快速檢測(cè)牛奶中氯霉素殘留的方法

快速檢測(cè)牛奶中氯霉素殘留的方法

氯霉素（cap）是一種有效的光譜抗生素，對(duì)各種疾病都有很強(qiáng)的抑制作用。這曾經(jīng)是中國(guó)常見(jiàn)的抗菌藥物之一。然而，氯霉素有嚴(yán)重的毒副作用，可能會(huì)導(dǎo)致人類的再生障礙貧血、顆粒細(xì)胞貧血、新生兒優(yōu)先性灰燼綜合征、新生兒、早產(chǎn)兒灰燼綜合征等。中國(guó)農(nóng)業(yè)部禁止使用這種藥物。無(wú)論出于何種原因，氯仿殘留都是一個(gè)必要的項(xiàng)目。然而，中國(guó)一些農(nóng)戶使用氯霉素治療鳥類和牛病，對(duì)人類健康構(gòu)成了重大威脅。為了確保人民的健康，擴(kuò)大與世界各國(guó)的食品貿(mào)易往來(lái)，我們必須建立靈活、特異性強(qiáng)、簡(jiǎn)單、快速的測(cè)定方法，并監(jiān)控喂食中氯霉素的殘留。目前,關(guān)于氯霉素的檢測(cè)方法國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道的主要有酶免疫法、放射免疫法、高效液相色譜法、氣相色譜法和微生物法.酶免疫法具有簡(jiǎn)單、快速、處理樣品量大、靈敏度較高、特異性強(qiáng)等諸多優(yōu)點(diǎn),現(xiàn)已有試劑盒供應(yīng)市場(chǎng),可以直接用于生產(chǎn)實(shí)踐,但若用于大規(guī)模檢測(cè)則成本太高.放射免疫法因使用放射性物質(zhì),給操作過(guò)程帶來(lái)諸多不便,已不再使用.高效液相色譜法雖然操作簡(jiǎn)單,但最低檢測(cè)限較高,無(wú)法滿足當(dāng)前對(duì)氯霉素低殘留限量的檢測(cè)要求.氣相色譜法靈敏度較高,但樣品前處理過(guò)程復(fù)雜、分析速度慢、儀器化程度高且價(jià)格昂貴,不適合在基層推廣使用.常用的微生物檢測(cè)法包括試紙法、棉簽法、發(fā)酵法等,筆者實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,快速檢測(cè)試紙法具有簡(jiǎn)單、快速、重復(fù)性較好等特點(diǎn),適用于大量樣品的殘留檢測(cè).1設(shè)備和材料1.1儀器、藥品和儀器AB204-N電子秤(Mettler-toledoGroup),LDZX-40BI型立式自動(dòng)電熱壓力蒸氣滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠),超凈工作臺(tái)(蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司HX-840),定量取樣槍(eppendorf),快速混勻器(國(guó)華電器有限公司),生化培養(yǎng)箱(國(guó)華電器有限公司).1.2主要試劑和儀器氯霉素快速檢測(cè)試紙(大連普瑞康生物技術(shù)公司),氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品(美國(guó)SIGMA公司,含量不低于99.0%),牛肉膏(中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司),胰蛋白胨(中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司),酵母膏(北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司),葡萄糖(北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司),瓊脂粉(青島凍粉廠),pH試紙(pH5.5～9.0),NaOH(北京化學(xué)試劑公司),乳桿菌(寧廈大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院許崇波老師惠贈(zèng)),嗜熱鏈球菌(解放軍軍需大學(xué)分子細(xì)菌學(xué)研究室惠贈(zèng)),短小芽孢桿菌(筆者所在研究室保存).1.3實(shí)驗(yàn)材料2實(shí)驗(yàn)方法2.1快速檢測(cè)試卷法2.1.1氯霉素指示劑用量的確定將樣品及反應(yīng)孔做好對(duì)應(yīng)編號(hào).以小吸管在微量測(cè)試孔中依次加入2滴待測(cè)的樣品(用小吸管吸取時(shí),須將第1滴滴除,以防對(duì)結(jié)果的干擾).充分搖勻氯霉素指示劑,以新的滴管吸取氯霉素指示劑,滴去前2滴,加入1滴指示劑于待測(cè)樣品的測(cè)試孔.以手輕輕握住微孔,貼著桌面震蕩約5min使其混合均勻.