丹頂鶴染色體鑒別及chd基因的序列克隆

丹頂鶴染色體鑒別及chd基因的序列克隆

性別是性繁殖物種最重要的特征。大多數(shù)雌性在生理、行為和生態(tài)方面是不同的。性別識(shí)別在全面了解和管理繁殖物種、繁殖和繁殖、群體結(jié)構(gòu)和群體遺傳分析方面發(fā)揮著重要作用。目前鳥類性別的鑒定主要依靠形態(tài)學(xué)方法,該方法在適用性、可靠性和應(yīng)用性上都有很大的局限性.以精原細(xì)胞檢測(cè)、繁殖行為觀察、染色體分析、胚胎細(xì)胞分選等方法進(jìn)行性別檢測(cè),在準(zhǔn)確性和可靠性方面較形態(tài)學(xué)方法有極大的優(yōu)勢(shì).但是,這些方法操作復(fù)雜,采樣困難,對(duì)操作人員的技術(shù)要求較高.鳥類的性染色體為ZW型,雄性為ZZ,雌性為ZW.1996年發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與W染色體連鎖的基因-CHD1基因(chromo-helicase-DNAbindinggene).隨后發(fā)現(xiàn),幾乎所有非平胸類鳥類都具有與W連鎖的CHD1W基因.這個(gè)基因的發(fā)現(xiàn)為鳥類性別分子鑒定提供了新的標(biāo)記.近年的發(fā)現(xiàn)表明,W-染色體上還有一連鎖基因-ATPA1W.但是,這兩個(gè)基因作為分子標(biāo)記的最大缺點(diǎn)在于其性別特異性不如哺乳動(dòng)物類SRY基因的特異性強(qiáng),現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)在一些物種的Z染色體上存在CHD同源基因,而且鳥類性別分化機(jī)制復(fù)雜,能否特異擴(kuò)增用于性別鑒定有待進(jìn)一步確證.RAPD方法可以在不了解物種的基因組結(jié)構(gòu)的情況下進(jìn)行多態(tài)性分析,具有樣品用量少、靈敏度高和檢測(cè)容易等優(yōu)點(diǎn),廣泛用于農(nóng)作物、畜禽品種及品系鑒定、品種和品系遺傳關(guān)系的確定,基因的定位、分離及構(gòu)建基因圖譜等研究.白頭鶴、白枕鶴、丹頂鶴屬于鶴形目、鶴科、鶴屬的3個(gè)不同種,是我國(guó)珍稀保護(hù)動(dòng)物,難以用形態(tài)學(xué)方法鑒定性別.目前鶴類的分子生物學(xué)研究報(bào)道甚少,而利用分子生物學(xué)方法進(jìn)行性別檢測(cè)未見報(bào)道.為了加強(qiáng)對(duì)這些珍稀鶴類的繁育和保護(hù)工作,我們根據(jù)現(xiàn)有資料和多次試驗(yàn)結(jié)果,選擇RAPD方法隨機(jī)擴(kuò)增出了幾種雌性鶴類共有的特異帶,較準(zhǔn)確地進(jìn)行了性別鑒定.同時(shí),利用CHD基因引物,從丹頂鶴雌性個(gè)體中擴(kuò)增出一條206bp的特異帶,并進(jìn)行了序列測(cè)定和分析.1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)材料丹頂鶴(雌雄兩對(duì))、白頭鶴(雌雄一對(duì))、白枕鶴(雌雄一對(duì))等血液樣品均取自成都動(dòng)物園,通過成體羽毛或行為特點(diǎn)已明確其性別.1.2pcr檢測(cè)chd基因片段的擴(kuò)增采用苯酚/氯仿抽提法.參照已發(fā)表文獻(xiàn)資料設(shè)計(jì)并合成兩條加聚體引物,分別命名為RAAV01和RAAV02.反應(yīng)在0.2mL離心管中進(jìn)行,總體積25μL,含DNA模板50ng,2.5μL10×buffer,dNTP0.2mmol/L,兩種引物各0.5μmol/L,1UTaqDNA聚合酶,并覆蓋適量石蠟油.