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文檔簡介
基于pseudom縮影的chea基因在硫磷降解中的應用
微生物對環(huán)境污染物的分解效果不僅取決于分解能力本身,還取決于生物的適應性以及隨后的微生物和本土微生物之間的相互作用。細菌的趨化性(chemotaxis)是細菌響應環(huán)境化學物質梯度的移動,是細胞對碳源、能源競爭的一種表現。近幾年來,細菌趨化性與降解性之間的關系研究開始受到科研工作者的關注,許多研究表明細菌的趨化性和降解特性之間存在密切關系。趨化性可以使降解菌株有效地感應到污染物,增加污染物周圍的細菌密度,提高污染化合物的生物降解性。而且,趨化性可以增加細菌尋找合適碳源和氮源的機會,使細菌在有限碳、氮源環(huán)境中與土著微生物的競爭中表現出優(yōu)勢。趨化反應過程中負責信號轉導的相關基因相對保守,研究也比較成熟,在大腸桿菌(Escherichiacoli)、Salmonellaserovar、Pseudomonasaeruginosa、P.putida、Hizobiumleguminosarum和Rhodobactersphaeroides等菌屬中都進行了許多研究,其信號轉導的過程主要通過甲基酯酶(CheB)和甲基轉移酶(CheR)調節(jié)趨化受體蛋白(MCPs)(methyl-acceptingchemotaxisproteins)的甲基化來影響組氨酸激酶(CheA)的磷酸化,再來調節(jié)反應調節(jié)蛋白(CheY)的磷酸化,而CheY與鞭毛馬達開關結合,直接決定著鞭毛的旋轉方向。本文以本實驗室分離到的一株高效甲基對硫磷(MP)的降解菌株P.putidaDLL-1為研究對象,通過游動平板法,發(fā)現該菌株對MP同樣具有趨化性。通過基因打靶使DLL-1菌株中單拷貝的趨化信號轉導基因(cheA)失活,驗證該趨化突變株在土壤原位條件下對MP的降解能力的變化,研究趨化性和降解性之間的關系,闡明趨化性在農藥原位降解中的作用。1材料和方法1.1材料表面1.1.1蘑菇和顆粒本實驗中使用的菌株和質粒見表1。1.1.2藥物、試劑和儀器限制酶、堿性磷酸酶、T4DNA連接酶、LATaq酶購自TaKaRa公司,抗生素購自江蘇創(chuàng)瑞公司,DNA片段純化回收試劑盒購自Genbase公司,所用引物由TaKaRa公司合成,氣相色譜專用試劑均為色譜純,其他試劑均為分析純。80%的MP原藥購自浙江嘉化集團股份有限公司。氣相色譜型號為GC-14B。1.1.3配套藥物的添加①無機鹽、LB培養(yǎng)基配方見參考文獻;②LBM培養(yǎng)基:LB中加100μg/mL的MP;③SLB培養(yǎng)基:LB中添加5%的蔗糖。根據實驗需要再添加相應的抗生素,如:氨芐青霉素(Amp)為100μg/mL,卡那霉素(Km)為50μg/mL,鏈霉素(Str)為50μg/mL。④趨化培養(yǎng)基:每升含(NH4)2SO41.0g,K2HPO40.7g,KH2PO40.3g,MgSO40.2g,NaCl0.5g,pH7.0,瓊脂糖0.2%。⑤趨化緩沖液:40mmol/LK3PO4,0.05%甘油,10mmol/LEDTA,pH7.0。1.2細菌培養(yǎng)E.coli和P.putida分別于LB培養(yǎng)基中37℃和30℃培養(yǎng)。1.3dna的制備、純化細菌總DNA的制備、酶切、酶連、載體脫磷、E.coli普通感受態(tài)制備、轉化、質粒提取等操作方法見參考文獻;DNA的回收純化按照試劑盒說明書進行;DNA測序委托TaKaRa公司完成;實驗中所用的引物及PCR擴增條件列于表2。1.4cma和pmwd擴增參照模式菌株P.putidaKT2440的全基因組序列,根據保守序列設計擴增編碼組氨酸激酶磷酸化的基因(cheA)引物(表2),擴增目的條帶cheA。