《大學化學教學》12 分光光度法

儀器

可見分光光度計1整理課件2整理課件

第十二章可見分光光度法和

分光光度法是根據(jù)物質的吸收光譜及光的吸收定律，對物質進行定性、定量分析的一種分析方法。分光光度法可見分光光度法（380-780nm）紫外分光光度法（10-380nm）（常用200-380nm）紅外分光光度法（780nm-3

105nm）重要特點：靈敏度高，適用于微量和痕量分析。相對誤差一般為2%—5%。紫外分光光度法3整理課件教學要求1.了解分光光度法的特點、原理和基本概念。

2.掌握Lambert-Beer定律的數(shù)學表達式，能熟練利用該式進行有關計算。3.了解分光光度法測定條件的選擇。4.了解分光光度法的誤差來源。5.掌握吸收曲線和標準曲線的繪制方法及其應用。6.掌握分光光度法的有關應用。7.熟悉分光光度計的主要組成部件及其作用。4整理課件§12.1物質的吸收光譜一、物質對光的選擇性吸收

當一束光照射到某物質或某溶液時，組成該物質的分子、原子或離子等粒子接受光的能量，使這些粒子中的電子由低能量的軌道躍遷到高能量軌道，也就是說：由基態(tài)轉變?yōu)榧ぐl(fā)態(tài)。M（基態(tài)）+hνM*（激發(fā)態(tài)）這個過程就是物質對光的吸收。

由于分子、離子或原子的能級是量子化的，只有光子的能量（hν）與被照射物質粒子的基態(tài)和激發(fā)態(tài)能量之差（ΔE）相等時，才能被吸收。5整理課件單色光復合光光的互補單一波長的光由不同波長的光組合而成的光若兩種不同顏色的單色光按一定的強度比例混合得到白光，那么就稱這兩種單色光為互補色光，這種現(xiàn)象稱為光的互補。藍黃紫紅綠紫黃綠綠藍橙紅藍綠單色光、復合光、光的互補6整理課件完全吸收完全透過吸收黃色光光譜示意物質的顏色與光的關系表觀現(xiàn)象示意復合光物質對光的吸收7整理課件二、物質的吸收光譜測量該溶液對不同波長(λ)的單色光的吸收程度，即吸光度A（absorbance）。

以波長λ為橫坐標，吸光度A為縱坐標作圖，可得一條曲線，即為吸收光譜或稱為吸收曲線。不同波長(λ)的單色光依次通過有色溶液波長λ1λ2λ3λ4吸光度A1A2A3A4圖12-2三（鄰二氮菲）合鐵（）離子的吸收光譜8整理課件

吸收光譜中，吸光度最大處的波長為最大吸收波長，用“

λmax

”表示。

若在最大吸收波長處測定吸光度，靈敏度最高。λmax是定性分析的依據(jù)；而溶液的濃度越大，吸光度A越大，是進行定量分析的依據(jù)。

圖中λmax為508nm，說明溶液最容易吸收的波長為508nm附近的光（綠色），所以溶液呈現(xiàn)綠色光的補色-紫紅色。9整理課件§12-2分光光度法基本原理一、透光率和吸光度均勻的有色溶液單色光IoIaItIr為反射光強度I0=Ia+It+Ir空白溶液被測溶液I0=Ia+It

加空白消除影響，上式可簡化為：Io為入射光強度Ia為吸收光強度It為透過光強度10整理課件

透射光的強度It與入射光的強度I0之比稱為透光率（transmittance）用符號“T”表示T

越大，溶液對光的吸收就越少；T

越小，溶液對光的吸收就越多。透光率的負對數(shù)稱為吸光度，用符號“A”表示。A越大，溶液對光的吸收就越多。11整理課件二、Lambert-Beer定律

Lambert定律：當一適當波長的單色光通過一固定濃度的溶液時，其吸光度與液層厚度成正比。A=k1b式中：b為液層厚度；

k1為比例系數(shù)。

Beer定律：當一適當波長的單色光通過一液層厚度固定的溶液時，其吸光度與溶液的濃度成正比。A=k2c式中：C為物質的量濃度或質量濃度；k2為比例系數(shù)。12整理課件將以上兩式合并得：A=εbc（Lambert-Beer定律數(shù)學表達式）

式中：b的單位為cm；c為物質的量濃度（mol/L）；

ε為摩爾吸光系數(shù)，單位為L·mol-1·cm-1。

若用質量濃度（g·L-1）代替物質的量濃度c，Lambert-Beer定律可表示為：A=ab

式中：a為質量吸光系數(shù)，單位為L·g-1·cm-1。a和ε可以相互換算：εbc=ab

εc=a

ε=a×/c=aM13整理課件

比吸光系數(shù)：是指100mL溶液中含被測物質1g，液層厚度b為1cm時的吸光系數(shù)值，用表示。

如果溶液中同時存在兩種或兩種以上對光有吸收的物質，在同一波長下只要共存物質不相互影響，也就是說，不因共存物的存在而改變本身的吸光系數(shù)，則總吸光度是各共存物的吸光度之和。A=Aa+Ab+Ac+····14整理課件

例12-1已知某化合物的相對分子質量為251，將此化合物用乙醇作溶劑配成濃度為0.150mmol/L的溶液，在480nm波長處用2.00cm吸收池，測得透光率為39.8%，求該化合物在上述條件下的摩爾吸光系數(shù)ε及質量吸光系數(shù)a。解：有Lambert-Beer定律可得：已知：c=0.150×10-3mol/L，b=2.00cm，T=0.39815整理課件例12-2測試酶與腺苷酸（AMP）體系的吸光度如下：

A（280nm）

=0.46，A（260nm）=0.58

試計算每一組分的濃度？已知：酶的ε（280nm）=2.96×104L·mol-1·cm-1ε（260nm）=1.52×104L·mol-1·cm-1AMP的ε（280nm）=2.4×103L·mol-1·cm-1ε（260nm）=1.5×104L·mol-1·cm-1吸收池厚度為1.00cm。16整理課件

解：設酶和腺苷酸（AMP）的濃度分別為y和z，因吸收光的加和性λ為260nm0.58=1.52×104L·mol-1·cm-1×1.00cm×y+1.5×104L·mol-1·cm-1×1.00cm×zλ為280nm0.46=2.96×104L·mol-1·cm-1×1.00cm×y+2.4×103L·mol-1·cm-1×1.00cm×z解方程組得：y=1.4×105mol/L；（酶的濃度）

z=2.5×105mol/L（AMP的濃度）17整理課件0.575光源單色器吸收池檢測器顯示光譜法儀器——分光光度計基本組成部分：輻射源/光源(source)單色器(monochromator)檢測器(detector)§12.3可見分光光度法18整理課件標準曲線法(校準曲線，工作曲線法，外標法）01.02.03.04.0c(mg/mL)A。。。。*0.800.600.400.200.00Axcx標準系列未知樣品二、測定方法19整理課件標準對照法未知樣品標準樣品20整理課件（三）比吸光系數(shù)比較法

比