反應(yīng)在MJReserchPTC-100型PCR儀上進(jìn)行:95℃預(yù)變性90s;94℃1min,37℃2min,72℃2min,循環(huán)38次后,37℃5min,72℃10min.CHD基因片段擴(kuò)增的引物設(shè)計(jì)參照已發(fā)表論文中的序列,分別為:CHD1:AGAAAAAGATGGTGTTAGAT(2945);CHD2:TTGAACTGTGAAAGGAACTC(3224);CHD3:TCCATCTCAGAAAGAAAAGGA(3468);CHD4:TCAGTAATTTAATGAGGTAGT(4104);CHD5:ATGGAACTTAAGAAGTGTTGT(2421);CHD6:CATAACTCCTTACCACATAT(CFR)(括弧內(nèi)為文獻(xiàn)中編號(hào)).設(shè)計(jì)的引物由大連寶生物工程公司合成.反應(yīng)在0.5mL離心管中進(jìn)行,總體積25μL,含DNA模板50ng,2.5μL10×buffer,dNTP0.2mmol/L,上下游引物各0.5μmol/L,1UTaqDNA聚合酶,并覆蓋適量石蠟油.反應(yīng)在MJReserchPTC-100型PCR儀上進(jìn)行:94℃預(yù)變性5min;94℃1min,54℃1min,72℃2min,循環(huán)35次后,72℃10min.特異DNA片段插入pUC18SmaI位點(diǎn),轉(zhuǎn)化EcoliDH-5α.測(cè)序反應(yīng)采用Sanger雙脫氧核苷酸鏈終止法,利用T7定序試劑盒在PhamarciaALFExpress全自動(dòng)測(cè)序儀上進(jìn)行.2結(jié)果與討論2.1pcr擴(kuò)增多態(tài)性dna以白頭鶴、白枕鶴、丹頂鶴各一對(duì)的血液中提取的DNA為模板,以RAAV01和RAAV02為引物,擴(kuò)增多態(tài)性DNA.結(jié)果如圖1,2所示.由圖1中可以看到,單獨(dú)的RAAV01和RAAV02擴(kuò)增,沒有性別特異的擴(kuò)增帶,而RAAV01和RAAV02同時(shí)擴(kuò)增則有一條約300bp的雌性特異帶.從圖2中可以看到,在鶴屬多個(gè)物種和丹頂鶴的不同個(gè)體中都擴(kuò)增出這條帶.2.2特異性帶的擴(kuò)增應(yīng)用相同的方法,對(duì)未知性別的丹頂鶴個(gè)體進(jìn)行了性別鑒定.其中一只丹頂鶴(腳環(huán)標(biāo)記為左)擴(kuò)增出相應(yīng)大小的特異帶,應(yīng)為雌性;另一只丹頂鶴(腳環(huán)標(biāo)記為右)沒有這條帶,應(yīng)為雄性.這一結(jié)果與后來(lái)繁殖行為驗(yàn)證完全吻合(圖2中的10和11道).利用RAAV01和RAAV02擴(kuò)增所得雌性特異帶具有怎樣的結(jié)構(gòu)與功能,我們正在進(jìn)行序列測(cè)定和進(jìn)一步研究.2.3+4在男性個(gè)體中的擴(kuò)增效果參照已知?jiǎng)游顲HD基因,設(shè)計(jì)合成6條引物.文獻(xiàn)資料表明,CHD1+2可以在雌雄個(gè)體中擴(kuò)增約300bp的帶;CHD3+4可以在雌性個(gè)體中擴(kuò)增出約600bp的特異帶;CHD1+6可以擴(kuò)增出210bp的雌性特異帶;CHD3+5可以擴(kuò)增出1kb的雌性特異帶.以丹頂鶴血液DNA為模板,CHD1+CHD6為引物,PCR擴(kuò)增得到與文獻(xiàn)一致的約210bp的雌性特異的DNA片段,將其命名為gruschd,而其他擴(kuò)增結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道不一致,這可能是不同物種間的差異所致.2.4丹頂皇皇明chd基因片段與其他物種的同源性比較回收gruschd片段,插入pUC18載體smaI位點(diǎn),克隆,測(cè)序.序列測(cè)定結(jié)果見圖3.利用美國(guó)國(guó)家生物信息中心(NCBI)的Blast程序和國(guó)際互聯(lián)網(wǎng),將丹頂鶴CHD基因片段序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)存儲(chǔ)的基因序列進(jìn)行同源性比較發(fā)現(xiàn),所得丹頂鶴CHD基因片段與其他物種CHD-W編碼區(qū)、內(nèi)含子和CHD-Z編碼區(qū)、內(nèi)含子都有很高的同源性(附表).(續(xù)附表)綜上所