將擴增的cheA片段與pMD18-T載體連接獲得pMDA。以pSC123為模板,引物KF和KR擴增出含啟動子的Km抗性基因片段,兩端同時引入BglⅡ酶切位點,連接到pMD18-T載體上,命名為pMDK。XhoⅠ和BamHⅠ雙酶切pMDA,將2kb左右的cheA大部分片段連到同樣酶切的pWM91質粒載體上,轉化E.coliDH5αλpir獲得pWMA。用BglⅡ分別單酶切pWMA和pMDK,分別回收10kb的pWMA線性片段和1kb的Km片段,將Km片段連接到pWMA的BglⅡ酶切位點,獲得cheA片段中間插入Km基因的同源重組打靶載體pAK,最終將pAK轉入E.coliDH5αλpir。圖1為同源重組載體構建的具體路線。1.5菌株的制備和膜的制備將供體菌、受體菌、輔助菌在各自培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數中期,8000r/min離心回收菌體,用無菌水洗滌1次,濃縮后按1∶1∶1混合3種菌液于微孔濾膜(0.22μm)上,過濾除去濾液,置于不含抗生素的LB培養(yǎng)基上30℃培養(yǎng),24h后用無菌水洗下菌體,直接涂布于含100μg/mLAmp、50μg/mLKm和50μg/mLStr的LB平板上。1.6細菌趨化反應游動平板分析法(Swarmplateassay):取處于對數生長期的細菌培養(yǎng)液,收集菌體,用趨化緩沖液洗滌,懸浮于趨化緩沖液中,滴加10μL(約106個細胞)于以受試底物(100mg/kg的MP)為唯一碳源的趨化平板中央,培養(yǎng)一定時間,如果細菌對所測化合物產生趨化反應,就會在平板上形成很大的菌落圈。1.7培養(yǎng)液中od值的測定將兩個菌株分別培養(yǎng)至對數期,調節(jié)使OD600值一致,分別取1mL培養(yǎng)液接種于裝有等體積LB的三角瓶中,震蕩培養(yǎng),每隔一段時間取3mL培養(yǎng)液用分光光度法測定OD值。本試驗重復3次。1.8接種1d樣品的制備取菜園土,風干,過20目篩,100g滅菌與100g未滅菌土壤中各加入50mg/kg的MP。將菌株DLL-1與DAK分別培養(yǎng)至對數生長期,調節(jié)OD600值一致,用無菌水洗滌菌體1次。接菌處理中分別接種DLL-1與DAK菌體,接菌量盡量保持一致(通過平板計數確定),接種量控制在105~106個/g土,分別于12h、24h、36h、48h、3d和5d取樣測定農藥濃度。本試驗重復3次。MP的氣相色譜檢測:每個處理取10g土,加2倍體積的丙酮,劇烈震蕩3min,靜置過夜,取2mL揮發(fā)定容至1mL,去水相,過無水Na2SO4柱,收集流出的丙酮液體,氣相色譜檢測。2結果和分析2.1趨化圈的生長菌株DLL-1在100μg/mL的MP為唯一碳源的趨化培養(yǎng)基中顯示出明顯的趨化性,4h、36h、3d的趨化情況如圖2-A,4h時趨化圈不夠明顯,但肉眼可觀察到(照片顯示不出),通過圖2-B中數據顯示,隨著時間的延長,趨化圈也隨之增大。隨著趨化物濃度的升高,趨化圈隨之明顯擴大。當MP濃度達到500μg/mL時,趨化圈開始明顯減小,可能是高濃度的MP導致菌株出現負趨化。2.2同源重組單交換子的篩選成功地在菌株DLL-1染色體中擴出2.2kb左右目的條帶cheA片斷,測序結果表明該片段與KT2440中cheA基因同源性在99%以上。通過三親接合的方法將同源重組打靶載體pAK轉入到受體菌DLL-1中,因pAK為R6K復制位點不能在DLL-1中自主復制,在Str、Km和Amp三抗平板上篩選出來的即為同源重組單交換子。將同源重組單交換子在無抗生素的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜,稀釋涂布于含5%蔗糖的Str和Km平板(SLB)上,挑取能生長的具有雙重抗性的單菌落即為陽性同源重組雙交換子,即為cheA基因被Km抗性基因插入失活的突變株,命名為P.putidaDAK。