在每個(gè)測(cè)試孔中放入試紙片(白色端在下),靜置10min后判讀結(jié)果(不要超過(guò)20min).2.1.2氯霉素質(zhì)量濃度C線(對(duì)照線)在上,T線(測(cè)試線)在下,如果T線比C線深,或一樣深,呈陰性反應(yīng),表示樣品中氯霉素質(zhì)量濃度低于3μg/L;如果T線比C線淡,呈陽(yáng)性反應(yīng),表示樣品中氯霉素質(zhì)量濃度高于3μg/L,氯霉素質(zhì)量濃度越高T線越淡;如果C線完全沒(méi)出現(xiàn),則表示測(cè)試失敗.測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表1.2.1.3氯霉素檢測(cè)精確配制0,1,2,3,4,5μg/L的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)液,用快速檢測(cè)試紙進(jìn)行檢測(cè).結(jié)果表明,ρ(氯霉素)≥3μg/L時(shí),T線均比C線淡,有較高的準(zhǔn)確性.用以上的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)液每樣做3個(gè)重復(fù)(在1d內(nèi)檢測(cè)3次),7d內(nèi)選擇3天進(jìn)行檢測(cè).在ρ(氯霉素)為4,5μg/L時(shí),T線均比C線淡;ρ(氯霉素)為3μg/L時(shí),批內(nèi)變異系數(shù)≤16%、批間變異系數(shù)≤21%,證明氯霉素快速檢測(cè)試紙有較高的準(zhǔn)確性和重復(fù)性.2.2調(diào)整ph精確配制0,1.5,2.0,4.5mg/L的氯霉素溶液,編號(hào)為1～4.稱取10g胰蛋白胨、1.5g牛肉膏、3g酵母膏、1g葡萄糖、17g瓊脂、1L水,調(diào)整pH7.8～8.0;配制培養(yǎng)基,倒平板,涂布接種高濃度短小芽孢桿菌,分別用棉簽蘸取4份奶樣(編號(hào)為5～8)及氯霉素溶液放置于涂滿短小芽孢桿菌的培養(yǎng)基中,37℃恒溫培養(yǎng)過(guò)夜,觀察是否在棉簽周圍出現(xiàn)邊緣整齊的抑菌環(huán),若有,則表明該液樣中有氯霉素存在.測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2.2.3牛奶中含有氯霉素的測(cè)定分別向三角瓶中加入100mL奶樣,先加熱至沸騰,再冷卻至42℃.以3%接種量接種乳桿菌及嗜熱鏈球菌,振蕩混勻,置于42℃恒溫箱中培養(yǎng)3h.分別移取10mL奶樣,加入0.5mL酚酞、20mL自來(lái)水,用0.1mol/L?NaOH滴定至變色.根據(jù)NaOH消耗量來(lái)確定牛奶中是否含有氯霉素,如果所消耗NaOH量小于50mL,則表明奶樣中含有氯霉素.測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3.3結(jié)果與討論3.1結(jié)果10份鮮奶中有1份T線比C線淡,呈陽(yáng)性;其他方法檢測(cè)結(jié)果也表明該奶樣中含有氯霉素,證明試紙法有較高的準(zhǔn)確性、適用性、可行性.3.2分析與討論3.2.1傳統(tǒng)微生物法三生物強(qiáng)化氯霉素快速檢測(cè)試紙需要干燥保存.試劑瓶要隨時(shí)確保蓋嚴(yán),并放于4℃冰箱中留待下次再用.測(cè)試環(huán)境溫度需高于20℃,且測(cè)試前需先將整套組成部分在室溫中回溫30min,以確保反應(yīng)的準(zhǔn)確性.確保整套組成部分不受污染.傳統(tǒng)的微生物法除棉簽法、發(fā)酵法外還有杯碟法、拭子法等,但所有傳統(tǒng)微生物法均存在一問(wèn)題,即容易出現(xiàn)假陽(yáng)性,因此,如使用此類方法,須采用專屬性菌種或在樣品前處理過(guò)程中加入青霉素、土霉素等抗生素以消除干擾影響.此外,一般的棉簽法實(shí)驗(yàn)所得抑菌環(huán)不明顯,邊緣模糊.筆者實(shí)驗(yàn)采用短小芽孢桿菌以及在培養(yǎng)基中加入少量葡萄糖,可以使抑菌環(huán)有較高的清晰度,而且邊緣整齊,能較準(zhǔn)確地判斷氯霉素的有無(wú).3.2.2檢測(cè)方法的確定在實(shí)際工作中,不可能也無(wú)必要對(duì)所有動(dòng)物性食品進(jìn)行各種復(fù)雜、昂貴、耗時(shí)的分析檢測(cè),為能快速確定動(dòng)物性食品中是否有氯霉素殘留,一般做法是遵循一定程序,按規(guī)范要求對(duì)被測(cè)產(chǎn)品進(jìn)行取樣、篩選檢測(cè),對(duì)篩選檢測(cè)為陽(yáng)性的樣品再用更精確的方法進(jìn)行定量鑒定.棉簽法和發(fā)酵法費(fèi)用小,但耗時(shí)長(zhǎng)(棉簽法至少需要3d,發(fā)酵法需要5h);它們受操作過(guò)程和實(shí)驗(yàn)環(huán)境的影響較大,變異系數(shù)較高,結(jié)果不準(zhǔn)確;它們的最低檢測(cè)限較高,容易造成氯霉素的漏檢,只適用于氯霉素殘留的定性檢測(cè).快速檢測(cè)試紙法檢測(cè)牛奶中氯霉素殘留,整個(gè)操作過(guò)程只須15min,能在幾小時(shí)內(nèi)檢測(cè)幾百至上千個(gè)樣品;不需要復(fù)雜的儀