的發(fā)酵液中分離獲得2種致萎活性物質(zhì)。劉云惠等經(jīng)液相色譜儀分析,表明玉米大斑病菌毒素共有7種組分,不同組分對(duì)不同玉米自交系葉片致病力存在明顯差異。薛春生等研究表明玉米灰斑病菌毒素對(duì)不同玉米自交系種子萌發(fā)和葉片致萎程度的影響有明顯差異,該毒素的化學(xué)成分主要為蛋白類物質(zhì)。本文通過高效液相色譜儀和氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)提取自FOC-4菌株的毒素進(jìn)行了成分分析,確定了鐮刀菌酸是該毒素的主要成分和主要的致病因子,本實(shí)驗(yàn)由于毒素提取量少和分離純化技術(shù)的限制,未對(duì)毒素的所有組分進(jìn)行分離純化和詳細(xì)的生物活性測(cè)定。實(shí)驗(yàn)使用Richard(pH=6)液體培養(yǎng)基培養(yǎng)15d,經(jīng)過乙酸乙酯萃取毒素的方法,得到了香蕉枯萎病菌的主成分———鐮刀菌酸,但是其他6種毒素的產(chǎn)生量極少。Richard(pH=6)液體培養(yǎng)基,有利于鐮刀菌酸的產(chǎn)生,乙酸乙酯是萃取鐮刀菌酸的最佳溶劑。因此,研究香蕉枯萎病菌毒素成分,有必要進(jìn)一步開展優(yōu)化香蕉枯萎病菌產(chǎn)生毒素培養(yǎng)基的研究,篩選出有利用產(chǎn)生其他種類毒素的最佳培養(yǎng)基。在毒素的提取中,使用不同極性有機(jī)溶劑的方法得到的萃取物或分離提純方法,利用高效液相色譜儀和氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀分析病原菌毒素成分,是一種準(zhǔn)確、有效分析毒素成分的方法。目前,關(guān)于毒素在香蕉枯萎病菌致病過程中的作用看法不一致。Morpurgo等研究表明,純毒素或毒素培養(yǎng)濾液對(duì)離體培養(yǎng)的香蕉抗病和感病品種的致病性雖有差異但不顯著,單用毒素?zé)o法區(qū)分香蕉的抗病和感病體系。Matsumoto等采用病原菌—毒素共培法,用獲得的毒素培養(yǎng)濾液處理莖尖分生組織,在一定濃度下可以區(qū)分抗病和感病品種。許文耀等對(duì)香蕉枯萎病菌1號(hào)小種和4號(hào)小種粗毒素培養(yǎng)濾液的特性進(jìn)行了初步研究,證明鐮刀菌酸是香蕉枯萎病菌粗毒素培養(yǎng)濾液中的主要致枯萎物質(zhì),除了鐮刀菌酸外,粗毒素培養(yǎng)濾液中可能還含有其它致病物質(zhì)的結(jié)果與本文的研究結(jié)果是一致的。王琪的研究結(jié)果表明:以果膠為碳源的培養(yǎng)液中,香蕉枯萎病菌致病作用主要是多聚半乳糖醛酸酶為主的一系列細(xì)胞壁降解酶,4號(hào)小種產(chǎn)生的細(xì)胞壁降解酶對(duì)粉蕉、巴西香蕉和大蕉假莖有明顯的浸解作用。不同生理小種產(chǎn)生的細(xì)胞降解酶對(duì)香蕉品種具有選擇性,其選擇性與病原菌是一致的。此外,病原菌的1號(hào)和4號(hào)小種在以柑桔果膠為碳源的培養(yǎng)液中產(chǎn)生分子量小于1ku的非糖類或多肽的毒素,對(duì)粉蕉有致病作用。王琪認(rèn)為:果膠成分可能是誘導(dǎo)FOC產(chǎn)生致病毒素的原因。4病害力及致病