2.3藥代動力學pcr擴增結果提取P.putidaDAK總DNA,分別用引物AF和KR、AF和KF、KF和AR擴增(圖3-A),擴增結果如圖4-B。由于引物AF和AR、KF和KR分別設計在cheA和Km基因片段上,因此,通過PCR擴增能夠確定Km基因是否插入到cheA位點。用引物AF和KR擴增出2.8kb左右的條帶,AF和KF沒有擴增出條帶,KF和AR擴增出1.4kb左右的條帶,PCR結果證明了Km基因確實插入到cheA基因位點。2.4dak對mp的趨化性圖4為野生菌株DLL-1和突變菌株DAK生長曲線。從圖中可以看出DAK中cheA基因突變后和DLL-1菌株在LB培養(yǎng)基中生長情況基本一致,表明Km基因插入到cheA位點對受體菌的生長速率沒有顯著影響。將趨化突變株DAK與野生株DLL-1按同等條件接種到含100mg/kgMP的無機鹽培養(yǎng)基中,每隔1h取樣,過氣相色譜檢測殘留的MP的量。結果顯示(圖5),野生和突變株在液體搖瓶中,對農藥的降解效率幾乎沒有差異,說明在動態(tài)環(huán)境中,菌體與趨化物充分接觸,對其降解能力影響不大。采用游動平板法驗證突變株DAK對MP的趨化性。圖6為12h、36h和3d對MP的趨化性,結果表明突變株DAK喪失了對MP的趨化性。菌株DAK中cheA基因的失活阻礙了組氨酸激酶的磷酸化,中斷了整個信號轉導過程,阻斷了鞭毛的運動,導致菌體不能游向趨化物,喪失了趨化性。2.5趨化突變株對mp的降解效率和降解速率的影響將趨化突變株DAK與野生株DLL-1按同等條件接種到含50mg/kgMP的未滅菌和滅菌的土壤中,每隔一定時間取樣,過氣相色譜柱檢測殘留的MP的量。結果顯示(圖7),DLL-1對MP的降解效果明顯,3d后幾乎全部降解了,而同等條件下,趨化突變株DAK和DLL-1相比,降解效率不如野生菌株快,在未滅菌土壤中,36h內其降解速率比原始菌株低約20%,在滅菌土壤中低約30%。農藥在滅菌的土壤中的降解速率低于未滅菌土壤,這跟土壤中存在的有機質含量以及其他菌群有關,有些土著微生物對農藥有一定的降解作用。以上表明在土壤中,菌株趨化性的喪失對MP的降解是有一定影響的。對于野生菌株而言,菌株的趨化特性對農藥的降解能力有促進作用,要想趨化突變株達到同樣的降解效果,必須加大施菌量。3生物可再生物酶系統的檢測細菌的趨化性在化學污染物的原位降解中發(fā)揮重要作用。Witt等最早在實驗室微宇宙系統中發(fā)現趨化性能促進細菌對沉積物中四氯甲烷污染物的生物修復。Marx等通過比較野生菌株P.putidaG7、趨化突變株和非游動菌株對萘的降解,發(fā)現野生菌株的降解速率最快,如果要同樣達到相同的降解效果,趨化突變株的細胞濃度要比高出幾倍。Pedit同樣證實了非趨化性菌株要達到趨化性菌株對萘相同的降解效果時,其數量也須高出幾倍。Lanfranconi等從汽油污染的土壤中分離到一株脂肪烴降解菌Flavimonasoryzihabitans,該菌對分離源土壤中存在的十六烷烴等鏈烷烴具有趨化性,結果表明趨化性在污染物的降解過程中有重要作用,有利于降解菌株與底物之間的接觸,增強生物降解效果。Ortega-Calvo等首次評價了根圈中多環(huán)芳烴(萘、菲、蒽及芘)降解菌的趨化性在污染物植物修復系統中的作用。他們在煤炭和石油污染的土壤中分離了20余株多環(huán)芳烴趨化性降解菌株,研究發(fā)現細菌的趨化性使根圈中降解性細菌數量增加,提高了污染物的生物可利用性,促進了根圈中多環(huán)芳烴的降解。P.putidaDLL-1能以MP為唯一碳源、氮源生長,通過游動平板法發(fā)現該菌株對MP表現出很強的趨化性,隨著農藥濃度的增加,趨化能力也增強
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